Header Page 1 of 126.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC
HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis
(L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd.
Et Wils, Magnoliaceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2012

Footer Page 1 of 126.


Header Page 2 of 126.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC
HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis
(L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd.

con đường đóng góp cho khoa học.
TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, người có ảnh hưởng lớn đến việc thôi thúc
tôi gia nhập nhóm Ung thư thực nghiệm mặc dù thời điểm đó tôi chưa có cơ
hội được làm việc cùng cô. Cô không chỉ là người gợi mở, giúp đỡ tôi thực
hiện thí nghiệm mà còn tạo nên trong tôi lòng tin tưởng, mong muốn được
chia sẻ những khó khăn, khúc mắc gặp phải trong công việc và chủ động nêu
lên ý kiến của mình. Tôi đã học được ở cô không chỉ kiến thức, kỹ thuật mà
còn cả tính lạc quan, bình tĩnh xử lý và tháo gỡ những khó khăn gặp phải. Cô
đã, đang và sẽ luôn là một tấm gương cho tôi học tập và cố gắng.
ThS. Bùi Thị Vân Khánh, chị là người tôi có cơ hội được làm việc cùng
ngay từ những ngày đầu gia nhập nhóm nghiên cứu. Với vai trò là thành viên
cơ hữu dày kinh nghiệm, chị đã luôn tận tâm chỉ bảo, chia sẻ những kinh
nghiệm thực nghiệm quý báu và những khúc mắc trong cuộc sống với những

Footer Page 3 of 126.


Header Page 4 of 126.

thế hệ học viên, sinh viên đi sau như tôi. Đặc biệt trong khoảng thời gian
chuẩn bị bảo vệ, chị đã luôn sẵn sàng giúp đỡ và động viên tôi rất nhiều.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học
nói chung và các thầy cô trong Bộ môn Tế bào – Mô – Phôi – Lý sinh nói
riêng đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu, cách tư duy, làm việc, tạo
nền tảng vững chắc giúp tôi thực hiện luận văn cũng như công việc của mình
sau này.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới những người bạn lớp K51B
Công nghệ Sinh học, các anh chị, các bạn và các em sinh viên đã và đang là
thành viên trong nhóm Ung thư thực nghiệm, Bộ môn Tế bào – Mô – Phôi –
Lý sinh, Khoa Sinh học đã luôn ở bên cạnh, chia sẻ với tôi những khi tôi gặp

T ng u n

ung hư .............................................................................. 3

1.1.1.

Một số đặc điểm củ ung hư ................................................... 3

1.1.2.

Các gi i đoạn phá riển củ ung hư ........................................ 5

1.2.

Các m h nh sàng ọc huốc chống ung hư ............................................ 8

1.2.1.

Nu i cấy cơ u n...................................................................... 8

1.2.2.

Nu i cấy tế bào......................................................................... 8

1.2.3.

Nu i cấy khối cầu đ

bào ung hư (mu ice u r umor


Chế ph m Hono io M gno o Derrone à huốc T o ..................... 16

1.4.1.

Hono io (H) à M gno o (M).............................................. 16

1.4.2.

Derrone (D) ............................................................................ 19

Footer Page 5 of 126.


Header Page 6 of 126.

1.4.3.
1.5.

Taxol (Paclitaxel) ................................................................... 20
Enzyme Aurora kinaza .......................................................................... 22

CHƯƠNG 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................... 25
2.1.

Đối ượng nghiên cứu ............................................................................ 25

2.2.

Máy móc



u

h o sá độc ính củ Hono io M gno o

à Derrone rên m

h nh 2D……………. ................................................................................................. 33
3.1.1.

Với

ng HCT116 .................................................................. 33

3.1.2.

Với

ng He ........................................................................ 38

3.1.3.

Với

ng MCF7 ..................................................................... 41

3.1.4.

Với



ác động củ Hono io ên sự

ăng rưởng của khối spheroid MCF7 ....................................................................... 56

Footer Page 6 of 126.


Header Page 7 of 126.

3.3.

Kết qu nghiên cứu nh hưởng củ Hono io ên hệ vi sợi actin ......... 59

3.4.

