ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

HOÀNG THỊ PHƢỢNG
Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH
SINH TRƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY SÂM CAU
(Curculigo orchioides Gaertn) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo:

Chính quy

Chuyên ngành:

Công nghệ Sinh học

Khoa:

CNSH - CNTP

Khóa học:

2011 – 2015

Thái Nguyên - 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

Sau 6 tháng thực tập tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Khoa Công nghệ Sinh
học và Công nghệ Thực phẩm đến nay em đã hoàn thành xong đề tài của mình. Để
đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà
trường, Ban chủ nhiệm khoa cùng các thầy cô giáo trong bộ môn đã tạo điều kiện
giúp đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc thầy giáo PGS.TS. Ngô Xuân Bình và ThS.
Nguyễn Thị Tình đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện
đề tài.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với những đóng góp và hướng dẫn quý
báu của Ks. Lã Văn Hiền trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn tới bạn bè và người thân đã động viên,
giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và
nghiên cứu.
Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh khỏi
những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn
để đề tài của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày 03 tháng 06 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Hoàng Thị Phượng

i


ii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1: Bảng tên hóa chất dùng trong thí nghiệm.................................................22
Bảng 3.2: Bảng tên thiết bị dùng trong thí nghiệm ...................................................22

khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) ...........................................................34
Hình 4.4: Ảnh chồi Sâm cau trên môi trường nền bổ sung BA 1,0 mg/l kết hợp
Kinetin ở các hàm lượng khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) ...................36
Hình 4.5: Ảnh chồi Sâm cau trên môi trường nền bổ sung BA 1,0 mg/l kết hợp
NAA ở các hàm lượng khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) ......................38
Hình 4.6: Ảnh rễ cây Sâm cau trên môi trường nền bổ sung IBA ở các hàm lượng
khác nhau(sau 30 ngày nuôi cấy) ............................................................40
Hình 4.7: Ảnh rễ cây Sâm cau trên môi trường nền bổ sung NAA ở các hàm lượng
khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) ...........................................................41

iii


iv
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

B1

:

Thiamin HCl

B2

:

Nicotinic acid

B5


:

Coeficient of Variation (Hệ số biến động)

DNA :

Deoxyribonucleic Acid

Đ/C

:

Đối chứng

GA3

:

Gibberellic Acid

IBA

:

β – Indol Butyric Acid

LSD

:


MỤC LỤC
PHẦN 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................2
1.3. Yêu cầu của đề tài ................................................................................................2
1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................................2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài ..............................................................................2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ...............................................................................................3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................4
2.1. Giới thiệu chung về cây Sâm cau .........................................................................4
2.1.1. Nguồn gốc .........................................................................................................4
2.1.2. Phân loại ............................................................................................................4
2.1.3. Đặc điểm hình thái học của Sâm cau ................................................................5
2.1.4. Giá trị dược liệu của Sâm cau ...........................................................................6
2.1.5. Phương pháp truyền thống nhân giống Sâm cau ............................................10
2.2. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật .........................10
2.2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật ......................................................10
2.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ............................................11
2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào ...................................12
2.3.1. Vật liệu nuôi cấy .............................................................................................12
2.3.2. Điều kiện nuôi cấy ..........................................................................................12
2.3.3. Môi trường dinh dưỡng ...................................................................................13
2.4. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật .....................................16
2.5. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Sâm cau bằng phương pháp nuôi cấy mô
trên thế giới và Việt Nam ..........................................................................................17
2.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................................17
2.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ..................................................................19

v



vi


vii
4.2. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng chất kích thích sinh trưởng đến khả năng
nhân nhanh chồi cây Sâm cau ...................................................................................33
4.2.1. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây
Sâm cau .....................................................................................................................33
4.2.2. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BA kết hợp Kinetin đến khả năng nhân
nhanh chồi cây Sâm cau ............................................................................................35
4.2.3. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng BA kết hợp NAA đến khả năng nhân
nhanh chồi cây Sâm cau ............................................................................................37
4.3. Kết quả ảnh hưởng của hàm loại Auxin đến khả năng ra rễ cây Sâm cau .........39
4.3.1. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng ra rễ cây Sâm cau.............. 39
4.3.2. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng ra rễ cây Sâm cau............ 39
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................42
5.1. Kết luận ..............................................................................................................42
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHAO

vii


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Sâm cau có nhiều tên như Ngải cau, Cô nốc lan, Tiên mao, với tên khoa học



3

- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số
liệu, trình bày một báo cáo tốt nghiệp.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp xây dựng phương pháp nhân nhanh giống
cây Sâm cau bằng phương pháp nuôi cấy mô, hoàn thiện quy trình nhân nhanh
giống Sâm cau bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, tạo ra số lượng giống Sâm cau
với số lượng lớn, chất lượng tốt, đồng đều phục vụ cho quy trình sản xuất.

