Header Page 1 of 133.

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI HỢP TÁC KH&CN
VIỆT NAM-CỘNG HÒA PHÁP
NGHIÊN CỨU CHỨC NĂNG CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ
LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÂN HÓA CỦA RỄ LÚA
BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY SIÊU BIỂU HIỆN VÀ BẤT
HOẠT RNA (RNA INTERFERENCE)
Chủ nhiệm đề tài: TS. LÊ QUỲNH MAI

7825
26/3/2010

HÀ NỘI – 2009

Footer Page 1 of 133.


Header Page 2 of 133.

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP


Header Page 3 of 133.

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP

__________________

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ðộc lập - Tự do - Hạnh phúc
Hà Nội, ngày

tháng

năm 200...

BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ðỀ TÀI/DỰ ÁN SXTN
I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên ñề tài/dự án: Nghiên cứu chức năng của các yếu tố phiên mã liên quan
ñến quá trình phân hoá của rễ lúa bằng các phương pháp gây siêu biểu hiện
gen và bất hoạt RNA ( RNA interference)
Mã số ñề tài, dự án:
Thuộc: Chương trình hợp tác Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Cộng hòa Pháp
2. Chủ nhiệm ñề tài/dự án:
Họ và tên: Lê Quỳnh Mai
Ngày, tháng, năm sinh:

01/12/1980


Số tài khoản: 301.01.035.4
Ngân hàng: Kho bạc nhà nước Từ Liêm, Hà Nội
Tên cơ quan chủ quản ñề tài: Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.
4. Chủ nhiệm ñề tài ñối tác nước ngoài
Họ và tên: Pascal Gantet
Học hàm, học vị, chuyên môn: Giáo sư
Chức danh khoa học: Giáo sư trường ðH Montppellier 2, Pháp
ðiện thoại cơ quan: +33 (0) 67 61 65 44
Fax: 33 (0) 67 61 56 05
E-mail:
II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện ñề tài/dự án:
- Theo Hợp ñồng ñã ký kết: từ tháng 01/ năm 2008 ñến tháng 12/ năm 2009.
- Thực tế thực hiện: từ tháng 01/năm 2008 ñến tháng 12/năm 2009.
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 1.250 tr.ñ, trong ñó:
+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH:1.250 tr.ñ.
+ Kinh phí từ các nguồn khác: 0 tr.ñ.
+ Tỷ lệ và kinh phí thu hồi ñối với dự án (nếu có): …………............................
b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:
Số
TT
1

Theo kế hoạch
Thời gian
Kinh phí
(Tháng, năm)
(Tr.ñ)
01/2008 –


766,55

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:
ðối với ñề tài:
ðơn vị tính: Triệu ñồng
Số
TT

Nội dung
các khoản chi

Theo kế hoạch

1

Trả công lao ñộng
(khoa học, phổ
thông)

350

350

Nguồn
khác
0

2


0
0
0
0

201,912 201,912
46,5
46,5
99,879 99,879
1.146,1 1.146,1

0
0

3
4
5
6
7

Tổng

SNKH

Thực tế ñạt ñược
Tổng

SNKH

315,56


Footer Page 5 of 133.

Theo kế hoạch
Tổng

SNKH

Nguồn
khác

Thực tế ñạt ñược
Tổng

SNKH

Nguồn
khác


Header Page 6 of 133.

4
5
6
7

Chi phí lao ñộng
Nguyên vật liệu,
năng lượng

Ngày 19 tháng 5 năm
2008
Quyết ñịnh số
2267/Qð-BKHCN
Ngày 14 tháng 10 năm
2008

2

3

4

5

Tên văn bản

Ghi chú

Về việc phê duyệt các nhiệm vụ hợp tác quốc tế
về khoa học và công nghệ theo nghị ñịnh thư bắt
ñầu thực hiện từ năm 2008
Về việc thành lập Tổ thấm ñịnh ñề tài khoa học
và công nghệ theo Nghị ñịnh thư.