Kết qu nghiên cứu nh hưởng củ Derrone ên sự phosphory hó

Histon H3 tại vị rí Serine 10 .................................................................................... 62
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 66
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 68

Footer Page 7 of 126.


Header Page 8 of 126.

Luận văn cao học


Danh mục hình minh họa

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA
Hình 1: Sáu đặc trưng cơ bản của ung thư .................................................................3
Hình 2: Thận chuột được sử dụng để sàng lọc thuốc .................................................8
Hình 3: Các TBUT HeLa bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy .....................................9
Hình 4: Mô hình cấu trúc cơ bản của khối u invivo và khối cầu đa bào ung thư ....10
Hình 5: Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116 ở người .............................14
Hình 6: TBUT vú MCF7 được nuôi cấy dạng đơn lớp in vitro ................................15
Hình 7: Cây Hậu phác bắc Magnolia officinalis Rehd. Et wils (trái) và cấu trúc
phân tử của hai đồng phân Honokiol và Magnolol (phải) .......................................16
Hình 8: Cơ chế tác động của Honokiol (H) và Magnolol (M) lên con đường truyền
tin dẫn đến apoptosis của tế bào ...............................................................................18
Hình 9: Cây vông nem Erythrina orientalis L., Fabaceae và công thức cấu tạo
Derrone .....................................................................................................................19
Hình 10: Cấu trúc phân tử Taxol ..............................................................................20
Hình 11: Cơ chế tác động của Taxol lên tế bào gây apoptosis ................................22
Hình 12: Hình ảnh mô phỏng liên kết của Taxol với vi sợi tubulin ..........................22
Hình 13: Các chất ức chế Aurora kinaza..................................................................24
Hình 14: Các dòng TBUT được bảo quản trong bình đựng Nito lỏng .....................27
Hình 15: Tế bào HCT116 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) .....................33
Hình 16: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL (trái) và 10µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................33
Hình 17: Tế bào HCT116 sau 48h ủ Magnolol ở nồng độ 5µg/mL (trái) và 50µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................34

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
ix

Hình 31: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của MCF7 với Taxol ..............44
Hình 32: Tế bào KPL4 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) .........................45
Hình 33: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................45

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
x

Footer Page 10 of 126.


Header Page 11 of 126.

Luận văn cao học

Danh mục vi t t t

Hình 34: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Magnolol NĐ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................45
Hình 35: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Derrone NĐ 5 (trái) và 20µg/mL (phải)
(100x) ........................................................................................................................46
Hình 36: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái); 0,3 (giữa) và 30µg/mL
(phải) (100x)..............................................................................................................46
Hình 37: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Honokiol (H) ..48
Hình 38: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Magnolol (M) .48
Hình 39: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Derrone (D) ....49
Hình 40: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Taxol ...............49
Hình 41: Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng thể tích của khối spheroid MCF7 sau 25

Hình 49: Ảnh hưởng của Honokiol lên hình thái tế bào Hela. Tế bào đối chứng
(trái); Tế bào Hela ủ với Honokiol NĐ 10 µg/mL (phải); màu đỏ: actin; màu lam:
nhân tế bào ................................................................................................................60
Hình 50: Sự rối loạn phân bố của F-actin dưới tác động của Honokiol tại NĐ 10
µg/mL sau 48h ủ. .......................................................................................................60
Hình 51: Tế bào Hela sau 24h ủ với Honokiol tại NĐ 20µg/mL. .............................61
Hình 52: Sự biểu hiện H3PS10 tại các kỳ khác nhau trong quá trình phân chia của
tế bào. ........................................................................................................................64
Hình 53: So sánh biểu hiện của H3PS10 tại các mẫu tế bào xử lý với Derrone (b);
Magnonol (c); Honokiol (d) và mẫu đối chứng (a). .................................................65

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
xii

Footer Page 12 of 126.


Header Page 13 of 126.

