TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
--------  -------

PHẠM THỊ NHÌ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH
NĂM GIỐNG CÚC (PHAN VÀNG, SAO ĐỎ,
ĐẠI ĐÓA, THẠCH BÍCH, VÀNG HÈ)
BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI - 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2


KHOA SINH - KTNN
--------  -------

PHẠM THỊ NHÌ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH
NĂM GIỐNG CÚC (PHAN VÀNG, SAO ĐỎ,
ĐẠI ĐÓA, THẠCH BÍCH, VÀNG HÈ)
BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học:

bằng kĩ thuật nuôi cấy mô” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do TS. La
Việt Hồng hướng dẫn và không trùng lặp với kết quả của các tác giả khác.
Hà Nội, ngày…..tháng 5 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Nhì


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Agar

Thạch

BAP

6 - Benzyl amino purin

IAA

Beta - Indole - acetic acid

IBA

Indode - 3 - Butyric acid

MS

Murashige and Skoog, 1962


1.3.2. Phương pháp nhân giống hoa cúc hiện đại/kĩ thuật nuôi cấy mô .. 5
1.4. Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc ............................................... 8
1.4.1. Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc trên thế giới ................... 8
1.4.2. Tình hình sản xuất và phát triển hoa cúc ở Việt Nam .................... 8
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 9
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ............................................................... 9
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 9
2.1.2. Trang thiết bị và dụng cụ ................................................................ 9
2.1.3. Môi trường nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật.... 9
2.1.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro .............................................................. 9
2.2. Thời gian, địa diểm .............................................................................. 10
2.3. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 10
2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm ..................................................... 10
2.3.2. Phương pháp xử lí số liệu thống kê .............................................. 11


Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 12
3.1. Tái sinh và nhân nhanh 5 giống hoa cúc bằng kĩ thuật nuôi cấy mô ... 12
3.1.1. Giống cúc Phan vàng .................................................................... 12
3.1.2. Giống cúc Sao đỏ .......................................................................... 16
3.1.3. Giống cúc Đại đóa ........................................................................ 20
3.1.4. Giống cúc Thạch bích ................................................................... 24
3.1.5. Giống cúc Vàng hè ........................................................................ 28
3.2. Ra rễ và tạo cây in vitro hoàn chỉnh..................................................... 33
3.3. Rèn luyện cây thích nghi với điều kiện tự nhiên ................................. 34
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 36
PHỤ LỤC




MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Hoa cúc (Chrysanthemum) là một trong số những loại hoa cắt cành và
hoa trồng chậu quan trọng nhất trên thế giới. Các giống hoa cúc thương mại
thường được nhân giống bằng cắt đốt hoặc cắt chồi bên [28].
Nhu cầu về hoa cúc ngày càng cao do đó phương pháp nhân giống cũng
liên tục được cải tiến nhằm tạo ra những giống cây với số lượng lớn, chất
lượng cao. Tuy nhiên phương pháp nhân giống bằng cách cắt chồi bên được
tiến hành trong thời gian dài, cây bố mẹ không được phục tráng… đã làm cho
giống bị suy thoái, cây dễ bị mắc bệnh làm giảm năng suất, chất lượng hoa.
Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học việc áp dụng phương pháp nuôi
cấy mô (in vitro) hoàn toàn có thể khắc phục được các nhược điểm trên. Ngày
nay, cả những nước phát triển cũng như một số vùng chuyên canh hoa ở Việt
Nam như Đà Lạt đã tiến hành sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để
tạo ra số lượng cây con lớn, đồng đều, chất lượng cao đáp ứng nhu cầu cây
giống [3].
Vườn hoa Mê Linh-Hà Nội là một trong những khu vực trồng hoa lớn
của cả nước với diện tích trên 500 ha [3]. Các loại hoa được trồng phổ biến tại
đây như: cúc, hồng, lily…Trong đó cây hoa cúc chiếm diện tích gần một nửa
đất trồng. Tuy nhiên cây cúc tại đây cũng không được quan tâm sử dụng
phương pháp hay kĩ thuật mới để nhân giống, sản xuất. Xuất phát từ những lí
do trên tôi đã lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài “Xây dựng quy trình
nhân nhanh năm giống cúc (Phan vàng, Sao đỏ, Đại đóa, Thạch bích và
Vàng hè) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô” nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống
5 giống cúc bằng kĩ thuật nuôi cấy mô để cung cấp giống cúc chất lượng cho