Về việc thành lập Hội ñồng khoa học và công
nghệ cấp Nhà nước thẩm ñịnh chuyển ngành xem
xét nhiệm vụ nghiên cứu khoa học và công nghệ
theo Nghị ñinh thư năm 2008.
Hợp ñồng thực hiện hợp tác quốc tế về khoa học

Ghi chú*


Header Page 7 of 133.

...
- Lý do thay ñổi (nếu có):
5. Cá nhân tham gia thực hiện ñề tài, dự án:
(Người tham gia thực hiện ñề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không
quá 10 người kể cả chủ nhiệm)

1

Tên cá nhân ñăng
ký theo Thuyết
minh
Lê Quỳnh Mai

Lê Quỳnh Mai

Nội dung
tham gia
chính
Nội dung 1

2

ðỗ Năng Vịnh

ðỗ Năng Vịnh

3

4

5

6

7

Tên cá nhân ñã
tham gia thực hiện

Nguyễn Văn Khiêm Nguyễn Văn Khiêm Nội dung 2

Nguyễn Thành ðức

Nguyễn Thành ðức

Nội dung 2

9

Pascal Gantet

Pascal Gantet

Nội dung 1

10

chuyển gen
Chọn lọc,
ñánh giá cây
chuyển gen
Chọn lọc,
ñánh giá cây
chuyển gen
Chọn lọc,
ñánh giá cây
chuyển gen
Các vector
chuyển gen
Các vector
chuyển gen

Ghi
chú*


Header Page 8 of 133.

6. Tình hình hợp tác quốc tế:
Số
TT
1

Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
ñịa ñiểm, tên tổ chức hợp tác, số
ñoàn, số lượng người tham

7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:
Số
TT

Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
ñịa ñiểm )

Thực tế ñạt ñược
(Nội dung, thời gian,
kinh phí, ñịa ñiểm )

Ghi chú*

1
2
...
- Lý do thay ñổi (nếu có):
8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:
(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, ñiều tra
khảo sát trong nước và nước ngoài)

Số
TT
1

Các nội dung, công việc
chủ yếu
(Các mốc ñánh giá chủ yếu)
Nội dung 1: Nghiên cứu tạo các


lúa và sử dụng kỹ thuật RNAi
gây bất hoạt các gen này.
Xác ñịnh các gen của các yếu tố
phiên mă có liên quan ñến cấu
trúc và chức năng bộ rễ lúa
Nghiên cứu thiết kế các gen
RNAi có khả năng gây bất hoạt
các gen của các yếu tố phiên mã
nghiên cứu.
Chuyển các plasmids thu ñược
vào các callus lúa thông qua vi
khuẩn A.tumefaciens
Nội dung 2: Chọn lọc, phân
tích, ñánh giá các cây lúa
chuyển gen

2008 – 2009

2008 – 2009

Viện DTNN
và CIRAD

2008 – 2009

2008 – 2009

Viện DTNN
và CIRAD

yếu
Phương pháp thiết kế Phương 1
vector mang gen pháp
nghiên cứu
Phương pháp thiết kế Phương 1
vector mang các pháp
RNAi tương ứng của
các gen nghiên cứu,
biểu hiện ñặc hiệu ở
lúa
Quy trình chuyển gen
Quy
1
các yếu tố phiên mã trình

Theo kế
hoạch

Số lượng

Thực tế
ñạt ñược

1

1

1

1

có khả năng kháng
hạn
5

Phương pháp ñánh Phương 1
giá biểu hiện gen ở pháp

1

1

hệ rễ của các cây
chuyển gen ở mức ñộ
kiểu hình
- Lý do thay ñổi (nếu có):
b) Sản phẩm Dạng II:
Số
TT

Tên sản phẩm

Yêu cầu khoa học
cần ñạt
Theo kế hoạch
Thực tế
ñạt ñược

Ghi chú

1

(2008). “Modulating Rice Stress
25, 381-404
Tolerance by Transcription Factors”

- Lý do thay ñổi (nếu có):
d) Kết quả ñào tạo:
Số
TT

Cấp ñào tạo, Chuyên
ngành ñào tạo

1

Thạc sỹ

Footer Page 10 of 133.