Luận văn cao học

Danh mục vi t t t

BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT
VIẾT ĐẦY ĐỦ

VIẾT TẮT
ADN


FLICE

Caspase 8

H

Honokiol

HCT116

Human colorectal carcinoma cell line

HeLa

Henrietta Lacks' 'Immortal' cell line

KHV

Kính hiển vi

KPL4

Human breast cancer cell line

M

Magnolol

MCF7

PBS

Đệm phosphate saline – Phosphate buffered saline

PMS

Phenazine methosulfate

TBUT

Tế bào ung hư

TNF

Tumor necrosis factor

TRAIL

TNF-related apoptosis-inducing ligand

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
xiv

Footer Page 14 of 126.


Header Page 15 of 126.



oài hực vật bậc c o hác nh u. Từ nhi u thế kỷ nay, thực vậ

ạng với hơn 12.000
h ng chỉ à nguồn

cung cấp inh ưỡng cho con người mà c n à những phương huốc chữa bệnh hết
sức uý giá b o gồm thuốc chống ung hư nói riêng à các bệnh hác nói chung.
Bởi vậy, nghiên cứu m r các hợp chất từ nguồn ược liệu hiên nhiên có h năng
chữ ung hư à mộ hướng nghiên cứu được nhi u nhà hoa học à hầy thuốc đầu
ư ập rung nghiên cứu trong nhi u năm n y.
Trong u hướng này chúng

i iến hành nghiên cứu hoạ ính háng u của

ba chất Hono io M gno o được ách chiết từ cây Hậu phác Magnolia officinalis
Rehd. Et wils, Magnoliaceae

à Derrone được ách chiết từ cây V ng nem

Erythrina orientalis L. Murr., Fabaceae do Viện Dược liệu Trung ương cung cấp
cho nhóm Nghiên cứu Ung hư hực nghiệm, Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa
học Tự Nhiên Đại học Quốc gi Hà Nội nhằm mục đích:

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
1

Footer Page 15 of 126.

Header Page 17 of 126.

Luận văn cao học

Tổng quan

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN
1.1.

T n

an

n

h

1.1.1. Một số đặc điểm của ung thư
Trong uá r nh đ gi i đoạn h nh hành hối u, tế bào ung hư (TBUT) thu
nhận à biểu hiện nhi u đặc điểm rong đó có sáu kh năng sinh học n i bật tạo nên
đặc ính phức tạp v mặt t chức của bệnh, bao gồm: duy r ín hiệu ăng sinh; rốn
ránh các yếu tố ức chế khối u; chống lại sự chết của tế bào; cho phép nhân ên gần
như bất tử; c m ứng h nh hành mạch máu à hoạ hó
Nguyên nhân sâu

uá r nh âm ấn à i căn.

của những đặc điểm đặc rưng này à sự bất n của hệ gen

trong TBUT dẫn đến những biến đ i v mặt di truy n đồng thời cũng hỗ trợ các


nhân h ng lồ phân chi mạnh gọi à nhân uái nhân chi . Màng nhân
ày ên à đường vi n h ng đ u.


V tỷ lệ giữ nhân à nguyên sinh chấ : Nhân o ên rong hi nguyên
sinh chất hẹp lại.



V nguyên sinh chấ : Có nhi u t n hương hoái hó như nhi u hang,
hốc… Nguyên sinh chất chứ các chất chế tiết, thể ùi.



Kh ng c n h năng ức chế tiếp úc nên ễ bong ra khỏi u.

V mặt chức năng TBUT biệ hó

ém

h ng hực hiện được những chức

năng b nh hường à ễ hoại tử. Đặc biệ chúng iế r các chất chỉ điểm được gọi
à m r er như µFP CA125 (ung hư buồng trứng) CA25 (ung hư đại ràng) HCG
(ung hư nhau thai inh hoàn)…
Khi u n sá

uần thể TBUT các nhà ho học đã đư r ba học thuyế



Thuyết v

ém n định gen của TBUT: Có hể b n đầu à mộ

ng

o

gen ung hư h ng n định nên có các ế bào biến dị sinh r hàng oạ các
tế bào hỗn hợp. Ví ụ: u lympho ác ính ế bào ớn, tế bào nhỏ hoặc các
loại ung hư ph i thể hỗn hợp ung hư m

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
4

Footer Page 18 of 126.

iên ết thể hỗn hợp.


Header Page 19 of 126.

