BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y
---------------KHÁNH THỊ NHI

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TRÊN
KHỐI U THỰC NGHIỆM THUỐC TIÊMLIPOSOME
DOXORUBICIN

Chuyên ngành
CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC
Mã số : 62 72 04 02
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI- NĂM 2017


CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
HỌC VIỆN QUÂN Y

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Phạm Thị Minh Huệ
2. PGS.TS. Nguyễn Minh Chính

Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Thanh Hải
Trường Đại học Quốc Gia Hà Nội
Phản biện 2: PGS.TS. Trần Hữu Dũng
Trường Đại học Y Dược Huế
Phản biện 3: GS.TS. Võ Xuân Minh

DSPE–
PEG
DSPG
EPC
EPG
FDA
HEPES
HPC
HPI
HPLC
KHV
KTTP
LUV
MLV
MVV
PC

Từ/cụm từ đầy đủ
Acid deoxiribinucleic
Acid ribonucleic
Dược điển Anh (Bristish Pharmacopoeia)
Dược chất
Dược điển Việt Nam
Dioleoylphosphatidyl ethanolamin
Dimethyldioctadecylammonium bromid
Doxorubicin hydroclorid
Dipalmitoylphosphatidylcholin
1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin
1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serin
1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoric acid

UTTLT

Chỉ số đa phân tán (polydispersity index)
Polyethylenglycol
Phosphatidyl cholin dầu đậu tương(Soy phospatidyl cholin )
Liposome đơn lớp nhỏ (Small unilamellar vesicle)
Tiêu chuẩn cơ sở
Nhiệt chảy hoàn toàn
Nhiệt chảy lỏng (melting temperature)
Dược điển Mỹ (United State Pharmacopoeia)
Ung thư tiền liệt tuyến


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, thuốc tác dụng tại đích để điều trị bệnh ung thư là sự
lựa chọn thích hợp để tăng cường hiệu quả của thuốc tại các khối u
và giảm độc tính ở các tế bào lành. Một trong những hệ đưa thuốc tại
đích đang được chú trọng phát triển trong bào chế hiện đại là dạng
thuốc liposome. Ngoài các đặc điểm của dạng thuốc hướng đích,
liposome có ưu điểm lớn là tính tương hợp sinh học cao do có cấu tạo
là các phospholipid. Trên thế giới đã có một vài hãng sản xuất
nanoliposome doxorubicin và được ứng dụng trong lâm sàng như các
biệt dược: Doxil, Caelyx, LipoDox… với nhiều cải tiến về mặt bào
chế nhằm nâng cao sinh khả dụng và giảm độc tính.
Tuy nhiên ở Việt Nam, nghiên cứu về liposome chưa nhiều, chưa
có chế phẩm nào được đưa vào nhằm phát triển một thế hệ thuốc mới
cho ngành Dược Việt Nam. Hiện nay, dạng bào chế liposome đang
được chú trọng phát triển và có tiềm năng lớn cho tương lai. Vì vậy
nghiên cứu liposome doxorubicin là vấn đề cấp thiết.

tiếng Việt và 140 tài liệu tiếng Anh.
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Tổng quan của luận án đã cập nhật các vấn đề:
Về dược chất: Các tính chất hóa lý và độ ổn định của doxorubicin;
tác dụng dược lý, dược động học và các dạng bào chế đã lưu hành
trên thị trường của doxorubicin.
Liposome: khái niệm; phân loại liposome theo cấu trúc; sự phát
triển của công nghệ liposome nhằm tăng cường khả năng hướng đích
và kiểm soát giải phóng dược chất; thành phần cấu tạo của liposome;
phương pháp bào chế liposome; phương pháp đánh giá liposome.
Mô hình đánh giá tác dụng chống ung thư in vitro và invivo: tổng


3
quan được các mô hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới về loại
tế bào ung thư và động vật thí nghiệm, cách bố trí thí nghiệm, cách
xử lý số liệu và biện giải kết quả.

CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, ĐỐI
TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.1. Nguyên vật liệu
- Nguyên liệu: Doxorubicin hydroclorid (DOX) đạt tiêu chuẩn
Dược điển Mỹ USP 28. Phosphatydin cholin đậu tương (SPC) và
cholesterol (CHL) đạt tiêu chuẩn pha tiêm. Nguyên liệu, hóa chất
khác đạt tiêu chuẩn dược điển hoặc tiêu chuẩn nhà sản xuất (tùy theo
mục đích sử dụng).
- Thuốc đối chiếu: Dung dịch tiêm doxorubicin “Ebewe” của nhà
sản xuất Ebewe, Áo; hỗn dịch tiêm liposome doxorubicin- Lipodox
của hãng TTYBiopharm, Đài Loan.
- Động vật thí nghiệm:

mỏng trên thành bình cầu. Hydrat hóa lớp film bằng dung dịch đệm
citrat ở 50oC với ở tốc độ 80 vòng/phút trong 2h để tạo hỗn dịch
liposome.
- Giảm kích thước liposome tạo ra bằng siêu âm hoặc bằng thiết
bị nén nhiều lần qua màng polycarbonat có kích thước giảm dần từ
1000 nm đến 100nm.
*Đưa DOX vào liposome:
- Tạo chênh lệch pH hai bên màng liposome bằng cách điểu chỉnh
pH tới 7,4 bằng NaOH hoặc bằng cách đổi môi trường đệm citrat
thành đệm HEPES pH 7,4. Quá trình đổi đệm được tiến hành trên
thiết bị lọc tiếp tuyến hoặc thiết bị thẩm tích.


5
- Đưa DOX vào liposome: Sử dụng bể điều nhiệt nâng nhiệt độ
hỗn dịch liposome đã tạo chênh lệch pH lên 60 oC, hòa tan DOX vào
cho đạt nồng độ yêu cầu. Ủ trong thời gian nhất định để dược chất
khuếch tán vào bên trong liposome. Sau đó để mẫu trở về nhiệt độ
phòng và bảo quản ở nhiệt độ2-8oC.
2.3.1.2. Phương pháp bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin
Thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml được bào chế tương tự
như trên nhưng có kết hợp với biện pháp tiệt khuẩn phù hợp ở mỗi
công đoạn và pha chế trong điều kiện vô khuẩn.
2.3.2. Phương pháp đánh giá các đặc tính liposome doxorubicin
2.3.2.1. Đánh giá hình thức, kích thước tiểu phân (KTTP) và phân
bố KTTP
Hình thức: Đánh giá bằng cảm quan.
Cấu trúc: Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) với kỹ
thuật nhuộm soi âm bản và cắt siêu mỏng.
Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân: sử dụng

thái, cấu trúc tiểu phân, kích thước và phân bố kích thước tiểu phân,
hàm lượng doxorubicin.
2.3.3. Phương pháp đánh giá chất lượng thuốc tiêm liposome
doxorubicin
Với thuốc tiêm liposome doxorubicin, vẫn đánh giá toàn bộ các
chỉ tiêu giống như của liposome doxorubicin nhưng đánh giá thêm
các chỉ tiêu sau:
pH, độ vô khuẩn, nội độc tố vi khuẩn:Theo DĐVN IV