Số lượng
Theo kế hoạch
Thực tế ñạt
ñược
01
01

Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
2010


Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)

1
2
...
- Lý do thay ñổi (nếu có):
e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN ñã ñược ứng dụng vào thực tế
Số
TT

Tên kết quả
ñã ñược ứng dụng

Thời gian

ðịa ñiểm
(Ghi rõ tên, ñịa
chỉ nơi ứng
dụng)

Kết quả
sơ bộ

1
2
2. ðánh giá về hiệu quả do ñề tài, dự án mang lại:
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức ñộ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình ñộ

giống lúa kháng hạn và các yếu tố stress ở cây trồng.
-

Phương pháp RNAi ñã ñược ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của
nông nghiệp, thuỷ sản, y học v.v...

-

Cập nhật kịp thời những kiến thức hiện ñại về sinh học phân tử của RNAi
trong nghiên cứu cơ bản, trong ñào tạo ðại học và sau ðại học.

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:
(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do ñề tài, dự án tạo ra so với các
sản phẩm cùng loại trên thị trường…)
-

ðề tài có thể mở ra một hướng nghiên cứu ứng dụng mới ở nước ta.

-

Cung cấp các dòng cây chuyển gen có triển vọng kháng hạn, giảm chi phí sản
xuất và thiệt hại mùa màng do hạn hoặc các nhân bất lợi khác.

3. Tình hình thực hiện chế ñộ báo cáo, kiểm tra của ñề tài, dự án:
Số
TT
I

Nội dung
Báo cáo ñịnh kỳ

chứng.
- ðã sinh tổng hợp các cDNA tương
ứng từ RNA phân lập từ rễ lúa:
cDNA của gen OsNAC1 (Os06);
OsMADS56 (Os10), OsMADS26
(Os08).
- ðã xác ñịnh ñược 4 gen của các yếu
tố phiên mã có liên quan ñến cấu trúc
và chức năng bộ rễ lúa:
OsNAC1 (Os06g46270);
OsMADS25 (Os04g23910);
OsMADS26 (Os08g02070);
OsMADS56 (Os10g39130).
- ðã thiết kế 6 cặp mồi ñặc hiệu và
tách dòng các cDNA tương ứng.
ðã thiết kế thành công các vector
pDONR207 mang các gen của các
yếu tố phiên mã OsNAC1;


Header Page 13 of 133.
và sử dụng kỹ thuật
RNAi gây bất hoạt các
gen này.
Nội dung 2: Chọn lọc,
phân tích, ñánh giá các
cây lúa chuyển gen

II
III

Chủ nhiệm ñề tài
(Họ tên, chữ ký)

Lê Quỳnh Mai

Footer Page 13 of 133.

Thủ trưởng tổ chức chủ trì
(Họ tên, chữ ký và ñóng dấu)


Header Page 14 of 133.

LỜI CẢM ƠN
ðể hoàn thành ñề tài nghiên cứu “Nghiên cứu chức năng của các yếu tố
phiên mã liên quan ñến quá trình phân hóa của rễ lúa bằng phương pháp gây siêu
biểu hiện và bất hoạt RNA (RNA interference)” chủ nhiệm ñề tài xin chân thành
cảm ơn tới:
-

Bộ Khoa học và Công nghệ, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.

-

Lãnh ñạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.

-

Lãnh ñạo Viện Di truyền Nông nghiệp.


Header Page 15 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT..........................................................................4
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................5
I. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................11
1.1. Tầm quan trọng và các yếu tố ảnh hưởng ñến năng suất, sinh trưởng của
cây lúa .............................................................................................................11
1.2.

Nghiên cứu xác ñịnh hệ gen liên quan ñến khả năng kháng hạn ở cây trồng
15
1.3.

Khám phá ra các gen “hàng ñầu” tham gia vào việc cải thiện khả năng

kháng hạn của thực vật thông qua các thành tựu chuyển gen............................16
1.4.

