ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC

----------

Phạm Thị Thùy

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH MỘT SỐ
TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN HUYẾT

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Cán bộ hướng dẫn : TS. Lã Thị Huyền
PGS.TS. Nguyễn Quang Huy

Hà Nội, 2016


MỤC LỤC


DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC HÌNH


MỞ ĐẦU
Nhiễm khuẩn huyết là một tình trạng bệnh lý rất thường gặp trong lâm sàng

nghi ngờ mắc nhiễm khuẩn huyết tại Việt Nam. Nội dung chính của đề tài bao gồm:
Lựa chọn và thiết kế các mồi đặc hiệu các gen đích của các chủng vi khuẩn
gây nhiễm khuẩn huyết.
Tối ưu điều kiện phản ứng multiplex PCR.
Thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm của bệnh
nhân nhiễm khuẩn huyết.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nhiễm khuẩn huyết
1.1.1. Lịch sử, khái niệm và tình trạng nhiễm khuẩn huyết
Trong lịch sử, nhiễm khuẩn huyết là một bệnh rất khó khăn để xác định và
chẩn đoán. Từ 100 trước công nguyên, các học giả La Mã (116 TCN-27 TCN) đã
mô tả về nhiễm khuẩn huyết như sau: “những sinh vật nhỏ, không thể nhìn thấy
bằng mắt, có đầy trong không khí và qua hơi thở gây ra các bệnh nguy hiểm”. Tiếp
đó các nhà sử học, nhà triết học, nhân chủng học và tiêu biểu là một học giả thời kì
phục hưng Niccolo Machiavelli (1469-1527) trong báo cáo của mình cũng đã lần
lượt mô tả đầy đủ về nhiễm khuẩn huyết [1].
Ngày nay, chúng ta đã biết rằng sốt lao phổi không phải nhiễm khuẩn huyết.
Tuy nhiên trong một thời gian dài, sốt lao phổi được cho là nhiễm khuẩn huyết bởi
trong giai đoạn y học chưa phát triển, việc mô tả nhiễm khuẩn huyết rất khó để
được chấp nhận cho đến khi triệu chứng bệnh trở nên rõ ràng và khó khăn trong
điều trị cùng với tính sự nghiêm trọng của bệnh thì người ta bắt đầu quan tâm hơn
và nỗ lực tìm hiểu đưa ra khái niệm về nhiễm trùng huyết. Theo như sự mô tả của
bác sĩ người Mỹ William Osler (1849-1919) khi nghiên cứu bệnh nhân chết bởi
những phản ứng của cơ thể đáp ứng lại tác nhân xâm nhiễm hơn là do nhiễm trùng
đã đưa ra khái niệm đầu tiên về nhiễm khuẩn huyết là một hệ thống các đáp ứng của
cơ thể vật chủ với tác nhân xâm nhiễm [1]. Năm 1972, khái niệm này được khẳng


đáp ứng viêm

Tế bào bạch cầu ≥12,000 / µl hoặc ≤4000 / µl hoặc> 10% chưa
phát triển các triệu chứng.

Nhiễm khuẩn huyết

Nhiễm khuẩn huyết
nặng

Sốc nhiễm trùng

Hội chứng rối loạn
chức năng nội tạng

Ít nhất có hai tiêu chí của hội chứng đáp ứng viêm hoặc
nghi ngờ nhiễm trùng
Nhiễm khuẩn huyết với rối loạn chức năng cơ quan cấp tính (bao
gồm cả tăng truyền dịch và hạ huyết áp) gây ra bởi
nhiễm trùng huyết
Nhiễm khuẩn huyết với hạ huyết áp kéo dài hoặc hoặc tràn dịch
mô mặc dù chất lỏng hồi sức thích hợp
Xuất hiện rối loạn chức năng nội tạng tại một bệnh cấp tính
bệnh nhân không thể duy trì cân bằng nội mô
khi không có tác động hỗ trợ.

