BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y
---------------KHÁNH THỊ NHI

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U THỰC NGHIỆM
THUỐC TIÊM
LIPOSOME DOXORUBICIN

LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - NĂM 2017


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Ký hiệu viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
Chương 1..........................................................................................................3
TỔNG QUAN..................................................................................................3
1.1. Đại cương về doxorubicin.......................................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm hóa lý...............................................................................................................3
1.1.2. Độ ổn định.......................................................................................................................4
1.1.3. Cơ chế tác dụng...............................................................................................................6

2.6. Điều kiện thí nghiệm.............................................................................................................55
2.7. Địa điểm nghiên cứu.............................................................................................................55

Chương 3........................................................................................................56
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................................56
3.1. Xây dựng phương pháp định lượng doxorubicin..................................................................56
3.1.1. Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS.................................................................56
3.1.2. Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao.........................................................................59
3.2. Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin............................................................63
3.2.1. Bố trí thí nghiệm............................................................................................................63
3.3. Xây dựng qui trình bào chế liposome doxorubicin...............................................................74
3.3.1. Bào chế liposome chưa mang dược chất.......................................................................74
3.4. Bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin...........................................................................89
3.5. Đề xuất tiêu chuẩn và đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm liposome doxorubicin..............92


3.5.1. Đề xuất tiêu chuẩn.........................................................................................................93
3.5.2. Đánh giá độ ổn định.......................................................................................................94
3.6. Đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin trên khối u động vật thực nghiệm
.....................................................................................................................................................99
3.6.1. Đánh giá trên chuột nhắt mang tế bào ung thư Sacoma TG 180...................................99
3.6.2. Đánh giá tác dụng trên khối u chuột thiếu hụt miễn dịch mang tế bào ung thư tiền liệt
tuyến.....................................................................................................................................105

Chương 4......................................................................................................108
BÀN LUẬN.................................................................................................108
4.1. Phương pháp bào chế liposome........................................................................................108
4.1.1. Bào chế liposome chưa mang dược chất.....................................................................108
4.1.2. Giảm và đồng nhất kích thước liposome.....................................................................109
4.1.3. Đưa dược chất vào liposome.......................................................................................112

Acid Deoxyribonucleic

2

ARN

Acid ribonucleic

3

BP

Bristish Pharmacopoeia ( Dược điển Anh)

4

CHF

Congestive heart failure (Suy tim sung huyết )

5

CHL

Cholesterol


TT
6


11

DOPE

Dioleoylphosphatidyl ethanolamin

12

DDAB

Dimethyldioctadecylammonium bromid

13

DOX

Doxorubicin hydroclorid

14

DPPC

Dipalmitoylphosphatidylcholin

15

DPPE

1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin


21

DSPG

Distearoyl Phosphatidyl glycerol

22

EPC

Egg-derived phosphatidylcholin

23

EPG

Egg-derived phosphatidylglycerol

24

EurPh

European Pharmacopoeia ( Dược điển Châu Âu)

25

FDA

Food and Drug Administration ( Cục Quản Lý Thực
Phẩm và Dược Phẩm Hoa Kỳ)

Viết tắt
HPLC

Từ/cụm từ đầy đủ
High-performance liquid chromatography (Sắc kí lỏng
hiệu năng cao)

31

KHV

Kính hiển vi

32

KTTP

Kích thước tiểu phân

33

LUV

Large unilamellar vesicle ( Liposome đơn lớp lớn)

34

LVEF

Left ventricular ejection fraction (Thể tích tống máu

Phosphatidyl cholin

40

PDI

polydispersity index (Chỉ số đa phân tán)

41

PEG

Polyethylenglycol

42

PI

Phosphatidyl inositol

43

PTFE

Polytetrafluoroethylene Teflon

44

RSD



Tế bào ung thư

50

TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

51

TEM

Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử
truyền qua)


