BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y
---------------KHÁNH THỊ NHI

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U THỰC NGHIỆM
THUỐC TIÊM
LIPOSOME DOXORUBICIN

LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - NĂM 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y
----------------------KHÁNH THỊ NHI

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U THỰC NGHIỆM
THUỐC TIÊM
LIPOSOME DOXORUBICIN
Chuyên ngành : Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc
Mã số


đốc, phòng Sau đại học, các Thầy Cô Trung tâm Đào tạo Nghiên cứu Dược, Bộ
môn Sinh Lý Bệnh, Bộ môn Dược Lý - Học viện Quân Y đã tạo mọi điều kiện thuận
lợi cho tôi trong quá trinh học tập và nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu cùng các Thầy, Cô Bộ môn Bào chế Trường đại
học Dược Hà Nội, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện vệ sinh dịch tễ Trung
ương đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin được gửi lời cám ơn chân thành tới Trung tâm Y Tế Hoài Đức Hà Nội,
sở Y tế Hà Nội, các anh/chị đồng nghiệp, người thân trong gia đình và bạn bè đã
luôn động viên giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận án.
Ngày

tháng

năm 2017

Khánh Thị Nhi


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Ký hiệu viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
Chương 1..........................................................................................................3
TỔNG QUAN..................................................................................................3
1.1. Đại cương về doxorubicin.......................................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm hóa lý...............................................................................................................3

2.4.4. Phương pháp đánh giá tác dụng của liposome doxorubicin trên khối u động vật.........51
2.5. Phương pháp xử lý số liệu....................................................................................................55
2.6. Điều kiện thí nghiệm.............................................................................................................55
2.7. Địa điểm nghiên cứu.............................................................................................................55

Chương 3........................................................................................................56
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................................56
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng doxorubicin..................................................................56
3.1.1. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS.................................................................56
3.1.2. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao.........................................................................59
3.2. Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin.............................................................63
3.2.1. Bố trí thí nghiệm............................................................................................................63
3.3. Xây dựng qui trình bào chế liposome doxorubicin................................................................74
3.3.1. Bào chế liposome chưa mang dược chất.......................................................................74
3.4. Bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin............................................................................90
3.5. Đề xuất tiêu chuẩn và đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm liposome doxorubicin...............93


3.5.1. Đề xuất tiêu chuẩn.........................................................................................................94
3.5.2. Đánh giá độ ổn định.......................................................................................................95
3.6. Đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin trên khối u động vật thực nghiệm
...................................................................................................................................................100
3.6.1. Đánh giá trên chuột nhắt mang tế bào ung thư Sacoma TG 180.................................100
3.6.2. Đánh giá tác dụng trên khối u chuột thiếu hụt miễn dịch mang tế bào ung thư tiền liệt
tuyến.....................................................................................................................................106

Chương 4......................................................................................................109
BÀN LUẬN.................................................................................................109
4.1. Phương pháp bào chế liposome.........................................................................................109
4.1.1. Bào chế liposome chưa mang dược chất.....................................................................109


Từ/cụm từ đầy đủ
Acid Deoxyribonucleic

2

ARN

Acid ribonucleic

3

BP

Bristish Pharmacopoeia ( Dược điển Anh)

4

CHF

Congestive heart failure (Suy tim sung huyết )

5

CHL

Cholesterol


TT

Dược điển Việt Nam

11

DOPE

Dioleoylphosphatidyl ethanolamin

12

DDAB

Dimethyldioctadecylammonium bromid

13

DOX

Doxorubicin hydroclorid

14

DPPC

Dipalmitoylphosphatidylcholin

15

DPPE


Distearoyl phosphoethanolamin polyethylene glycol

21

DSPG

Distearoyl Phosphatidyl glycerol

22

EPC

Egg-derived phosphatidylcholin

23

EPG

Egg-derived phosphatidylglycerol

24

EurPh

European Pharmacopoeia ( Dược điển Châu Âu)