4



nhân bị nhiễm khuẩn huyết nặng và sốc nhiễm trùng . Theo một nghiên cứu ở Anh
tỷ lệ dân số nhiễm khuẩn nặng là 0,51 trường hợp trên 1000 dân số [9]
Gần đây, tỷ lệ bệnh nhân mắc nhiễm khuẩn huyết đang có xu hướng gia tăng
với khoảng 8,7% mỗi năm. Nhiều trong số bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết, khoảng
0,003% tiến triển thành nhiễm khuẩn huyết nặng [8].
1.1.2. Dấu hiệu của nhiễm khuẩn huyết
Các dấu hiệu của nhiễm khuẩn huyết bao gồm các triệu chứng:
Các dấu hiệu và triệu chứng chung: Sốt cao (đôi khi hạ thân nhiệt), thở
nhanh hoặc nhiễm kiềm hô hấp, tràn dịch, phù nề.
Dấu hiệu chung về phản ứng gây viêm: tăng hoặc giảm số lượng tế bào
bạch cầu, tăng dấu hiệu viêm (C-reactive protein, procalcitonin, interleukin-6).
Thay đổi huyết áp động mạch: hạ huyết áp động mạch, nhịp tim nhanh
không rõ nguyên nhân, áp lực mạch máu thấp, tràn dịch dưới da, lượng nước tiểu
giảm.
Các dấu hiệu của rối loạn chức năng nội tạng: thiếu oxy máu (tổn thương
phổi cấp tính), tình trạng thần kinh bị ảnh hưởng, không giải thích được thay đổi
chức năng thận, tăng đường huyết, giảm tiểu cầu hoặc đông máu nội mạch rải rác,
không rõ nguyên nhân thay đổi trong các thử nghiệm chức năng gan (bilirubin),
không dung nạp thức ăn (thay đổi nhu động ruột) [10].

6


1.1.3. Tác động lâm sàng của nhiễm khuẩn huyết và các yêu cầu y tế chưa được
đáp ứng
Nhiễm khuẩn huyết được coi là một cuộc chạy đua giữa các tác nhân gây
bệnh và hệ thống miễn dịch vật chủ và là vấn đề y tế cộng đồng tiêu biểu và là một
trong những nguyên nhân phổ biến nhất lựa chọn vào các đơn vị chăm sóc đặc biệt
(ICU) [11]. Tỷ lệ tử vong liên quan đến nhiễm trùng huyết khá cao dù đã được cải
thiện kết quả trong chăm sóc sức khỏe đồng thời nhiễm trùng huyết là nguyên nhân

được tập trung thực hiện và công bố.
1.1.4 Dịch tễ học nhiễm khuẩn huyết
Trong một nghiên cứu gần đây của Angus và Van der Poll về tỷ lệ tỉ lệ nhiễm
khuẩn huyết [12]. Tại Hoa Kỳ 2% bệnh nhân và 10% bệnh nhân của IUC ( đơn vị
chăm sóc y tế đặc biệt- intensive care unit ) là những bệnh nhân bị nhiễm trùng
huyết nặng [25]. Nhiễm trùng huyết nặng xảy ra do đồng thời nhiễm trùng cộng
đồng và nhiễm trùng y tế liên quan. Viêm phổi, nhiễm trùng ổ bụng, nhiễm trùng
đường tiết niệu là nguyên nhân phổ biến nhất của nhiễm trùng huyết [8, 9].
Staphylococcus aureus và Streptococcus gây viêm phổi là những chủng Gram
dương phổ biến nhất, trong khi những chủng vi khuẩn Gram âm phổ biến là
Escherichia coli, Klebsiella và Pseudomonas aeruginosa đã được phát hiện [9].
Trong giai đoạn 1979-2000, Vi khuẩn Gram dương gây nhiễm trùng huyết được báo
cáo với tần suất cao hơn so với Gram âm [7]. Tuy nhiên, gần đây hơn, vi khuẩn
Gram âm được phân lập ở 62% bệnh nhân bị nhiễm trùng huyết nặng, trong khi vi
khuẩn Gram dương chiếm 47% và nấm chiếm 19% các trường hợp [9].
Yếu tố nguy cơ quan trọng đối với nhiễm trùng huyết nặng là cách thức bệnh
nhân bị nhiễm trùng và khả năng của các cơ quan bị rối loạn chức năng nếu nhiễm
trùng phát triển. Các bệnh mãn tính như hội chứng suy giảm miễn dịch, tắc nghẽn
phổi mãn tính, nhiều bệnh ung thư khác và việc sử dụng các tác nhân ức chế miễn
dịch là một trong những nguy cơ quan trọng đối với những bệnh nhiễm trùng dẫn
đến nhiễm trùng huyết nặng và sốc nhiễm trùng [8]. Tuổi tác, giới tính, chủng tộc
hoặc dân tộc tất cả đều ảnh hưởng tới tỉ lệ nhiễm trùng. Tỷ lệ nhiễm trùng huyết cao
hơn ở trẻ sơ sinh và người lớn tuổi so với các nhóm tuổi khác, cao hơn ở nam nhiều
hơn ở nữ, và cao hơn ở người da đen so với người da trắng [8, 27]. Các yếu tố di
truyền như đa hình trong gen mã hóa cytokine và các chất trung gian khác tham gia