7
Độ ổn định của chế phẩm trong thời gian bảo quản: Đánh giá sự
thay đổi các chỉ tiêu của thuốc tiêm ở điều kiện bảo quản ở nhiệt độ
2-8oC và điều kiện phòng thí nghiệm sau 24 tháng.
2.3.4. Phương pháp đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome
doxorubicin trên khối u động vật
So sánh giữa các nhóm dùng thuốc: Nhóm chứng (dung dịch
NaCl 0,9 %); nhómnghiên cứu (hỗn dịch tiêm liposome doxorubicin
nghiên cứu); nhóm đối chiếu: hỗn dịch liposome(Lipodox) và thuốc
tiêm dung dịch doxorubicin tự do (EBEWE).
2.3.4.1. Trên chuột nhắt trắng
Tế bào: Sử dụng tế bào Sarcoma TG180. Số lượng tiêm là 5×105 tế
bào cho từng chuột để gây khối u cơ và u dưới da.
Chỉ tiêu đánh giá: Thời gian sống trung bình; thời gian sống thêm;
kích thước khối u.
2.3.4.2. Trên chuột thiếu hụt miễn dịch
Tế bào: Tế bào UTTTL người dòng PC-3 được tiêm lên chuột với
số lượng 107 tế bào / chuột.
Chỉ tiêu đánh giá: Kích thước khối u, trọng lượng chuột, thời gian
sống.

μg/ml- 100 μg/ml với 7 mẫu chuẩn doxorubicin pha trong pha động,
mỗi mẫu phân tích 6 lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả cho thấy có
sự tương quan tuyến tính của nồng độ doxorubicin và diện tích pic (y
= 35,665x + 8,9508;R² = 0,99875).
- Độ lặp lại: Pha độc lập 6 mẫu doxorubicin chuẩn với nồng độ
chính xác 25,5μg/ml, tiến hành chạy sắc ký. Kết quả khảo sát cho
thấy độ lặp lại cao, độ lệch chuẩn tương đối nhỏ (RSD=1,004%

60
60
21
21

mmol
0,256
0,256
0,155
0,155
0,054
0,054

SPC : CHL
mol:mol
49,7 : 50,3
49,7 : 50,3
69,5 : 30,5
69,5 : 30,5
89,3 : 10,7
89,3 : 10,7

DOX
mg
25
50
25
50
25
50

đồng nhất (PDI > 0,4). Kết quả chụp hiển vi điện tử cho thấy
liposome có cấu trúc đa lớp và đa khoang. Sau 1 tháng bảo quản, các
liposome tạo ra đều có sự suy giảm rõ rệt về khả năng mang thuốc
(EE chỉ còn dưới 50%), có hiện tượng sa lắng, tách lớp và kích thước
tiểu phân cũng tăng lên tới hàng ngàn nm. Như vậy, cần phải nghiên
cứu làm giảm KTTP cho liposome để tăng độ ổn định cũng như tăng
khả năng hướng đích.
Với các kết quả thu được, công thức 3.2 được sử dụng cho
nghiên cứu tiếp theo nhằm xây quy trình bào chế liposome tốt hơn.
3.3. Kết quả xây dựng quy trình bào chế liposome doxorubicin
3.3.1.Nghiên cứu tìm biện pháp giảm kích thước liposome
Nhằm tạo ra liposome có kích thước nhỏ và đồng nhất, nghiên
cứu làm giảm KTTP bằng siêu âm và nén qua màng:
Phương pháp siêu âm: Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu thiết bị
siêu âm, thời gian siêu âm đến kích thước tiểu phân. Kết quả thực
nghiệm cho thấy: Thiết bị siêu âm đũa (Labsonic) cho khả năng giảm
KTTP tốt hơn so với bể siêu âm (Wiseclean).Thời gian siêu âm tăng
sẽ làm KTTP giảm dần, hệ trở lên đồng nhất hơn. Tuy nhiên nếu thời
gian siêu âm quá dài thì hệ lại trở lên kém đồng nhất.
Với phương pháp siêu âm, lựa chọn thiết bị siêu âm đũa với tần số
30kHz, thời gian siêu âm 10 phút, thể tích siêu âm 10ml. Liposome


