ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HẰNG

Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG
VÀ CHẤT HỮU CƠ TỰ NHIÊN ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH CHỒI
LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus roxburghii) BẰNG KỸ THUẬT IN VITRO

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Khoa

: CNSH - CNTP

Khoá học

: 2010 – 2014

Thái Nguyên, năm 2014




Giảng viên hướng dẫn: 1. PG S.TS Ngô Xuân Bình
2. ThS. Lê Thị Hảo

Thái Nguyên, năm 2014


LỜI CẢM ƠN
Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhịêm khoa
Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm em đã tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và chất hữu cơ tự
nhiên đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus
roxburghii) bằng kỹ thuật in vitro”.
Qua thời gian thực tập tại phòng nuôi cấy mô tại Bộ môn Công nghệ Tế
bào, Viện khoa học sự sống, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đến nay
em đã hoàn thành đề tài. Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin chân
thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa và các thầy cô Bộ môn
Công nghệ Tế bào, cùng các thầy cô giáo trong bộ môn đã tạo điều kiện giúp
đỡ em trong suốt thời gian qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS. Ngô Xuân
Bình và ThS. Lê Thị Hảo đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian
thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên,
giúp đỡ cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, ngày tháng năm 2014
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Hằng


Kinetin

: 6-Furfurylaminopurine

LSD

: Least Significant Difference

MS

: Murashige and Skoog

NAA

: Napthalene axetic Acid

TN

: Thí nghiệm

TDZ

: 1,2,3-Thiadiazol-5-yl

WPM

: Woody Plant Medium


DANH MỤC CÁC BẢNG

Kinetine (0,3 mg/l) và NAA (0,3 mg/l) kết hợp với nước dừa đến
khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) ......... 33
Hình 4.5. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5 mg/l),
Kinetine (0,3 mg/l) và NAA (0,3 mg/l) kết hợp với khoai tây đến
khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) ......... 35
Hình 4.6. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng BAP (1,5 mg/l),
Kinetine (0,3 mg/l) và NAA (0,3 mg/l) kết hợp với chuối xanh đến
khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 35 ngày nuôi cấy) ......... 37


MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1: MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
1.2. Mục đích của đề tài ............................................................................................ 1
1.3. Yêu cầu của đề tài .............................................................................................. 1
1.4. Ý nghĩa của đề tài .............................................................................................. 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3
2.1. Giới thiệu chung về cây lan Kim Tuyến .......................................................... 3
2.1.1. Phân loại thực vật .......................................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây lan Kim Tuyến ............................................ 3
2.1.3. Đặc điểm phân bố của Lan Kim Tuyến ........................................................ 4
2.1.4. Giá trị của lan Kim Tuyến.............................................................................. 5
2.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................................................ 6
2.2.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật......................................................... 6
2.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật ......................................... 7
2.2.3. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................. 8
2.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Lan Kim Tuyến trên thế giới và
trong nước ..................................................................................................... 14
2.3.1.Tình hình nghiên cứu nhân giống Lan Kim Tuyến trên thế giới................ 14
2.3.2. Tình hình nghiên cứu nhân giống Lan Kim Tuyến ở Việt Nam ............... 15

chuối xanh đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến ..................... 30
4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP 1,5 mg/l,
Kinetinen(0,3mg/l), NAA (0,3 mg/l) kết hợp với nước dừa đến khả
năng nhân nha nh chồi Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (sau
35 ngày nuôi cấy) ......................................................................................... 32
4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng lượng BAP 1,5 mg/l,
Kinetine (0,3 mg/l), NAA (0,3 mg/l) kết hợp với khoai tây đến khả
năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (sau
35 ngày nuôi cấy) ......................................................................................... 34
4.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP 1,5 mg/l,
Kinetine (0,3 mg/l), NAA (0,3 mg/l), kết hợp với chuối xanh đến khả
năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (sau
35 ngày nuôi cấy) ......................................................................................... 30
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 37
5.1. Kết luận ............................................................................................................ 37
5.2. Kiến nghị .......................................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 38


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Lan Kim Tuyến - Anoectochilus roxburghii (Wall.) thuộc họ Lan Orchidaceae, được phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh của Việt Nam [4]. Chi Lan
Kim Tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện thống kê được 12 loài, trong đó có
loài Lan Kim Tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall). Là một loại thảo dược
có giá trị dược liệu, Lan Kim Tuyến có khả năng chữa trị các bệnh ung thư,
chống tăng huyết áp, lưu thông khí huyết, kháng khuẩn, làm thuốc trị lao phổi,
ho do phế nhiệt, phong thấp, đau nhức xương khớp, viêm dạ dày mãn tính, viêm