8


vào quá trình miễn dịch bẩm sinh, đông máu và phân hủy fibrin cũng khả năng góp

khác nhau, từ bệnh nhẹ về da, nhiễm trùng mô mềm tới ảnh hưởng đời sống bệnh
nhân như nhiễm trùng sau phẫu thuật, nhiễm trùng huyết và hội chứng sốc độc tố.
S. aureus (MRSA) kháng Methicillin và S. aureus (MSSA) mẫn cảm với Methicillin
là nguyên nhân gây tỷ lệ lớn nhiễm trùng bệnh viện dẫn tới điều trị khó khăn.
Trong thập kỷ qua, các trường hợp nhiễm MRSA ngày càng gia tăng, MRSA
gây nhiễm khuẩn bệnh viện và nhiễm khuẩn mắc phải từ cộng đồng bao gồm viêm
nội mạc tim, viêm tủy xương, hội chứng sốc nhiễm độc, viêm phổi, ngộ độc thực
phẩm, và nhọt độc [30]. MRSA kháng methicillin ở tụ cầu qua trung gian PBP2a,
một loại protein được gọi là protein liên kết penicillin (78 kDa). Protein này có ái
lực thấp với nhóm kháng sinh β-lactam. Gen femA mã hóa cho protein PBP2a kháng
methicillin, do đó gen này được sử dụng như một marker phân tử phát hiện MRSA
[31, 32].
Staphylococcus aureus kháng Methicillin được phát hiện trong một nghiên
cứu của Hassanain và tập thể (2009). Trong nghiên cứu này các tác giả sử dụng
phương pháp nhân bản gen đa mồi. 5 gen được nhân bản bao gồm: 16S rRNA của
chi Staphylococcus, MecA của S. aureus, gen MecA mã hóa cho kháng methicillin,
gen Luks mã hóa sản xuất của Panton-Valentine leukocidin (PVL) cytotoxin hoại tử
và một gen nội chuẩn để tránh hiện tượng âm tính giả. Thử nghiệm trên 230 chủng
phân lập lâm sàng, cho thấy phương pháp có độ nhạy 97,6% và độ đặc hiệu lên tới
99,3% [33].
b. Acinetobacter baumannii
Acinetobacter baumannii là trực cầu khuẩn, gram âm, hiếu khí, không lên
men glucose. Nhu cầu sinh trưởng đơn giản và khả năng chống chịu các điều kiện
môi trường rất cao do vậy A. baumannii xuất hiện phổ biến trong môi trường và là
một phần của hệ vi khuẩn trong cơ thể người [34]. Trong thập kỷ qua, chúng ngày
càng được chỉ ra là một vi sinh vật quan trọng trong các loại nhiễm trùng khác nhau
ở bệnh viện bao gồm nhiễm trùng do viêm phổi, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng

10



11


d. Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn hình que, gram âm được tìm thấy phổ
biến trong môi trường tự nhiên, con người và động vật. Chúng sinh trưởng mạnh
trong điều kiện ẩm ướt và có thể sử dụng một loạt các hợp chất hữu cơ. P.
aeruginosa gây nhiễm trùng nghiêm trọng dẫn tới tỷ lệ tử vong cao ở bệnh nhân suy
giảm miễn dịch và là một trong các nguyên nhân gây nhiễm trùng bệnh viện [42,
43].
P. aeruginosa là sinh vật phổ biến nhất được phân lập từ phổi của 80% bệnh
nhân trưởng thành với chứng xơ nang phổi. Sự có mặt của chủng vi sinh vật này
tương quan với sự suy giảm chức năng phổi và các triệu chứng lâm sàng của bệnh
nhân. Tại bệnh viện, các loại thiết bị y tế hoặc dụng cụ có liên quan đóng vai trò
như một nguồn cung cấp P. aeruginosa và những nguồn này trở thành tiêu điểm cho
việc bùng phát lây lan vi sinh vật [44].
Kích thước hệ gen của P. aeruginosa khoảng từ 5,2-7,1 Mbp. Mức độ dao
động kích thước có ý nghĩa quan trọng đối với các phương pháp được sử dụng để
nghiên cứu sự tiến hóa và dịch tễ học của vi sinh vật này. Nghiên cứu gần đây cho
thấy rằng hơn 80% trình tự hệ gen của các chủng (chủng PAO1) được công bố (chỉ
với 0,5% nucleotide bị phân tán). Trong khi đó, hiện nay hàng loạt các phương pháp
di truyền phân tử được sử dụng để nghiên cứu dịch tễ học và phân tích di truyền
quần thể. Lomholt và cộng sự (2001), Pirnay và cộng sự (2002) sử dụng kỹ thuật
giải trình tự của gen mã lipoprotein màng ngoài, kết hợp với huyết thanh đặc trưng
và pyoverdine để nghiên cứu di truyền khảm nhiễm thể mở rộng, đặc biệt là ở gen
oprD [45, 46].
e. E.coli
E. coli là nguyên nhân vi khuẩn phổ biến nhất của nhiễm trùng bệnh viện và
chúng cũng được tìm thấy với tần suất cao ở nhiễm trùng đường hô hấp và nhiễm

Hình 2 : Các phương pháp xác định nhiễm khuẩn huyết [49]
1.3.1. Chẩn đoán nhiễm trùng huyết bằng phương pháp cấy máu
Phương pháp được dựa trên cơ sở một mẫu máu được nuôi cấy trong môi
trường giàu dinh dưỡng sau đó được nhận diện và kiểm tra các tác nhân gây bệnh
bằng cách sử dụng xét nghiệm sinh hóa tiêu chuẩn. Phương pháp cấy máu được thực
hiện với các thiết bị tự động phát hiện sự tăng trưởng của vi sinh vật bằng cách phân
tích sự giải phóng CO2 bởi huỳnh quang hoặc cảm biến hoặc cách khác là thay đổi
áp suất trong bình nuôi cấy do sự tiêu thụ và sản xuất khí này dùng để chỉ thị sự
phát triển của vi sinh vật [22]. Mặc dù có những ưu điểm nhất định nhưng thời gian
thực hiện của phương pháp là quá dài dẫn tới khó khăn để đưa ra quyết định điều trị
nhanh chóng trong những trường hợp cần thiết [50]. Trong khi đó độ nhạy của
phương pháp còn bị ảnh hưởng bởi khoảng thời gian từ lấy máu đến nạp vào bình
nuôi cấy [22, 51]. Hơn nữa để có kết quả, cần thêm một thời gian phát triển của sinh
vật gây bệnh khoảng 24 đến 72 giờ và việc nhuộm Gram cần thêm thời gian ủ qua
đêm để thu được khuẩn lạc riêng rẽ cho xét nghiệm. Hơn nữa, kết quả âm tính chỉ