1



có hoa khoảng 500 năm TCN. Các giống hoa cúc đã được giới thiệu từ Trung
Quốc đến Nhật Bản trong thế kỉ thứ 8 SCN. Hà Lan dường như là quốc gia
đầu tiên ở Châu Âu nhập khẩu hoa cúc vào năm 1688 nhưng nó không thể
sống. Đến năm 1789, 3 giống được nhập khẩu vào Pháp từ Trung Quốc trong
đó chỉ có 1 giống sống sót và được trồng ở Anh năm 1975 và ở đó nó được
gọi là “ hoa cúc đẹp trai”. 8 giống sau đó được Anh nhập vào từ Trung Quốc
vào đầu thế kỉ 19 và nó tăng dần lên con số 48 giống vào năm 1826. Năm
1836, hoa cúc được đưa tới Tasmania từ Anh và đã được trồng ở New South
Wales, Australia năm 1843, nó cũng được đưa đến Victoria (Mĩ) vào năm
1855 và đến lượt New Zealan vào năm 1960 [20].
1.1.2. Đặc điểm của hoa cúc
Hoa cúc được biết đến như Gul-e-daudi hoặc là hoàng hậu của mùa thu.
Hoa Cúc thuộc họ cúc Asteraceae. Nó rất hấp dẫn, quyến rũ và là cây trồng
ngắn ngày, nó vừa thể hiện như là một cây trồng hàng năm cũng như hoa thảo
dược lâu năm. Chiều cao của cây hoa cúc dao động từ 40 - 60 (cm), các lá
mọc so le và có răng cưa, rễ chùm, và gốc là gỗ rắn. Những bông hoa cúc
thường nở vào đầu mùa đông với nhiều màu sắc, hình dạng và kích thước.
Màu sắc của hoa cúc trong phạm vi từ trắng và kem thông qua các sắc thái
của màu vàng, màu hồng, màu đồng, màu đỏ, tím đậm và xanh lá cây [10].
Hoa cúc có thể được trồng trên tất cả các loại đất, tuy nhiên những nơi
giàu ánh sáng, đất đai màu mỡ và thoát nước tốt là tốt nhất để canh tác chúng.
Độ pH lí tưởng của đất để canh tác hoa cúc là từ 6-7, và chúng phát triển

3


nhanh nhất trong điều kiện cường độ ánh sáng cao. Cúc được phân bố rộng rãi
ở Châu Âu, Châu Á, Châu Phi và Châu Mĩ. Trong số 200 loài được biết đến
của hoa cúc, một số loài thích hợp cho các khu vườn đá hay vùng cỏ mọc.
Hầu hết các giống hoa cúc Đại đóa ngày nay đều là kết quả của sự pha trộn

tính di truyền của cây đã bị thay đổi. Ngoài ra sự sinh trưởng và phát triển của
cây con lớn lên từ hạt là rất chậm và yếu do đó nhân giống vô tính là phương
pháp nhân giống quan trọng và duy nhất để tái tạo các loài thực vật có phẩm
chất mong muốn [29].
Cúc được nhân giống vô tính thông qua cắt chồi bên. Phương pháp này
được thực hiện đơn giản, dễ làm, cây giống tạo ra nhiều và giá rẻ. Tuy nhiên
do nhân giống vô tính trong một thời gian dài không được định kì phục tráng,
đã làm giảm năng suất và phẩm chất hoa nên chưa đáp ứng được nhu cầu thị
trường. Hơn nữa, việc nhân giống hiện nay chủ yếu bằng phương pháp giâm
cành nên hệ số nhân giống thấp, cây không sạch bệnh [3].
1.3.2. Phương pháp nhân giống hoa cúc hiện đại/kĩ thuật nuôi cấy mô
1.3.2.1. Trên thế giới
Tái sinh từ mô lá:
Nhân giống vô tính thông qua nuôi cấy mô in vitro có thể tăng cường
sự nhân lên nhiều lần [31]. Sự hình thành các chồi khỏe mạnh với hệ số nhân
nhanh cao là một trong những điều kiện tiên quyết để tăng hiệu quả kinh tế
mà nuôi cấy mô đem lại. Ngày nay có thể tạo được một số lượng lớn cây
trồng từ một mẫu cấy thông qua nuôi cấy mô trong ống nghiệm [11], [15].
Theo Bajaj et al., 1992, [11], Dejong et al. (1993), [15], cho rằng việc
nhân nhanh cúc in vitro từ lá giúp tái sinh chồi bất định không qua giai đoạn
mô sẹo trung gian.
Chen et al (1985), [13], đã tiến hành nuôi cấy lá non của 8 giống cúc
trên môi trường MS có bổ sung BAP từ 3-5 mg/l + NAA 2 mg/l và thấy rằng
nó tốt nhất cho búp cảm ứng.