TT
52

Viết tắt
TKHH

Từ/cụm từ đầy đủ
Tinh khiết hóa học

53

Tf



4

1.2

Một số chế phẩm thuốc tiêm chứa doxorubicin trên thị trường

7

1.3

Phân loại liposome trên cơ sở kích thước và số lớp

14

1.4

Mốt số đặc tính của phospholipid dùng bào chế liposome

17


Bảng

Tên bảng

Trang

1.5


60

3.4

Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ doxorubicin

61

3.5

Độ lặp lại của phương pháp định lượng bằng HPLC

62

3.6

Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký

62

3.7

Kết quả khảo sát độ đúng

63

3.8

Các công thức bào chế liposome doxorubicin


Kết quả đánh giá kích thước tiểu phân của các mẫu sau 4 tuần
bảo quản

72

3.14

Hiệu suất liposome hóa của các mẫu sau 4 tuần và mới bào


Bảng

Tên bảng

Trang

chế

73

3.15

Tỷ lệ giải phóng dược chất ( %) liposome DOX sau 4 tuần
bảo quản tại pH 7.4

74

3.16

Tỷ lệ giải phóng dược chất ( %) liposome DOX sau 4 tuần

3.21

Hiệu suất liposome hóa của doxorubicin ủ ở 50⁰C

85

3.22

Hiệu suất liposome hóa của doxorubicin ủ trong 30 phút

87

3.23

Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo phương pháp thẩm
tích 3 lần đệm HEPES

88

3.24

Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo số lần đổi đệm tiếp
tuyến

89

3.25

Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo phương pháp đổi
đệm bằng lọc tiếp tuyến

3.29

Theo dõi độ ổn định và một số chỉ tiêu của thuốc tiêm
liposome doxorubicin ở điều kiện dài hạn

99

3.30

Theo dõi độ ổn định và một số chỉ tiêu của thuốc tiêm
liposome doxorubicin ở điều kiện phòng thí nghiệm

101

3.31

Tỷ lệ chuột mang u dưới da sống sót sau 30 ngày

103

3.32

Thời gian sống trung bình chuột mang u dưới da sau 30 ngày

104

3.33

Khối lượng u dưới da của chuột sau 30 ngày



123

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Sự phân hủy doxorubicin trong môi trường acid

5

1.2

Cấu tạo vỏ liposome

13

1.3

Các loại liposome

14


Hình


3.2

Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ doxorubicin

61

3.3

Đồ thị biểu diễn các chỉ số PDI và Z-average hệ liposome của
các mẫu

70

3.4

Hình ảnh chụp TEM của liposome doxorubicin bào chế theo
công thức A3.2

71

3.5

Đồ thị so sánh các chỉ số PDI và Z-average của các mẫu
liposome sau 4 tuần và mới bào chế