11
bảo chế theo phương pháp này cho kích thước khoảng 80 nm, PDI
đạt dưới 0,3.
Phương pháp nén qua màng: ép/ đùn 10 lần qua màng 400 nm rồi
nén tiếp 20 lần qua màng 100 nm đạt kích thước khoảng 150 nm, PDI
rất thấp (0,06) chứng tỏ hệ đồng nhất.
So sánh hình ảnh chụp TEM của liposome được giảm kích thước

- Siêu âm: Hỗn dịch liposome được chia thành các thể tích nhỏ
(10ml) và được siêu âm trong thời gian 10 phút bằng thiết bị
Labsonic.
- Sử dụng phương pháp đổi đệm HEPES pH 7,4 bằng lọc tiếp
tuyến để tạo chênh lệch pH qua màng.
- DOX được phối hợp vào liposome tại nhiệt độ 50⁰C sau đó được
bảo quản lạnh trong 1 tuần để đạt hiệu suất liposome hóa cao.
3.4. Kết quả bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin
Việc áp dụng kết quả nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin
thu được vào bào chế thuốc tiêm chủ yếu là tìm biện pháp đảm bảo
độ vô khuẩn cho thuốc tiêm và kiểm soát được các thông số trong
quá trình bào chế. Ngoài các biện pháp tiệt khuẩn không thường về
môi trường bào chế, dụng cụ, thiết bị, các dung dịch đệm... còn cần
phải giải quyết các vấn đề đặc biệt sau:


13
- Liposome sau khi gắn DOX không thể tiệt khuẩn bằng phương
pháp lọc hoặc hấp tiệt khuẩn. Do đó cần phải sử dụng nguyên liệu vô
khuẩn.
- DOX hydroclorid có tốc độ hòa tan kém, dễ bị vón cục khi tiếp
xúc với nước bởi hiện tượng dime hóa. Quá trình hòa tan DOX thực
tế phải rắc từ từ dược chất vào hỗn dịch liposome cho đến khi tan hết
để tránh bị vón cục, thời gian hòa tan DOX kéo dài và có nguy cơ
ảnh hưởng đến độ bền của dược chất bởi nhiệt độ. Để giải quyết khó
khăn này, dược chất được đông khô trước nhằm mục đích tăng tốc độ
hòa tan và kiểm soát độ vô khuẩn cho DOX. Công thức đông khô
không sử dụng tá dược tạo khung, vì vậy qua khảo sát, lựa chọn các
thông số của thiết bị theo qui trình như sơ đồ ở hình 3.9.


86,65 ± 0,27

3.5.Kết quảđề xuất tiêu chuẩn và đánh giá độ ổn định của
thuốc tiêm liposome doxorubicin
3.5.1. Đề xuất tiêu chuẩn
Dựa trên các kết quả nghiên cứu và khảo sát trên, đề xuất tiêu
chuẩn liposome và cho thuốc tiêm liposome doxorubicin như sau:
3.5.1.1. Tiêu chuẩn liposome chưa mang dược chất
Tính chất: Hỗn dịch liposome không màu, hơi đục mờ, đóng trong
lọ thủy tinh có nắp hàn kín.pH: 6,5 – 7,5.Kích thước tiểu phân: Các
tiểu phân có đường kính trung bình từ 60- 120 nm, PDI ≤ 0,30.
3.5.1.2. Tiêu chuẩn liposome doxorubicin
Tính chất:Hỗn dịch liposome màu đỏ- da cam, hơi đục mờ, đóng
trong lọ thủy tinh có nắp hàn kín. pH: 6,0 – 8,0. Định tính: Phải thể
hiện phép thử định tính của doxorubicin hydroclorid. KTTP: Các tiểu
phân có đường kính trung bình từ 60- 150 nm, PDI ≤ 0,30. Định
lượng: Dược chất liposome hóa: không dưới 80%; Dược chất toàn