5


Urban et al 1994, [39], đã tái sinh thành công chồi từ các mảnh lá của
giống cúc Iridon và Helka.

đốt thân trên môi trường cơ bản bổ sung 1,25mg/l NAA+ 1,25 mg/l BA.
Texixeira da Sival, (2003a,c) [36], [37] tiến hành nghiên cứu tái sinh
giống cúc D. grandiflorum ông nhận thấy: Tái sinh trên môi trường cơ bản bổ
sung 2-4 mg/l IAA hoặc 4 2,4- D hình thành phôi soma, từ 1-4 mg/l TDZ hình
thành mô sẹo, 1-2 mg/l IBA hoặc 2 mg/l NAA hình thành rễ, 1-2 mg/l BA
hình thành chồi.
Shatnawi. M và cs (2010) [33] đã nhân giống hoa cúc in vitro thành
công trên môi trường MS bổ sung 0,3 mg/l BAP.
1.3.2.2. Ở Việt Nam
Nguyễn Thị Diệu Hương, Dương Tấn Nhựt (2004) [6] khi nghiên cứu
hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống cây hoa cúc (Chrysanthemum indicum
L.) sạch bệnh bằng kĩ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong môi trường ½ MS
bổ sung BAP kết hợp với NAA, IAA, IBA theo sự biến thiên của các chất
kích thích sinh trưởng. Kết quả cho thấy trong môi trường ½ MS có bổ sung
NAA (0,2-0,5 mg/l), IBA (0,2-0,5mg/l) đều tạo rễ cho chồi cây hoa cúc tốt
hơn trong môi trường ½ MS có bổ sung IAA (0,2-0,5 mg/l).
Năm 2005, Dương Tấn Nhựt và cs [8] tiến hành thí nghiệm nuôi cấy
hoa cúc (Chrysanthemum sp.) trong các hộp nhựa tròn có đục lỗ và hộp không
đục lỗ. Kết quả cho thấy trọng lượng tươi và chiều cao cây trong 1 lỗ thoáng
khí cao hơn rõ ràng so với cây được cấy trong hộp không thoáng khí, có tỉ lệ
sống cao, sinh trưởng, phát triển tốt hơn khi ra vườn ươm.
Năm 2007, Trần Thị Thu Hiền và cs [4] đã nghiên cứu phương pháp
nhân giống hoa cúc CN97 bằng nuôi cấy mô tế bào đã đưa ra kết luận: môi
trường MS có bổ sung 0,5 mg/l NAA là môi trường ra rễ, tạo cây hoàn chỉnh
phù hợp nhất cho chồi cúc in vitro.
Năm 2014, La Việt Hồng và cs [5] đã hoàn thiện quy trình nhân giống hoa
cúc CN01 (Chrysanthemum maximum Seiun-3) bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro.