Luận văn cao học

Tổng quan

1.1.2. Các giai đoạn phát triển của ung thư

hiệu hó .

c m” mộ cách bấ hường với

các ín hiệu ức chế phân bào. Trong các ế bào b nh hường, sự phân bào
hường được ích hoạt bởi các ín hiệu nhấ định; à ồn tại song song với
chúng à các ín hiệu ức chế phân bào. B nh hường h i cơ chế này cùng tồn
tại à phối hợp với nhau ở mức cân bằng
à có

ậy sự phân bào iễn ra n định

chức. Ở các TBUT h sự ngăn c n phân bào bị ê iệ

hi đó ế bào sẽ

u n được chuyển từ ph G1 s ng S để tiến hành s o chép ADN à bước ào
mộ chu r nh ế bào mới bất kể các s i hỏng ADN có được khắc phục hay
h ng. Các ế bào s u gi i đoạn ăng rưởng này sẽ tiếp tục phá riển hành
các hối u ác ính.


Gi i đoạn chuyển biến: Như

đã biết, protein p53 giữ

i r

u n rọng



h năng

heo chương r nh à “cột mốc” u n rọng để một

TBUT phá riển hành hối u ác ính.


Gi i đoạn n ràn: Các TBUT có h năng s o chép

tế bào som

ận. Ở người, mỗi

hường chỉ có h năng s o chép rung b nh ho ng 60 – 70 lần.

Tuy nhiên các TBUT có hể ượ

uá số lần phân bào này nhờ việc ADN phần

đầu mú nhiễm sắc thể được éo ài nhờ hoạ động mạnh của enzyme ADN
telomeraza. Khi các TBUT đạ đến gi i đoạn này chúng được gọi à các ế bào
bất tử. Gi i đoạn này có hể ngắn ài háng hoặc cũng có hể éo ài ài năm.
Trong gi i đoạn này

hối u bành rướng gi

ăng có hể từ 100 đến 1 triệu tế

bào nhưng ẫn c n uá nhỏ để các phương pháp ho học phá hiện được.

hác nh u rong cơ hể rước hi chúng rú ngụ ở vị rí mới à h nh hành hối
ung hư mới. Di căn heo đường bạch huyế hường gặp nhi u rong ung hư
biểu m

có hể

n ràn heo đường bạch huyết tại chỗ à đ i hi àm ắc, rồi

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm
6

Footer Page 20 of 126.


Header Page 21 of 126.

Luận văn cao học

Tổng quan

n đến mạch bạch huyế

ùng. Trong phương hức i căn heo đường kế cận,

các TBUT đi heo mạch máu à hần kinh, theo lối í
hư ạ ày

n u

Kể từ hi ung hư uất hiện, lịch sử oài người đã sử dụng à phá riển nhi u
phương pháp hác nh u để chống lại căn bệnh này như gi i phẫu, vậ ý rị liệu hó
trị liệu, miễn dịch trị liệu đi u trị hướng đích…
Trước đây huốc chống ung hư được đư

ào nhóm phương pháp hó

liệu, trị liệu hóc m n à miễn dịch trị liệu. Trong đó hó

rị liệu lại bao gồm nhi u

nhóm hác nh u ùy theo cấu rúc hó học à cơ chế ác động như nhóm
nhóm háng sinh nhóm chống chuyển hó
nhóm ức chế phân bào các hợp chấ p

rị

y hó

nhóm ức chế topoisomeraza I à II

inum à các hợp chấ

hác. Tuy nhiên

nhóm cuối cùng này ẫn đ ng ngày càng mở rộng nên các nhà ho học đã đ xuất
cách hức phân oại mới dự

rên đích ác động. Cụ thể các nhà ho học cho rằng



uá r nh sàng ọc nghiêm ngặt rên nhi u đối ượng cũng như uy m

hác nh u. Trong lịch sử phá riển ĩnh ực sàng ọc thuốc, đã có một số m h nh
được sử dụng như:
1.2.