16
phần: chế phẩm phải chứa từ 90,0- 115,0% lượng doxorubicin
hydroclorid so với lượng ghi trên nhãn.
3.5.1.3. Tiêu chuẩn thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml
Tính chất: Hỗn dịch liposome màu đỏ- da cam, hơi đục mờ, đóng
trong lọ thủy tinh có nắp hàn kín.Thể tích: 10ml + 10 %.pH: 6,0 –
8,0.Định tính: Phải thể hiện phép thử định tính của doxorubicin
hydroclorid.Kích thước tiểu phân: Các tiểu phân có đường kính trung
bình từ 60- 150 nm; PDI ≤ 0,30.Định lượng:Dược chất liposome hóa:
không dưới 80%; dược chất toàn phần: chế phẩm phải chứa từ 90,0115,0% lượng doxorubicin hydroclorid so với lượng ghi trên
nhãn.Độ vô khuẩn: phải vô khuẩn. Nội độc tố vi khuẩn: không được

DOX tự do. Các nhóm chuột được điều trị đều có thời gian sống cao
hơn so với nhóm chứng (p0,05). Trên mô hình
gây u dưới da, tác dụng của Li-Do nghiên cứu tuy kém hơn Lipodox
một chút, song so với nhóm chứng, tác dụng này cũng rất rõ rệt
(p0,05) (Hình 3.13, 3.14).


18

Hình 3.13. Khối lượng khối u

Hình 3.14. Thể tích khối u

dưới da của chuột sau 30 ngày

dưới da của chuột sau 30 ngày

- Trên khối u cơ (Hình 3.15, 3.16): Về chỉ tiêu khối lượng khối u
cơ, 2 nhóm được nhận Li-Do nghiên cứu và Lipodox có sự khác biệt
rõ ràng so với nhóm chứng (p
chứng
TB
SD
32,26 12,6
116,2
62
73,
142,3
7

Kích thước khối u (mm3)
Nhóm Li-Do
Nhóm
Lipodox
TB
SD
TB
SD
28,9
12,28
29,3
8,36
59,06 22,16 40,75 21,11
60,63

23,8

40,44

17,57


Hình 3.17. Diễn biến kích thước khối u trên chuột

3.6.2.2. Ảnh hưởng của liposome DOX trên trọng lượng chuột:
dddSự khác biệt về trọng lượng chuột của các nhóm tại cùng một thời
điểm không có ý nghĩa thống kê (hình 3.18).


21
Hình 3.18. Trọng lượng chuột ở các nhóm điều trị

Chương 4: BÀN LUẬN
4.1.Bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin
Phương pháp tráng film được lựa chọn để bào chế liposome do
đơn giản, dễ tiến hành và dễ điều chỉnh được tỉ lệ pha phân tán. Quá
trình hydrat hóa cần được tiến hành ở xung quanh nhiệt độ chuyển
pha của phospholipid để đảm bảo tạo ra được cấu trúc màng kép.
Về công thức bào chế, thành phần chính của liposome là
phosphatidyl choline đậu tương và cholesterol. Cholesterol có vai trò
làm chắc vỏ liposome tuy nhiên nếu dùng nhiều quá sẽ làm giảm tính
linh động của lớp màng kép và do đó ảnh hưởng tới độ ổn định và
hiệu suất liposome hóa. Qua khảo sát, tỉ lệ 70:30 đã được lựa chọn là
phù hợp. Theo tài liệu tham khảo, tỉ lệ dược chất/lipid có ảnh hưởng
lớn tới hiệu suất liposome hóa, tỉ lệ 6:1 được lựa chọn để đảm bảo đạt
được nồng độ 2 mg/ml cho chế phẩm. Dung môi hòa tan lipid dùng là
cloroform, qua thực nghiệm tỷ lệ 10-20 mg lipid/ml dung môi có thể
tạo được film.
Để đảm bảo khả năng hướng đích, khả năng tiệt khuẩn bằng
phương pháp lọc cho chế phẩm, liposome cần phải có kích thước nhỏ
dưới 200 nm; 2 phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân: Siêu âm