25

FDA


30

Viết tắt
HPLC

Từ/cụm từ đầy đủ
High-performance liquid chromatography (Sắc kí lỏng
hiệu năng cao)

31

KHV

Kính hiển vi

32

KTTP

Kích thước tiểu phân

33

LUV

Large unilamellar vesicle ( Liposome đơn lớp lớn)

34

LVEF

PC

Phosphatidyl cholin

40

PDI

polydispersity index (Chỉ số đa phân tán)

41

PEG

Polyethylenglycol

42

PI

Phosphatidyl inositol

43

PTFE

Polytetrafluoroethylene Teflon

44



TBUT

Tế bào ung thư

50

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

51

TEM

Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử
truyền qua)


TT
52

Viết tắt
TKHH

Từ/cụm từ đầy đủ
Tinh khiết hóa học

53



Một số phương pháp định lượng doxorubicin

4

1.2

Một số chế phẩm thuốc tiêm chứa doxorubicin trên thị trường

7

1.3

Phân loại liposome trên cơ sở kích thước và số lớp

14

1.4

Mốt số đặc tính của phospholipid dùng bào chế liposome

17


Bảng

Tên bảng

Trang


đo quang phổ hấp thụ UV-VIS

60

3.4

Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ doxorubicin

61

3.5

Độ lặp lại của phương pháp định lượng bằng HPLC

62

3.6

Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký

62

3.7

Kết quả khảo sát độ đúng

63

3.8


3.13

Kết quả đánh giá kích thước tiểu phân của các mẫu sau 4 tuần
bảo quản

72

3.14

Hiệu suất liposome hóa của các mẫu sau 4 tuần và mới bào


Bảng

Tên bảng

Trang

chế

73

3.15

Tỷ lệ giải phóng dược chất ( %) liposome DOX sau 4 tuần
bảo quản tại pH 7.4

74

3.16

83

3.21

Hiệu suất liposome hóa của doxorubicin ủ ở 50⁰C

85

3.22

Hiệu suất liposome hóa của doxorubicin ủ trong 30 phút

87

3.23

Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo phương pháp thẩm
tích 3 lần đệm HEPES

88

3.24

Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo số lần đổi đệm tiếp
tuyến

89

3.25


Trang

3.29

Theo dõi độ ổn định và một số chỉ tiêu của thuốc tiêm
liposome doxorubicin ở điều kiện dài hạn

99

3.30

Theo dõi độ ổn định và một số chỉ tiêu của thuốc tiêm
liposome doxorubicin ở điều kiện phòng thí nghiệm

101

3.31

Tỷ lệ chuột mang u dưới da sống sót sau 30 ngày

103

3.32

Thời gian sống trung bình chuột mang u dưới da sau 30 ngày

104

3.33


Các hệ đệm được sử dụng để bào chế hỗn dịch liposome
DOX

123

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Sự phân hủy doxorubicin trong môi trường acid

5

1.2

Cấu tạo vỏ liposome

13

1.3

Các loại liposome

14



59

3.2

Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ doxorubicin

61

3.3

Đồ thị biểu diễn các chỉ số PDI và Z-average hệ liposome của
các mẫu

70

3.4

Hình ảnh chụp TEM của liposome doxorubicin bào chế theo
công thức A3.2

71

3.5

Đồ thị so sánh các chỉ số PDI và Z-average của các mẫu
liposome sau 4 tuần và mới bào chế