C c

h nh

n

ọc h

c ch n

n

h

1.2.1. Nuôi cấy cơ quan
Đây à oại m h nh được sử dụng từ những năm 1950. Các cơ u n được
ách r

hỏi cơ hể đem nu i cấy in vitro. S u đó chúng được ương ác ới các hợp

chất cần thử. Ưu điểm củ m h nh này à uy r được ính nguyên ẹn củ m
cũng như mối quan hệ giữa tế bào ới tế bào nhờ vậy mà nó có ính ương đồng cao
với đi u kiện in vivo. Tuy nhiên



Header Page 23 of 126.

Luận văn cao học

Tổng quan

với sự phá riển củ m i rường có hành phần ác định v mặ hó học nên uy
r nh sàng ọc thuốc được tiến hành đơn gi n hơn rên các tế bào nu i cấy 2D này.
Sử dụng các loại thuốc nhuộm protein sẽ cho phép chúng
quan hệ đáp ứng li u giữ các

ác định được mối

ng ế bào hác nh u ới các nồng độ thuốc thử

hác nh u [39].
Các tế bào hi được phân ập đem nu i cấy in vitro hường phá riển hành
dạng hoặc r i n i, hoặc bám ính, hoặc hỗn hợp c 2 loại. Các oại TBUT sống r i
n i như ế bào u ympho TBUT máu h y ế bào ung hư m

iên ết Sarcoma-180.

Các ế bào này phá riển giống những h n đ o nhỏ r i n i rong m i rường nu i
cấy. Nhi u tế bào sống ở dạng bám ính như nguyên bào sợi, TBUT c tử cung
HeLa, TBUT ú KPL4… Một số tế bào sống ở dạng hỗn hợp c bám ính c

r i


cũng như của hệ miễn dịch với hợp chấ . Như ậy m h nh này h ng m phỏng
được đi u kiện in vivo củ cơ hể [39].
1.2.3. Nuôi cấy khối cầu đa bào ung thư (multicellular tumor spheroid)
M h nh nu i cấy khối cầu đ bào ung hư gọi tắ à m h nh spheroi

à

một khối h nh cầu được tạo nên ừ TBUT. Để tạo được m h nh này người ta tiến
hành nu i cấy giọ reo các TBUT. Dưới ác dụng của trọng lực cùng ới các iên
kết giữ các ế bào các TBUT tập trung lại à iên ết với nhau tạo nên các hối
cầu nhỏ. S u đó các hối cầu nhỏ này được đư

ào các đĩ nu i cấy chứ m i

rường nu i cấy ương ứng đã phủ một lớp giá đỡ bên ưới [11, 39].

Hình 4: Mô hình cấu trúc cơ bản của khối u invivo và khối cầu đa bào ung thư

Cấu rúc của một khối spheroid bao gồm:


Lớp

ng ngoài: Gồm kho ng từ 2-3 lớp tế bào sống phân chi mạnh

xếp hí nh u. Độ ày mỏng của lớp này ùy huộc từng

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

K19 Sinh học thực nghiệm


ùng này há u n rọng

rong các hí nghiệm đi u trị ung hư bằng hó chất, xạ trị.


Lớp rong cùng: à õi hoại tử, bao gồm những tế bào đã chết, có nhân
kế đặc lại nên ánh sáng u ng học h ng hể uyên u được,
này có màu đen hi u n sá

ậy lớp

ưới ính hiển i. Độ ày mỏng của lớp này

ùy huộc ào ừng gi i đoạn hác nh u của uá r nh sinh rưởng khối
spheroid [34].
So với m h nh nu i cấy tế bào đơn ớp h cấu rúc của spheroid gần giống
với hệ thống in vivo hơn. Các nghiên cứu gần đây cho hấy các tế bào được nu i cấy
rong m h nh 3D biểu hiện các đặc ính hác so ới khi nu i cấy 2D. Những sự
hác biệ này được coi như à yếu tố giúp m h nh 3D ph n ánh ố hơn sự ương ác
giữ các TBUT với m i rường in vivo như:


V đặc điểm h nh hái: Các TBUT nu i cấy 2D có h nh hái r i rộng
h ng ự nhiên c n các TBUT nu i cấy 3D có sự iên ết chặt chẽ ba
chi u, co cụm giống với khối u in vivo.



V tốc độ ăng rưởng: Các TBUT nu i cấy 3D phá riển chậm hơn so