Tuyến bằng phương pháp in vitro phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Giúp sinh viên tiếp cận được với công tác nghiên cứu khoa học, qua đó
nâng cao trình độ chuyên môn và tạo cho sinh viên có tác phong làm việc
nghiêm túc, sáng tạo.
- Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài góp phần bổ sung quy trình kỹ thuật nhân giống lan
Kim Tuyến nhằm cung cấp cây giống với số lượng lớn, có chất lượng đồng đều
đồng thời giữ được đặc tính di truyền của cây chọn lọc.
Bảo tồn được loại dược liệu quý đang có nguy cơ tuyệt chủng.


3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cây lan Kim Tuyến
2.1.1. Phân loại thực vật
Lan Kim Tuyến có tên khoa học là Anoectochilus roxburghii (Wall.) [4].
Giới (regnum)
: Plantae
Ngành (Phylum)
: Magnoliophyta
Lớp (Class)
: Liliospida
Bộ (ordo)
: Asparagales
Họ (Family)
: Orchidaceae
Chi (genus)
: Anoectochilus

+ Thân khí sinh: Thân khí sinh thường mọc thẳng đứng trên mặt đất, ít khi
mọc nghiêng. Chiều dài thân khí sinh từ 4-6 cm, trung bình 5,4cm. Đường kính
thân khí sinh từ 2,5-3,5 cm, trung bình là 2,98 cm. Thân khí sinh mang nhiều
lóng, các lóng có chiều dài khác nhau. Số lóng trên thân khí sinh thay đổi từ 2-4
lóng, trung bình là 3,6. Chiều dài mỗi lóng từ 1-4 cm, trung bình 1,52 cm. Thân
khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủ lông; thường có màu xanh trắng,
đôi khi có màu hồng nhạt [10] .
+ Lá: Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần
tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3-4 cm, trung bình là
4,03 cm và rộng từ 2-3 cm, trung bình là 3,12 cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên
và phủ lông mịn như nhung. Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân
gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi gân ở
giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi
rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá mặt dưới không rõ. Cuống lá
dài 0,6-1,2 cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá. Bẹ
lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2-6, thông thường có 4 lá. Kích
thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau
rõ rệt [10].
+ Hoa: Cụm hoa dài 10-15 cm, mang 4-10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình
trứng, hoa thường màu trắng, dài 2,5-3 cm, các mảnh bao hoa dài khoảng 6mm,
môi dài 1,5cm, ở mỗi bên gốc mang 6-8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu,
hốc chứa mật dài 7 mm, bầu dài 1,3 cm màu lục có nhiều lông mềm [4], [10].
2.1.3. Đặc điểm phân bố của Lan Kim Tuyến
- Phân bố theo kiểu rừng: Lan Kim Tuyến hầu hết phân bố ở rừng kín lá
rộng, rừng thường có cấu trúc 2 tầng cây gỗ [10].


5

- Phân bố theo trạng thái rừng: Đặc điểm của cây bụi và thảm tươi ở khu



6

kéo dài thời gian nhân giống. Hiện nay nhiều nước chủ yếu sản xuất cây Lan Kim
Tuyến từ nuôi cấy hạt in vitro. Trung Quốc, Đài Loan, Nhật bản đã trồng và xuất
khẩu Lan Kim Tuyến mang lại nguồn thu lớn.
- Giá trị dược liệu
Lan Kim Tuyến có rất nhiều tác dụng dược liệu do có chứa axit 4hydroxycinnamic, β-sitosterol, β-D-glucopyranoside, 3-glucosides butanoic axit,
kinsenoside nên được sử dụng trong điều trị bệnh [27].
Theo y học cổ truyền Đài Loan, Lan Kim Tuyến tươi hoặc khô nấu nước
uống trị các chứng bệnh đau ngực, đau bụng, viêm thận [20], [24], sốt, huyết áp
cao, liệt dương, rối loạn gan, lá lách, tim, phổi [15], [16], [24], [25]. Cây tươi sử
dụng để chữa các vết thương do rắn cắn [15], [27]. Dịch chiết Lan Kim tuyến có
khả năng kháng virus, kháng sưng viêm, bảo vệ gan và sử dụng để chữa các
bệnh về gan [23], [24], [18] chống khối u, ung thư và tính chống virus [17], điều
trị bệnh tim mạch, chống loãng xương, chống mệt mỏi [25].
Gần đây, một hợp chất 3(R)-3-β-D-glucopyranosyloxy butanolide tên
thương mại là kinsenoside được chiết xuất từ Lan Kim Tuyến có tác dụng chống
tăng huyết áp và bệnh tim mạch, tiểu đường [27]. Lan Kim Tuyến chứa các
nguyên tố vi lượng (Fe, Co, Cu, Mn, Zn, Cr) đóng vai trò quan trọng trong việc
chống lão hóa, chuỗi polysaccharide nâng cao hiệu lực của miễn dịch trong cơ
thể con người [18].
Cây Lan Kim Tuyến sau khi thu hoạch có thể xuất khẩu ở dạng thô, sản
phẩm gồm thân, rễ và lá phơi khô để chế biến trà dược, thực phẩm chức năng,
thạch Lan và đặc biệt là chiết xuất chất 3(R)-3-β-D-glucopyranosyloxy butanolide
từ Lan Kim Tuyến để sản xuất biệt dược kinsenoside [27].
2.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các