73



3.11 Tỷ lệ chuột mang khối u dưới da sống sót sau 30 ngày

103

3.12 Thời gian sống trung bình chuột mang u dưới da sau 30 ngày

104

3.13

105

Khối lượng khối u dưới da của chuột sau 30 ngày


Hình

Tên hình

Trang

3.14 Thể tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày

106

3.15 Khối lượng khối u cơ trung bình của chuột sau 30 ngày

107


Từ những năm 50 của thế kỷ XX, doxorubicin (DOX) đã được phát hiện,
phân lập từ chủng vi khuẩn Streptomyces peucetius var. caesius và được ứng
dụng trong lâm sàng để điều trị bệnh ung thư. Hiện nay, doxorubicin có thể
được bán tổng hợp từ daunorubicin và được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên,
cũng giống như các thuốc điều trị ung thư thuộc nhóm kháng chuyển hóa
khác, doxorubicin có rất nhiều tác dụng không mong muốn, đặc biệt là độc
tính gây suy tủy, làm thiếu bạch cầu, giảm tiểu cầu, làm rối loạn nhịp tim và
có thể dẫn đến tử vong. Do đó, hiện nay, thuốc tác dụng tại đích để điều trị
bệnh ung thư là sự lựa chọn thích hợp để tăng cường hiệu quả của thuốc tại
các khối u và giảm độc tính ở các tế bào lành.
Một trong những hệ đưa thuốc tại đích đang được chú trọng phát triển
trong bào chế hiện đại là dạng thuốc liposome. Đây là dạng thuốc có nhiều ưu
điểm trong quá trình vận chuyển, phân bố, kiểm soát giải phóng và tăng sinh
khả dụng của dạng thuốc. Ưu điểm đặc biệt của liposome sử dụng trong điều
trị ung thư là các phân tử thuốc sẽ đi nhiều vào khối u, giải phóng thuốc và
hạn chế thuốc đến các mô lành. Nhờ sự phát triển của công nghệ nano, trên
thế giới đã có một vài hãng sản xuất nanoliposome doxorubicin và được ứng
dụng trong lâm sàng như các biệt dược: Doxil, Caelyx, LipoDox,…[41] với
nhiều cải tiến về mặt bào chế nhằm nâng cao sinh khả dụng và giảm độc tính.
Tuy nhiên ở Việt Nam, các nghiên cứu về liposome chưa nhiều, chưa
có chế phẩm nào được đưa vào sản xuất. Hiện nay, dạng bào chế liposome
đang được chú trọng phát triển và có tiềm năng lớn cho tương lai. Vì vậy
nghiên cứu liposome doxorubicin là vấn đề cấp thiết nhằm phát triển một thế
hệ thuốc mới cho ngành Dược Việt Nam.


2

Với lý do trên, đề tài luận án: “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác
dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm liposome doxorubicin” được tiến

oxy}-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)

-1-methoxy-5,12-naphthacen-dion[133].
1.1.1. Đặc điểm hóa lý
Tính chất: Ở điều kiện thường doxorubicin hydroclorid tồn tại dưới
dạng tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam, không mùi. Điểm nóng
chảy 230oC. Dung dịch 5mg/ml có pH từ 4-5,5. Hằng số phân ly pKa 1 = 7,34
(phenol); pKa2 = 8,46 (amin); pKa3 = 9,46 (ester). Tan trong nước (50 mg/ml
ở 25oC), methanol, acetonitril, tetrahydrofuran. Không tan trong cloroform,
aceton, ethyl ether, benzene, ether dầu hỏa [133]. Trong methanol hấp thụ ở
bước sóng 233, 252, 288, 479, 496, 529 nm. Dung dịch nước có màu vàng
cam với pH acid, màu đỏ da cam tại môi trường trung tính, và màu tím màu
xanh ở pH > 9. Với các đặc tính trên, có thể áp dụng định lượng doxorubicin
bằng phương pháp quang phổ UV-vis hoặc HPLC với detector tử ngoại hoặc
huỳnh quang [131] (bảng 1.1).


4

Bảng 1.1. Một số phương pháp định lượng doxorubicin
Phương pháp

Áp dụng

Tài liệu

định lượng
tham khảo
Đo quang ở bước sóng Đánh giá giải phóng dược chất từ [15],[79],[133].
234, 282, 285.