3


4

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây Sâm cau
2.1.1. Nguồn gốc
Sâu cau đã được ghi nhận trong thực vật chỉ của một số nước từ rất lâu và ở
bậc phân loại loài. Theo một số tài liệu, Sâm cau phân bố Ấn Độ, Sri Lanka, Trung
Quốc, Nhật Bản, Úc, các nước Đông Nam Á như Việt Nam, Lào, Thái Lan,
Malaysia, v.v [22], [30], [31].
Ở Ấn Độ, Sâm cau được gọi với tên “Golden eye grass” hoặc “Black Musli”
Sâm cau là loài thân thảo, thân củ, kích thước nhỏ. Sâm cau có nguồn gốc ở vùng
rừng chịu bóng ở Châu Á. Cây sinh trưởng, phát triển tốt ở vùng đồng bằng nơi đất
màu mỡ, ẩm, từ độ cao tới 2300 m so với mặt nước biển và đặc biệt trên khe đá, đất
đá ong ẩm [40], [41], [61].

Orchiodes

4


5

2.1.3. Đặc điểm hình thái học của Sâm cau
- Đặc điểm của thân rễ
Sâm cau là cây thân thảo sống lâu năm
chiều cao khoảng 20 - 30 cm, có khi hơn. Thân
rễ mập, hình trụ dài, mọc thẳng, thóp lại ở hai
đầu chiều dài 2,5 - 5 cm, đường kính 1,0 - 4,5
cm, bề mặt bên ngoài màu nâu đen mang nhiều
rễ phụ có dạng giống thân rễ, bên trong có màu
kem; vị nhầy và hơi đắng [4], [52].

Hình 2.1. Cây Sâm cau

- Đặc điểm của lá
Lá mọc thành túm từ thân rễ xếp nếp và
có gân như lá cau, dài 15 - 45 cm, rộng 2,5 - 3
cm, gốc thuôn, đầu nhọn, hai mặt nhẵn gần
như cùng nhau, gân song song, bẹ lá to và dài;
cuống lá dài khoảng 10 cm [4], [52].
Hình 2.2. Lá Sâm cau [52]
- Đặc điểm của hoa
Cụm hoa mọc trên một cán ngắn ở kẽ lá,
mang 3 - 5 hoa nhỏ, màu vàng; lá bắc hình
trái xoan; đài 3 răng có lông, tràng 3 cánh

áp (tiền mãn kinh), bồi bổ, tráng dương, trị nam tinh lạnh, liệt dương, nữ lạnh tử
cung, chữa phong thấp, lưng lạnh đau, thần kinh suy nhược, bồi bổ cho người già,
phụ nữ sau sinh, chữa liệt dương do rối loạn thần kinh chức năng, chữa tiêu chảy.
Sâm cau được thu hoạch quanh năm, nhưng tốt nhất vào mùa thu, bộ phận thu
hoạch làm thuốc là thân, rễ mang về cạo sạch vỏ ngoài hoặc để nguyên ngâm nước
gạo để khử độc, rồi phơi hay sấy khô cất sử dụng dần [4].
Trên thị trường nước ta đang cho phép bán các chế phẩm có nguồn gốc Sâm
cau, chẳng hạn như chế phẩm “OCHUKIM” sử dụng hỗ trợ điều trị suy giảm chức
năng sinh lý cho nam giới, vô sinh, hiếm muộn do tinh lạnh, tinh loãng, ngăn ngừa
và chống lại những bất thường về tinh trùng, giúp bồi bổ sức khỏe, bổ thận tráng
dương, tăng cường sinh lực, giảm căng thẳng mệt mỏi, tăng khả năng làm việc trí óc
và chân tay của tập đoàn Tuệ Linh.
6


7

2.1.4.2. Thành phần hóa học và tác dụng dược lý
Thành phần hóa học của Sâm cau
Các nghiên cứu đã xác định được thành phần hóa học của Sâm cau gồm các
chất chính là glycosids, là những chất có hoạt tính dược học chủ yếu của dược liệu
Sâm cau. Các chất có hoạt tính trong củ Sâm cau được xác định gồm flavones,
glycosite, steroids, saponins, triterpenoids và các hợp chất khác trong cây đã được
báo cáo bởi các tác giả (Ajit 2012, Mistra et al. 1990, Nagesh 2008, Neema et al.
2010, Xu et al. 1992) [22], [40], [41], [61]. Cho đến nay đã có một số chỉ thị khác
nhau như các chất glycosides được sử dụng làm chất chuẩn góp phần nhận dạng
dược liệu Sâm cau [30]
Theo Wealth of India (1950) củ Sâm cau chứa đường tự do (7.56%), mucilage
(8.12%), hemicelluloses (12-15%), polysachharides (17.01%) [54]. Thành phần hóa
học của thân củ Sâm cau đã được công bố bởi nhiều tác giả, bao gồm các nhóm sau:

phân tích khác nhau thu thập tại tỉnh Quảng Đông từ 0,11% to 0,35% [37].
Một số hợp chất chính có trong dược liệu Sâm cau được thể hiện trong hình 2.5.