nhân giống vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu [13].
Tính toàn năng của tế bào là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy
mô tế bào thực vật. Hiện nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra
một cơ thể hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [6].
- Sự phân hóa và phản phân hóa
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào của
mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Ví dụ: Mô
dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làm nhiệm
vụ dự trữ, mô dẫn làm nhiệm vụ vận chuyển nước và chất dinh dưỡng [6].
Quá trình phân hoá tế bào được biểu diễn ở sơ đồ sau:
Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng
chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong


8

trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào
phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào,
ngược lại với sự phân hóa tế bào [13].
Phân hóa tế bào
Tế bào phôi sinh

Tế bào dãn

Tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa tế bào
Hình 2.1: Sơ đồ phản phân hóa tế bào
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa,

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như:
thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu
sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng
thích hợp với đa số các loài cây là 12-18 h/ngày. Cường độ ánh sáng tác động
đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy [12].
Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinh trưởng
của mô sẹo, ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi. Nhìn
chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000-7000lux (Morein,
1974), ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái
của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so
với ánh sáng trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế vươn cao
nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay, trong các
phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 20002500 lux, người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách bình nuôi cấy từ
35-40 cm [12].
+ Nhiệt độ
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh
hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc vào
xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt
độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của nhiều loài cây là 250C [12].
2.2.3.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
Môi trường dinh dưỡng có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cần thiết
cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thường của cây.
Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sự thành
công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi một loại vật liệu khác
nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắt đầu nghiên


10

cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đối tượng nghiên cứu

đường saccharose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế
cho saccharose nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu
của thực vật [13].


11

Ngoài ra, khi khử trùng môi trường cần chú ý không nên kéo dài thời gian
để tránh xảy ra hiện tượng caramen hóa làm cho môi trường chuyển sang màu
vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào.
- Các vitamin và axit amin
Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro
ở các loài khác nhau là khác nhau [13].
Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loại vitamin
cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu. Để mô có thể sinh trưởng, tốt nhất
phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loại vitamin và amino axít.
Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát
triển của thực vật. Vitamin B3 và B6 cũng có thể được bổ sung vào môi trường
nuôi cấy nhằm tăng cường sức sống cho mô [13].
- Các chất bổ sung
+ Nước dừa
Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô là Van
Overbeek và cộng sự (Van Overbeek cs, 1941) [23]. Sau đó, tác dụng tích cực
của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã được nhiều tác
giả ghi nhận. Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất
khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993) [17].
Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở
nhiều loại cây. Nước dừa thường được lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặc sau
bảo quản. Thông thường nước dừa thường được xử lý để loại trừ các protein, sau
đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh [17].

agar sẽ khó đông và cao hơn 6,0 sẽ làm môi trường bị cứng.
- Các chất điều tiết sinh trưởng:
Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính auxin và cytokinin,
ngoài ra còn có gibberlin và etylen cũng là nhóm chất tham gia điều tiết sự sinh
trưởng phát triển và phân hóa cơ quan.
+ Auxin
Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là IAA. IAA có tác
dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều kiển sự hình thành rễ. Ngoài
IAA, còn có các dẫn xuất của nó là NAA và 2,4-diclophenoxy axit (2,4 D). Các
chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá
trình hình thành rễ [1], [2], [6].