Vai trò của các yếu tố phiên mã trong việc ñiều khiển biểu hiện của gen

phản ứng với hạn ............................................................................................18
1.5.

Biểu hiện của các yếu tố phiên mã phụ thuộc hàm lượng ABA nội bào


2.2.3. Phương pháp nghiên cứu thiết kế cặp mồi ñặc hiệu ..........................32
2.2.4. Sinh tổng hợp cDNA tương ứng từ RNA ñược phân lập từ mẫu rễ lúa.
33

Footer Page 15 of 133.

1


cáo
Header Page 16 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

2.2.5. Nghiên cứu thiết kế các vector siêu biểu hiện và bất hoạt gen ñích
quan tâm.........................................................................................................34
2.2.6. Phương pháp xây dựng hệ thống tái sinh in vitro hiệu quả cao cho các
giống lúa kháng hạn. ......................................................................................40
2.2.7. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium vào
callus lúa ........................................................................................................41
2.2.8. Chọn lọc, ñánh giá các cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen
ở mức ñộ kiểu hình.........................................................................................43
2.2.9. Chọn lọc, ñánh giá các cây chuyển gen siêu biểu hiện và bất hoạt gen
ở mức ñộ sinh lý.............................................................................................44
III.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................46
3.1. Nghiên cứu tạo các cây lúa chuyển gen siêu biểu hiện các yếu tố phiên mã
ở rễ lúa và sử dụng kỹ thuật RNAi gây bất hoạt các gen nghiên cứu. ...............46
3.1.1. Xác ñịnh các gen của các yếu tố phiên mã có liên quan ñến cấu trúc

KHẢ NĂNG ÁP DỤNG VÀ ðÀO TẠO NHÂN LỰC .........................97

2


cáo
Header Page 17 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................99
5.1. KẾT LUẬN ..........................................................................................99
5.2.
VI.

Footer Page 17 of 133.

KIẾN NGHỊ........................................................................................100

TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................101

3


cáo
Header Page 18 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

UV: ultra-violet
v/p: vòng/phút

Footer Page 18 of 133.

4


cáo
Header Page 19 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Tên, trình tự các cặp mồi nhân gen Os06, Os08 và Os10 .......................47
Bảng 3.2. Các ñoạn GST thuộc các gen yếu tố phiên mã khác nhau.......................59
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4-D (mg/l) ñến khả năng tạo mô sẹo từ hạt lúa
(giống Nipponbare).........................................................................................62
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nguồn hydrate carbon....................................................63
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng ñộ agar .................................................................64
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển ñến khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh64
Bảng 3.7. Kết quả tái sinh của giống nipponbare trên môi trường tối ưu ................65

Footer Page 19 of 133.

5


cáo

kháng sinh Hygromycin..................................................................................70
Hình 3.17. Hình thái rễ sau thay ñổi từ 2 ñến 7 ngày tuổi.......................................71
Hình 3.18. Hình thái bộ rễ lúa ở các dòng chuyển gen khác nhau (7 ngày tuổi)......72
Hình 3.19. So sánh mật ñộ rễ của các dòng lúa chuyển gen....................................73
Hình 3.20. So sánh tính hướng trọng lực của các dòng lúa chuyển gen ..................74
Hình 3.21. ðiện di kiểm tra chất lượng RNA tách chiết trên gel Agarose 1% ........75
Hình 3.22: Mức ñộ biểu hiện của gen OsMADS26 ở các bộ phận khác nhau của cây
lúa và trong ñiều kiện stress áp suất thẩm thấu và mặn. ..................................76

Footer Page 20 of 133.