Hình 2.5: Một số hợp chất có trong dƣợc liệu Sâm cau [37]

8


9

Tác dụng dược lý của Sâm cau
Hoạt tính bảo vệ gan: Rao và cs (1996) đã cho thấy hoạt tính bảo vệ gan thỏ
chống lại độc tố rifampicin, thioacetamide, galactosomine, carbon tetrachlorite của
hoạt chất curculignin A và curculigol chiết tách từ Sâm cau [48]. Dịch chiết
methanol rễ Sâm cau cũng được phát hiện có tác dụng bảo vệ gan chuột [26].
Hoạt tính chống oxy hóa: Dịch chiết methanol rễ Sâm cau được phát hiện có
tác dụng chống oxy hóa ở chuột [57].
Hoạt tính điều hòa miễn dịch: Bafna và cs (2006) đã thử nghiệm dịch chiết
methamol Sâm cau trên chuột và nhận thấy tăng đáng kể kháng thể trong cơ thể khi
cơ thể nhiễm cyclophosphamide, phản ứng nhạy cảm ở dạng trị hoãn và các mức độ
tế bào máu trắng và phụ thuộc vào liều lượng [25].
Hoạt tính tăng cƣờng chức năng sinh lý: Nghiên cứu đã chứng tỏ dịch chiết
từ cồn có tác dụng kích thích sinh dục đáng kể thỏ đực qua các thông số theo dõi đã
được ghi nhận. Ngoài ra, tác dụng tích lũy số lượng tinh trùng in vitro tăng lên đáng
kể so với đối chứng sau 30 phút phản ứng [53]. Dịch chiết đông khô của cây cũng
cải thiện đáng kể hoạt động tình dục ở liều lượng 200 mg/kg trọng lượng cơ thể
[54]. Chauhan và Dixit (2008) đã khẳng định dịch chiết cồn ở liều lượng 100 mg/kg
trọng lượng chuột trắng có tác dụng tăng cường sinh tinh trùng và tăng cường chức
năng sinh lý ở chuột đực [29].
Hoạt tính kháng tiểu đƣờng: Cả dạng dịch chiết nước và cồn đều có hoạt

hơn. Sâm cau là loài cây sống rất khỏe, lá xanh tốt quanh năm vì thế có thể trồng
trong chậu làm cây cảnh. Nếu trồng trong đất, có thể trồng với khoảng cách 30 x 40
cm hoặc 30 x 50 cm [4].
2.2. Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô là thuật ngữ dùng để chỉ các quá trình nuôi cấy vô in vitro các bộ
phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả hai mục
đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các sản phẩm hóa sinh,
bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý…[8].
Nguyên tắc cơ bản của nhân giống vô tính là: Mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều
do nhiều đơn vị nhỏ là các tế bào tạo thành. Các tế bào đã phân hóa đều mang thông
tin có trong tế bào đầu tiên và là những tế bào độc lập, từ đó xây dựng lại toàn bộ cơ
thể [8].

10


11

2.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật
Năm 1902, lần đầu tiên nhà thực vật học người Đức Haberlandt đã đưa ra
quan niệm: “Mỗi tế bào bất kì (đã biệt hóa) của một cơ thể sinh vật đa bào đều có
khả năng tiềm tàng để có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh”.
Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì: “Tất cả mọi tế bào của một cơ thể
đều chứa bộ gene y hệt nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thể có tiềm năng
tổng hợp những kiểu protein - enzym giống hệt nhau và nếu được nuôi trong môi
trường thích hợp đều có thể phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng cho loài cụ
thể và ra hoa, kết trái bình thường. Khả năng đó của tế bào được gọi là tính toàn
năng của tế bào thực vật” [12].