73

3.6



103

3.12 Thời gian sống trung bình chuột mang u dưới da sau 30 ngày

104

3.13

105

Khối lượng khối u dưới da của chuột sau 30 ngày


Hình

Tên hình

Trang

3.14 Thể tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày

106

3.15 Khối lượng khối u cơ trung bình của chuột sau 30 ngày

107

3.16 Thể tích khối u cơ của chuột sau 30 ngày


dụng trong lâm sàng để điều trị bệnh ung thư. Hiện nay, doxorubicin có thể
được bán tổng hợp từ daunorubicin và được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên,
cũng giống như các thuốc điều trị ung thư thuộc nhóm kháng chuyển hóa
khác, doxorubicin có rất nhiều tác dụng không mong muốn, đặc biệt là độc
tính gây suy tủy, làm thiếu bạch cầu, giảm tiểu cầu, làm rối loạn nhịp tim và
có thể dẫn đến tử vong. Do đó, hiện nay, thuốc tác dụng tại đích để điều trị
bệnh ung thư là sự lựa chọn thích hợp để tăng cường hiệu quả của thuốc tại
các khối u và giảm độc tính ở các tế bào lành.
Một trong những hệ đưa thuốc tại đích đang được chú trọng phát triển
trong bào chế hiện đại là dạng thuốc liposome. Đây là dạng thuốc có nhiều ưu
điểm trong quá trình vận chuyển, phân bố, kiểm soát giải phóng và tăng sinh
khả dụng của dạng thuốc. Ưu điểm đặc biệt của liposome sử dụng trong điều
trị ung thư là các phân tử thuốc sẽ đi nhiều vào khối u, giải phóng thuốc và
hạn chế thuốc đến các mô lành. Nhờ sự phát triển của công nghệ nano, trên
thế giới đã có một vài hãng sản xuất nanoliposome doxorubicin và được ứng
dụng trong lâm sàng như các biệt dược: Doxil, Caelyx, LipoDox,…[41] với
nhiều cải tiến về mặt bào chế nhằm nâng cao sinh khả dụng và giảm độc tính.
Tuy nhiên ở Việt Nam, các nghiên cứu về liposome chưa nhiều, chưa
có chế phẩm nào được đưa vào sản xuất. Hiện nay, dạng bào chế liposome
đang được chú trọng phát triển và có tiềm năng lớn cho tương lai. Vì vậy
nghiên cứu liposome doxorubicin là vấn đề cấp thiết nhằm phát triển một thế
hệ thuốc mới cho ngành Dược Việt Nam.


2

Với lý do trên, đề tài luận án: “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác
dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm liposome doxorubicin” được tiến
hành với 2 mục tiêu:
1. Bào chế được thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml ở quy mô

-1-methoxy-5,12-naphthacen-dion[133].
1.1.1. Đặc điểm hóa lý
Tính chất: Ở điều kiện thường doxorubicin hydroclorid tồn tại dưới
dạng tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam, không mùi. Điểm nóng
chảy 230oC. Dung dịch 5mg/ml có pH từ 4-5,5. Hằng số phân ly pKa 1 = 7,34
(phenol); pKa2 = 8,46 (amin); pKa3 = 9,46 (ester). Tan trong nước (50 mg/ml
ở 25oC), methanol, acetonitril, tetrahydrofuran. Không tan trong cloroform,
aceton, ethyl ether, benzene, ether dầu hỏa [133]. Trong methanol hấp thụ ở
bước sóng 233, 252, 288, 479, 496, 529 nm. Dung dịch nước có màu vàng
cam với pH acid, màu đỏ da cam tại môi trường trung tính, và màu tím màu
xanh ở pH > 9. Với các đặc tính trên, có thể áp dụng định lượng doxorubicin
bằng phương pháp quang phổ UV-vis hoặc HPLC với detector tử ngoại hoặc
huỳnh quang [131] (bảng 1.1).


4

Bảng 1.1. Một số phương pháp định lượng doxorubicin
Phương pháp

Áp dụng

Tài liệu

định lượng
tham khảo
Đo quang ở bước sóng Đánh giá giải phóng dược chất từ [15],[79],[133].
234, 282, 285.
HPLC, detector tử


5

Hình 1.1. Sự phân hủy doxorubicin trong môi trường acid
*Nguồn: Theo Dominique M.M. (1986)[34]

Các chế phẩm dung dịch đậm đặc để pha dung dịch tiêm truyền trên thị
trường đều có pH 3,0-4,0; sử dụng acid hydrocloric để điều chỉnh pH.
Ảnh hưởng của nồng độ ion:
Sự ảnh hưởng của nồng độ ion tới tốc độ phân hủy DOX đã được
nghiên cứu. Dung dịch dược chất được điều chỉnh ở pH không đổi (1,25) và
thay đổi nồng độ ion bằng cách thêm natri clorid. Độ ổn định của dược chất tỷ
lệ căn bậc hai của cường độ ion (µ) trong khảng 0,14