6


cáo
Header Page 21 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

Hình 3.23. So sánh sự sinh trưởng của các dòng lúa chuyển gen gây siêu biểu hiện
hoặc bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện ñối chứng (MS/2) và gây stress
áp suất thẩm thấu (MS/2 + 125 mM Manitol) .................................................77
Hình 3.24. So sánh chiều cao thân của các dòng lúa chuyển gen gây siêu biểu hiện
hoặc bất hoạt gen OsMADS26 trong ñiều kiện ñối chứng (MS/2) và gây stress
áp suất thẩm thấu (MS/2 + 125 mM Manitol) .................................................78
Hình 3.25. Tăng trưởng chiều cao cây của các dòng siêu biểu hiện gen .................79
Hình 3.26. Tăng trưởng chiều cao cây của các dòng gât bất hoạt gen.....................80
Hình 3.27. Sự tăng trưởng chiều cao cây của các dòng bất hoạt gen OsMADS26 ..81
Hình 3.28. So sánh số nhánh tạo thành của dòng bất hoạt gen với cây ñối chứng...81

LỜI MỞ ðẦU

Thực vật là những sinh vật không dễ biến ñổi và chúng phải thích nghi với
ñiều kiện sống bất lợi của môi trường chủ yếu bằng ñiều khiển sự sinh trưởng
và phát triển của chúng cùng với sự thay ñổi về mặt sinh lý và sinh hóa. Các
nhân tố phiên mã ñiều khiển sự biểu hiện gen ñể phản ứng trước các tín hiệu
của môi trường và sinh lý. Một nhân tố phiên mã ñược mã hóa bởi một gen
ñơn ñộc nhưng ñiều khiển sự biểu hiện của nhiều gen khác dẫn ñến sự hoạt
hóa của một phức hợp các cơ chế và do vậy là mục tiêu ở mức ñộ sinh học
phân tử ñể cải tiến khả năng chống chịu của cây trồng với các ñiều kiện sống
khắc nghiệt. Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba cây lương thực quan
trọng nhất. Do ñó, cây lúa ñã và ñang ñược nhiều nhà nghiên cứu quan tâm.
ðể ñảm bảo an ninh lương thực trong ñiều kiện dân số thế giới tăng nhanh
hiện nay, cần khẩn cấp gia tăng sản lượng lúa gạo. ðối với các nước ñang
phát triển, hạn hán và sự suy thoái chất lượng ñất ñai ñã và ñang ảnh hưởng
nghiêm trọng tới sản lượng cây trồng; việc nghiên cứu tạo ra các giống lúa
chịu hạn tốt và ổn ñịnh vẫn là biện pháp tối ưu trong tình hình hiện nay.
Việc xác ñịnh những gen chìa khóa tham gia vào quá trình phân nhánh bộ
rễ ở cây lúa có thể cho phép sử dụng các chỉ thị phân tử vào việc chọn lọc
những tính trạng cấu trúc bộ rễ lúa phù hợp với khả năng chịu hạn của lúa.
Mục tiêu của dự án là nghiên cứu chức năng của một số gen mã hóa một số
yếu tố phiên mã ở rễ lúa và vai trò của các yếu tố này trong sự hình thành
hình thái bộ rễ lúa. ðề tài phải giải quyết một loạt các vấn ñề kỹ thuật mới
trong ñó ñáng kể nhất là công nghệ RNAi. Công nghệ này lần ñầu tiên ñược
nghiên cứu ở nước ta.

Footer Page 22 of 133.

8


- Chuyển các plasmids thu ñược vào các callus lúa thông qua vi khuẩn
A.tumefaciens: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen vào lúa

Footer Page 23 of 133.

9


cáo
Header Page 24 ofBáo
133.

tổng kết Khoa học và Kỹ thuật ðề tài

thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Nghiên cứu tối ưu hóa hệ thống tái
sinh in vitro ở lúa thích hợp cho việc tái sinh callus chuyển gen.
- Chọn lọc, phân tích, ñánh giá các cây lúa chuyển gen: Phân tích, ñánh
giá các dòng cây chuyển gen siêu biểu hiện hoặc bất hoạt gen
OsMADS26 ở mức ñộ kiểu hình và ở mức ñộ sinh lý.

Footer Page 24 of 133.

10


cáo
Header Page 25 ofBáo
133.

I.


Footer Page 25 of 133.

11