5

Hình 1.1. Sự phân hủy doxorubicin trong môi trường acid
*Nguồn: Theo Dominique M.M. (1986)[34]

Các chế phẩm dung dịch đậm đặc để pha dung dịch tiêm truyền trên thị
trường đều có pH 3,0-4,0; sử dụng acid hydrocloric để điều chỉnh pH.
Ảnh hưởng của nồng độ ion:
Sự ảnh hưởng của nồng độ ion tới tốc độ phân hủy DOX đã được
nghiên cứu. Dung dịch dược chất được điều chỉnh ở pH không đổi (1,25) và
thay đổi nồng độ ion bằng cách thêm natri clorid. Độ ổn định của dược chất tỷ
lệ căn bậc hai của cường độ ion (µ) trong khảng 0,14
Bảng 1.2. Một số chế phẩm thuốc tiêm chứa doxorubicin trên thị trường
Phân loại

Dạng bào chế
Dung dịch đậm
đặc để pha
truyền tĩnh
mạch

Dạng bào
chế chứa
DOX tự
do

Hàm lượng
10mg/5ml
Adorucin
50mg/25ml
10mg/5ml
Adriamycin
50mg/25ml
Adriblastina 10mg, 50mg

Nước sản xuất
Korea United
Pharma (Hàn Quốc)

Adrim
50mg/25ml
Doxorubicin 10mg/5ml,


Doxorubicin 10mg/5ml
DBL
50mg/25ml
Doxorubicin
10mg, 50mg
Servycal
Doxtie

10mg, 50 mg

Zodox

10mg, 50mg

Myocet

Caelyx
Hỗn dịch tiêm
chứa
PEGylated
liposome
doxorubicin
Hỗn dịch
liposome nhạy
cảm với nhiệt

Doxil
Lipodox


Doxorubicin hydroclorid không ổn định trong dạ dày và các nghiên cứu
trên động vật cho thấy thuốc hấp thu rất kém qua đường tiêu hóa. Ngoài ra,
thuốc rất khó được phân bố tới các mô qua đường uống, do đó thuốc được bào
chế dạng tiêm truyền tĩnh mạch. Doxorubicin được chuyển hóa bởi enzym
aldoketoreductases-NADPH thành chất chuyển hóa ưa nước doxorubicinol
13-hydroxyl có tác dụng chống ung thư và là chất chuyển hóa chính. Những
reductases có mặt trong hầu hết các tế bào, đặc biệt là trong hồng cầu, gan và
thận. Chất chuyển hóa khác không có tác dụng điều trị bao gồm các aglycon ít
tan trong nước, như doxorubicinon (adriamycinon) và 7-deoxy-doxorubicinon
(17-deoxy-adriamycinon). Các enzyme reductase chuyển doxorubicin thành
7-deoxyaglycon làm tăng tác dụng gây độc tế bào của thuốc vì nó tạo ra các
gốc hydroxyl gây tổn thương tế bào [133].
Do sự khác biệt về mặt bào chế, các chế phẩm chứa doxorubicin khác
nhau khi sử dụng cho các thông số dược động học khác nhau [141].
Với dung dịch truyền tĩnh mạch, đồ thị nồng độ trong huyết tương không
xuất hiện ở 3 pha tương ứng với thời gian bán thải là 12 phút; 3,3 giờ và 33
giờ. Thời gian bán thải tương đối dài của doxorubicin phản ánh việc phân bố
vào các mô của dược chất. Chỉ khoảng 33-50% dạng chuyển hóa tìm thấy
trong nước tiểu, mật và phân sau 5 ngày truyền tĩnh mạch. Phần còn lại của
dược chất và các sản phẩm chuyển hóa vẫn còn nằm lại trong các mô tại các
tổ chức của cơ thể. Với bệnh nhân ung thư, doxorubicin làm giảm
adriamycinol, một chất có độc tính. Quá trình này được xúc tác bởi enzym
aldoketoreductases-NADPH, được tìm thấy trong tất cả các mô và đóng vai
trò quan trọng để xác định dược động học của doxorubicin [28]. Thể tích phân
bố lớn (700 - 1100 L/m2), liên kết doxorubicin và chất chuyển hóa
doxorubicinol với protein huyết tương là 74-76% và không phụ thuộc vào
nồng độ của doxorubicin (> 2 µM).


9