Dạng bào chế
Dung dịch đậm
đặc để pha
truyền tĩnh
mạch

Dạng bào
chế chứa
DOX tự
do

Bột đông khô
pha dịch
truyền tĩnh
mạch

Lọ bột đông
khô pha hỗn
dịch tiêm
liposome qui
ước
Liposome

Hỗn dịch tiêm
chứa
PEGylated
liposome
doxorubicin
Hỗn dịch

Mayne Pharm (Úc)
Laboratorios IMA
(Achentina)
Bioprofarma
(Achentina)
Intas (Ấn Độ)

Doxorubicin 10mg, 50mg
Doxorubicin 10mg/5ml
DBL
50mg/25ml
Doxorubicin
10mg, 50mg
Servycal
Doxtie

10mg, 50 mg

Zodox

10mg, 50mg

Myocet

Caelyx
Doxil
Lipodox

ThermoDox


thuốc rất khó được phân bố tới các mô qua đường uống, do đó thuốc được bào
chế dạng tiêm truyền tĩnh mạch. Doxorubicin được chuyển hóa bởi enzym
aldoketoreductases-NADPH thành chất chuyển hóa ưa nước doxorubicinol
13-hydroxyl có tác dụng chống ung thư và là chất chuyển hóa chính. Những
reductases có mặt trong hầu hết các tế bào, đặc biệt là trong hồng cầu, gan và
thận. Chất chuyển hóa khác không có tác dụng điều trị bao gồm các aglycon ít
tan trong nước, như doxorubicinon (adriamycinon) và 7-deoxy-doxorubicinon
(17-deoxy-adriamycinon). Các enzyme reductase chuyển doxorubicin thành
7-deoxyaglycon làm tăng tác dụng gây độc tế bào của thuốc vì nó tạo ra các
gốc hydroxyl gây tổn thương tế bào [133].
Do sự khác biệt về mặt bào chế, các chế phẩm chứa doxorubicin khác
nhau khi sử dụng cho các thông số dược động học khác nhau [141].
Với dung dịch truyền tĩnh mạch, đồ thị nồng độ trong huyết tương không
xuất hiện ở 3 pha tương ứng với thời gian bán thải là 12 phút; 3,3 giờ và 33
giờ. Thời gian bán thải tương đối dài của doxorubicin phản ánh việc phân bố
vào các mô của dược chất. Chỉ khoảng 33-50% dạng chuyển hóa tìm thấy
trong nước tiểu, mật và phân sau 5 ngày truyền tĩnh mạch. Phần còn lại của
dược chất và các sản phẩm chuyển hóa vẫn còn nằm lại trong các mô tại các
tổ chức của cơ thể. Với bệnh nhân ung thư, doxorubicin làm giảm
adriamycinol, một chất có độc tính. Quá trình này được xúc tác bởi enzym
aldoketoreductases-NADPH, được tìm thấy trong tất cả các mô và đóng vai
trò quan trọng để xác định dược động học của doxorubicin [28]. Thể tích phân
bố lớn (700 - 1100 L/m2), liên kết doxorubicin và chất chuyển hóa
doxorubicinol với protein huyết tương là 74-76% và không phụ thuộc vào
nồng độ của doxorubicin (> 2 µM).