13

NAA được Went và Thimann (1937) phát hiện. NAA có vai trò quan
trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ. Kết quả nghiên cứu của Butenco (1964)
cho thấy NAA tác động ở mức độ phân tử trong tế bào theo ba cơ chế đó là cơ
chế thứ nhất: NAA gắn với phân tử enzyme và kích hoạt enzyme hoạt động.
Sarkissian đã phát hiện tác dụng của auxin kích thích hoạt tính của ATPase, cơ
chế thứ hai: Auxin tác động vào gen và các enzyme phân giải acid nucleic, cơ
chế thứ ba: Auxin tác động thông qua sự thay đổi tính thấm của màng. Dùng
phương pháp đánh dấu phân tử có thể thấy NAA kết dính vào màng tế bào làm
cho màng hoạt động như một bơm proton và bơm ra ngoài ion H+ làm màng tế
bào mềm và kéo dài ra do đó tê bào lớn lên và sinh trưởng. Trong tế bào, NAA
có tác dụng lên sự tổng hợp acid nucleic [3].
Trong cây, auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát
triển và vùng đỉnh chồi. Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần
phía dưới của cây.
+ Cytokinin

+ Gibberellin
Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người nhật
Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroi
gây ra. Năm 1939 đã tách chiết được gibberellin từ nấm G. Fujikuroi và được
gọi là gibberellin A. Gibberellin có tác dụng kéo dài tế bào, nhất là thân và lá vì
vậy khi xử lý với các cây đột biến lùn và các cây này có thể khôi phục lại bình
thường. Các nghiên cứu tiếp theo khám phá ra trong cơ thể thực vật cũng có các
chất giống như gibberellin cả về cấu tạo và tác dụng. Những chất này đặt tên
theo thứ tự là A1, A2, A3 và A4. Do gibberellin tồn tại trong thực vật, nó tham
gia vào các quá trình sinh trưởng và phát triển trong sự tương tác với các chất
điều hoà sinh trưởng khác [13].
Trong cây gibberellin được tổng hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau đó
được vận chuyển đi khắp nơi trong cây và có nhiều trong xylem.
2.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Lan Kim Tuyến trên thế giới
và trong nước
2.3.1.Tình hình nghiên cứu nhân giống Lan Kim Tuyến trên thế giới
Năm 2001, Yih-Juh Shiau và cs đã tiến hành phương pháp nhân giống hàng
loạt Anoectochilus formosanus Hayata bằng cách thụ phấn chéo và nuôi cấy hạt
nảy mầm. Sau khi thụ phấn số quả đậu đạt 86,7%. Những hạt 7 tuần tuổi được
nuôi cấy trên môi trường ½ MS bổ sung thêm 0,2% than hoạt tính và 8% chuối
trong 4 tháng. Cây nảy mầm được nuôi cấy ở môi trường ½ MS chứa BA 2 mg/l
trong bình nón 125 ml trong 2 tháng. Trước khi tiến hành thụ phấn trong ống
nghiệm, cây phải có thân rễ phát triển tốt và chồi được nuôi cấy trên môi trường ½
MS chứa 0,2% than hoạt tính, 8% chuối, BA 2 mg/l và NAA 0,5 mg/l [27].


15

Năm 2011, Lazarus Agus Sukamto và cs đã tìm ra môi trường nuôi cấy A.
setaceus tốt nhất với TDZ là 0,1 mg/l, A. formosanus với TDZ là 0,5 mg/l. Số lá

khử trùng và đưa vào các môi trường nền khác nhau (MS, Knud, Knudson). Sau


16

đó, các chồi và mắt đốt được chuyển sang môi trường nền thích hợp có bổ sung
BA, Kinetin, αNAA trong 4 tuần. Môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh thể
chồi và mắt đốt ngang thân là Knud + BAP 0,5 mg/l + Kinetin 0,3 mg/l + αNAA
0,3m g/l + sucrose 20 g/l + than hoạt tính 0,5 g/l + agar 7 g/l cho hệ số nhân chồi
là 6,55 chồi/mẫu. Các chồi có chiều cao từ 3-4 cm được sử dụng để ra rễ in vitro.
Tỷ lệ ra rễ là 100% và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) đạt cao nhất trên môi trường có
bổ sung αNAA 1 mg/l [11].


17

PHẦN 3
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu nuôi cấy là giống Lan Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghi)
đang trong giai đoạn nhân nhanh ở phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Tế
bào, Viện Khoa học Sự sống, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
3.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (Anoectochilus
roxburghii) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.
3.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu
3.2.1. Địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện khoa học Sự
sống, Đại học Nông LâmThái Nguyên.