7



Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các giống cúc: Phan vàng, Sao đỏ, Đại đóa,Thạch bích, Vàng hè do
phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, khoa Sinh-KTNN, trường Đại học Sư
phạm Hà Nội 2 cung cấp.
2.1.2. Trang thiết bị và dụng cụ
Thiết bị: Cân kĩ thuật, tủ lạnh sâu, máy đo pH, nồi hấp khử trùng, máy
cất nước 2 lần, buồng cấy vô trùng, máy khuấy từ ra nhiệt, cân phân tích, tủ
ấm, Micropipet Jinson.
Dụng cụ: Cốc thủy tinh, ống falcon (loại 50ml), giấy báo, túi nilon,
dao, khay cấy, panh, kéo…
2.1.3. Môi trường nuôi cấy và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
- Môi trường sử dụng nuôi cấy là MS cải tiến (Murashige và Skoog,
1962) [26] gồm các khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin…thường được sử
dụng trong nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào thực vật (phụ lục).
- Các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng: BAP (6 - Benzyl amino
purin); NAA (Naphthalene acetic acid) của hãng Dulchefa, Hà Lan. Ngoài ra,
nghiên cứu còn sử dụng nước dừa trong một số thí nghiệm.
- Các thành phần khác: Đường saccharose: 30 g/l của công ty TNHH
Đức Lộc cung cấp, Agar: 7 g/l của công ty Long Hải cung cấp.
Môi trường được điều chỉnh về pH= 5,8 ± 0,05 (bằng NaOH 1N và HCl
1N) trước khi khử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 1170C, 1 atm trong 15 phút.
2.1.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro
Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tối.
Nhiệt độ: 25± 20C
Độ ẩm: 50-60%
Cường độ ánh sáng: 2000 lux.


10


* Thí nghiệm 5: Rèn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên:
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã chọn và tiến hành rèn luyện một trong
năm giống cúc giống cúc đó là cúc Đại đóa trực tiếp ngoài đồng ruộng, tiêu
chí đánh giá là tỉ lệ sống sót của cây con.
2.3.2. Phương pháp xử lí số liệu thống kê
Các số liệu được phân tích theo các tham số thống kê gồm giá trị trung
bình, độ lệch chuẩn…trên chương trình Exel 2007 theo mô tả của Nguyễn
Văn Mã và Cs, 2013 [7].
Sự sai khác giữa các công thức được kiểm định bằng giới hạn sai khác
nhỏ nhất LSD với α = 0,05.

11


Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tái sinh và nhân nhanh 5 giống hoa cúc bằng kĩ thuật nuôi cấy mô
3.1.1. Giống cúc Phan vàng

Hình 3.1.1. Quá trình tái sinh chồi in vitro từ đốt thân cúc Phan vàng sau
4 tuần nuôi cấy
(A). BAP 0,5 mg/l
(B). BAP 0,7 mg/l
(C). BAP 0,3 mg/l+10% ND
(D). BAP 0,5 mg/l+ NAA 0,04 mg/l

12



Hoại tử

kính

Thủy tinh
hóa

Hiệu quả của BAP
MS0 (ĐC)

1,66±0,58a

3,73±0,25c

X

Đều

Xanh-mập

-

-

-

BAP 0,3

3,66±0,58b


-

BAP 0,7

5,66±0,58d

2,46±0,06a

X

Đều

Xanh-mập

-

-

-

BAP 1,0

6,33±1,15e

2,60±0,20a

X

Đều

4,66±0,58a

2,26±0,06b

X

Không đều

Xanh-gầy

Đen/0,5cm

-

-

BAP 0,7 + 10% ND

6,33±0,58b

1,96±0,25a

X

Không đều

Xanh-gầy

Đen/0,5cm


2,56±0,12c

X

Đều

Xanh-mập

-

-

-

BAP 1,0 + NAA 0,02

8,33±0,58ab

2,00±0,10b

X

Đều

Xanh-mập

-

-


Đều

Xanh-mập

Đen/0,5 cm

-

-

BAP 1,0 + NAA 0,04

8,66±1,53d

1,60±0,10a

X

X

Đều

Xanh-mập

Đen/0,5cm

Với mỗi thí nghiệm, trong cùng một cột, ký tự theo sau khác nhau a, b, c… thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với α=0,05

14



3.1.2. Giống cúc Sao đỏ

Hình 3.1.2. Quá trình tái sinh chồi in vitro từ đốt thân cúc Sao đỏ sau 4
tuần nuôi cấy
(A). BAP 0,5 mg/l
(B). BAP 0,7 mg/l
(C). BAP 0,5 mg/l+10% ND
(D). BAP 0,5 mg/l + NAA 0,04 mg/l

16