9

Dược động học của liposome doxorubicin khác hẳn so với doxorubicin

máu ác tính, và thường được sử dụng trong điều trị các khối u sau đây: ung
thư vú, ung thư phổi, ung thưbiểu mô buồng trứng, ung thư bàng quang, u
nguyên bào thần kinh, khối u Wilm, u liên kết mô mềm, u xương ác tính,
bệnh bạch cầu cấp tính lymphocytic – lymphoblastic, bệnh bạch cầu nguyên
bào tuỷ cấp tính, ung thư không Hodgkin, bệnh Hodgkin (liên quan mạch
bạch huyết).
Doxorubicin cũng đã thể hiện hoạt tính chống ung thư, các khối u ác tính
ở người lớn và nhi khoa sau đây: ung thư biểu mô tuyến giáp, ung thư biểu
mô nội mạc tử cung, ung thư đầu và cổ, ung thư dạ dày, ung thư biểu mô tế
bào gan chính, ung thư tinh hoàn, ung thư biểu mô tuyến tiền liệt, Ewing
sarcoma, Rhabdomyosarcoma, đa u tủy, ung thư bạch cầu mạn tính.
Trong khi đó dạng bào chế thuốc gắn trong PEGylated liposome (Doxil,
Caelyx) có những chỉ định hẹp hơn, cụ thể hơn như:
*Điều trị ung thư vú và buồng trứng, nó được sử dụng để giếtcác tế bào ung
thư, thu nhỏ kích thước và trì hoãn sự tăng trưởng của khối u.
*Sử dụng trong kết hợp với thuốc khác là bortezomib để điều trị nhiều u tủy,
là một ung thư huyết tương tế bào. Tế bào huyết tương được sản xuất trong
tủy xương và là một thành phần của hệ thống miễn dịch.
*Sử dụng để điều trị bướu thịt Kaposi, một dạng khác của ung thư, cải thiện
làm phẳng, làm sáng và co rút bướu thịt Kaposi của bệnh ung thư [105],
[134].
Đối với dạng bào chế liposome chứa doxorubicin hydroclorid nhưng
không gắn PEG đại diện là Myocet chỉ định chính được đưa ra trong điều trị
ung thư vú nhằm mục đích giảm chi phí cho người bệnh tuy nhiên vẫn đảm
bảo tập trung dược chất.
1.1.7. Độc tính
Nhìn chung, sử dụng các chế phẩm chứa doxorubicin đều có nguy cơ gây
độc tính lên cơ thể. Độc tính trên tim là nghiêm trọng nhất, nhất là khả năng




12

Dạng liposome không PEG hóa được sử dụng trong ung thư vú di căn với liều
tương tự như dạng doxorubicin tự do[133].
*Cách sử dụng:
Với dung dịch tiêm cũng như bột pha dung dịch tiêm doxorubicin:
Dung dịch doxorubicin được cho từ từ vào ống truyền tĩnh mạch có sẵn
dung dịch tiêm truyền natri clorua, hoặc dextrose 5% tiêm [3].
Với hỗn dịch tiêm liposome doxorubicin:
Việc pha loãng hỗn dịch tiêm liposome doxorubicin phụ thuộc vào công
thức bào chế. Với liposome không gắn PEG (ví dụ như Myocet) quá trình
hydrat hóa dùng đệm citrat, do đó nhà sản xuất thường khuyên pha loãng với
dung dịch natri clorid đẳng trương. Đối với liposome gắn PEG như Lipodox,
Caelyx, quá trình đưa dược chất vào liposome sử dụng chênh lệch đệm
amoni, môi trường bên ngoài liposome được đẳng trương bằng sucrose do đó
nên pha loãng với dung dịch glucose 5% [72], [118].
1.2. Đại cương về liposome doxorubcin
1.2.1. Khái niệm
Liposome thuộc hệ đưa thuốc tới đích, là dạng phát triển ở mức cao hơn
thuốc tác dụng kéo dài. Nó là một dạng đặc biệt của microcapsule và
nanocapsule, cấu tạo bao gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ
phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có kích thước thay đổi từ
hàng chục đến hàng nghìn nanomet [1], [2], [9].
Đặc tính của màng phospholipid của liposome là màng kép lipid gồm hai
lớp. Trong quá trình hình thành liposome, các phân tử lipid hòa tan bao gồm
một đầu ưa nước và một đuôi kỵ nước, các lưỡng phân tử lipid tự kết tụ, sắp
xếp liền nhau thành phiến mỏng khi độ hòa tan của chúng giảm dần ở môi
trường nước.
Các đầu ưa nước của màng kép lipid quay ra tiếp xúc với pha nước,