Tế bào giãn

Tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là
kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực
vật xét đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật
một cách có định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ
sở tính toàn năng của tế bào thực vật [12].
2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào
2.3.1. Vật liệu nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho quá trình nhân giống in
vitro. Do đó, việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy thích hợp là cần thiết. Đối với cây Sâm
cau, vật liệu khởi đầu cho nhân giống vô tính in vitro có thể là chồi đỉnh, đỉnh sinh
trưởng, hoặc đoạn thân, rễ. Các vật liệu này cần được đảm bảo vô trùng trước khi
tiến hành nuôi cấy in vitro. Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay
là sử dụng các chất hóa học. Đối với các thí nghiệm nuôi cấy Sâm cau in vitro, tôi
sử chồi đỉnh đã qua khử trùng để phục vụ cho việc nhân giống in vitro.
2.3.2. Điều kiện nuôi cấy
Điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của tế bào và mô
trong quá trình nuôi cấy in vitro. Trong đó, ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm là ba điều
kiện có vai trò quan trọng nhất [12].
- Nhiệt độ: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và các quá
trình trao đổi chất trong nuôi cấy mô, nhiệt độ nuôi cấy thường giữ ổn định ở 25 27oC, nhiệt độ còn ảnh hưởng tới hoạt động của Auxin [18].
12


13



14

minh là không thể thiếu đối với sự phát triển của mô: Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, I, Bo, Co.
Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzyme [12].
- Các vitamin: Do các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy có khả năng tổng
hợp được hầu hết các vitamin nhưng không đủ về số lượng. Do đó, trong quá trình
nuôi cấy in vitro, các vitamin cần được sung vào môi trường với thích hợp. Đặc
biệt là các vitamin nhóm B như: B1, B2, B3, B5, B6. Trong đó, B1 được xem là
vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật [18].
Các vitamin được pha ở dạng dung dịch mẹ có cao từ 500 đến 1000 lần dung
dịch làm việc. Dung dịch vitamin dễ bị hỏng do nấm, khuẩn nhiễm tạp và dễ bị
phân hủy ở nhiệt độ cao, vì vậy cần bảo quản trong điều kiện lạnh dưới 0oC hoặc
chỉ pha chế trước khi sử dụng [12].
- Các chất điều hòa sinh trưởng: Trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực
vật, thành phần quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy mô là các chất điều hòa
sinh trưởng. Đó là yếu tố quan trọng nhất trong điều khiển sự phát sinh hình thái và
tái sinh các bộ phận của mẫu cấy để trở thành cây hoàn chỉnh. Hiệu quả sử dụng của
chất điều tiết sinh trưởng phụ thuộc vào: sử dụng, hoạt tính vốn có của chất điều
hòa sinh trưởng, mẫu nuôi cấy. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật các nhóm chất
điều hòa sinh trưởng thưởng thường sử dụng 3 nhóm chất chính là: Auxin,
Cytokinin, Gibberellin [18], [19].
+ Nhóm Auxin
Là chất kích thích sinh trưởng do Went và Thimann (1937) phát hiện, chủ yếu
kích thích sự giãn của tế bào làm tăng phân bào, sự hình thành mô sẹo và sự xuất
hiện rễ bất định. Bốn loại auxin được sử dụng trong nuôi cấy mô là: Indolylacetic
acid (IAA); Naphthyl acetic acid (NAA); 2,4-Dichlorphenoxy acetic acid (2,4-D);
Indol butyric acid (IBA).Trong đó IAA là auxin tự nhiên, NAA, IBA và 2,4-D là
các auxin nhân tạo. Các auxin nhân tạo thường có hoạt tính mạnh hơn, do cấu trúc
phân tử khá bền vững nên các auxin nhân tạo khó bị oxy hóa bởi các enzyme. IAA

Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của Cytokinin trong quá trình phân
chia tế bào cụ thể là Cytokinin điều khiển quá trình chuyển pha trong mitos và giữ
cho quá trình này diễn ra một cách bình thường. Cytokinin được tổng hợp bởi rễ và
hạt đang phát triển [1], [20].
+ Gibberellin
Hợp chất này có tác dụng kích thích sự giãn tế bào theo chiều dọc, giúp kéo
dài lóng đốt thân cây, phá ngủ của phôi, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi phụ.
15


16

Ngoài ra GA3 còn ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật và rút ngắn thời
gian sinh trưởng của cây [18].
- Aga: Đây cũng là một trong những thành phần có vai trò cung cấp dinh
dưỡng cho mô nuôi cấy. Đặc biệt, trong nuôi cấy tĩnh aga có tác dụng làm rắn hóa
môi trường nuôi cấy. Aga thường dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là từ 0,4 0,8% [12].
- pH: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất rõ đến khả năng duy trì trao đổi các
chất trong tế bào. Thông thường trong môi trường nuôi cấy pH thích hợp nhất là 5,6
- 5,8 [12].
2.4. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật
Theo PGS.TS. Ngô Xuân Bình và cs [1]: Trong nuôi cấy mô, tế bào gồm 5
giai đoạn sau:
- Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị
Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro.
Mục đích của giai đoạn này là phải tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa
vào nuôi cấy.
Mẫu đưa từ bên ngoài vào phải đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ
lệ sống cao, tốc độ sinh trưởng nhanh.
Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, và thời gian xử lý diệt