14


có thể được kết luận sau 5-7 ngày. Ngoài ra, hiệu ứng ức chế của các loại thuốc
kháng sinh hoặc mầm bệnh khó nuôi cấy cũng làm hạn chế độ nhạy của phương
pháp [52].
1.3.2. Lai huỳnh quang tại chỗ
Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) là một trong những phương pháp được
nghiên cứu nhiều nhất trong các kỹ thuật thương mại. Phương pháp này phù hợp
cho việc phát hiện tác nhân gây bệnh trong nuôi cấy máu dương tính. Trong khoảng
2,5-3 giờ, FISH có thể xác định hơn 95% vi khuẩn và nấm men thường được tìm
thấy trong máu [53, 54]. Kết quả cấy máu dương tính được chuẩn bị, lai với mẫu dò
oligonucleotide gắn huỳnh quang hướng tới đích là rRNA, và quan sát bằng kính
hiển vi [55]. Tuy nhiên phương pháp này có nhược điểm là một số vi khuẩn chỉ có

giữa các loài vi khuẩn, nấm và các loài sinh vật khác. Phương pháp có mức độ nhạy
cao hơn khi sử dụng mồi thoái hóa [22].
Mặc dầu kỹ thuật multiplex PCR phát hiện nhanh, nhạy các tác nhân gây
bệnh so với cấy máu thông thường và có thể hỗ trợ rất lớn trong chẩn đoán nhưng
không thể thay thế hoàn toàn phương pháp cấy máu. Trong nhiều nghiên cứu, tỷ lệ
phát hiện bệnh do kết hợp của cả hai phương pháp cao hơn hẳn so với chỉ thực hiện
PCR hoặc nuôi cấy máu riêng lẻ. Toàn bộ quá trình xét nghiệm bằng PCR đến khi
cho kết quả có thể được hoàn thành trong khoảng 5 giờ. Phương pháp này rút ngắn
thời gian cần thiết cho xác định kiểu hình và kháng sinh đồ đồng thời có ưu điểm là
độ nhạy độ, đặc hiệu rất cao. Một trong những hệ thống xét nghiệm điển hình là
StaphPlex demonstrated có độ nhạy và độ đặc hiệu lên tới xấp xỉ 100% và có độ
dao động từ 95,5% đến 100,0% khi dùng để xác định tụ cầu khuẩn [61].
c. Broad-range PCR
Broad-range PCR cho phép phát hiện vi khuẩn hoặc nấm trong máu dựa trên
gen mã cho gen 16S rRNA hoặc gen 23S rRNA của vi khuẩn và gen 18S rRNA của
nấm. Sau phản ứng, các sản phẩm khuếch đại có thể được phát hiện bằng các
phương pháp khác nhau như phân tích giải trình tự, pyrosequencing, hoặc lai với
mẫu dò đặc hiệu [89].

16


d. Real-time PCR
Kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm khuếch
đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong
đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh
quang. Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch
đại trong mỗi chu kỳ. Tùy thuộc vào số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống
phản ứng mà giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) của các mẫu là khác nhau. Dựa vào đặc
điểm này có thể xác định số bản sao DNA đích có trong mẫu nghiên cứu dựa trên

Theo nghiên cứu của Nguyễn Minh Hiền và cộng sự (2015) về bệnh nhân
nhiễm khuẩn huyết nặng điều trị tại Bệnh Viện Thanh Nhàn có 42,5% tử vong dù đã
được điều trị tích cực như lọc máu liên tục, thở máy. Trong đó có 22,5% phát hiện
vi sinh vật. Điều trị chậm 1giờ, thang điểm SOFA tăng 1 điểm thì nguy cơ tử vong
tăng 1,25 lần. Do đó phương pháp xác định nhanh đối tượng nhiễm khuẩn là hết sức
quan trọng. Phương pháp multiplex PCR hiện nay là phương pháp có khả năng đáp
ứng được yêu cầu của thực tế. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu phát hiện 5
chủng vi sinh vật gây nhiễm trùng huyết phổ biến (Staphylococcus aureus,
Acintobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, và Pseudomonas
aeruginosa) sử dụng phương pháp multiplex PCR với mong muốn góp phần vào
việc phát hiện sớm nhiễm khuẩn huyết và góp phần vào điều trị hiệu quả.

18


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm
Các mẫu DNA tổng số của các chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus,
Acintobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, và Pseudomonas
aeruginosa được bệnh viện Thanh Nhàn cung cấp.
Các chủng nhiễm khuẩn huyết (nuôi cấy thuần).
Mẫu bệnh phẩm được lấy từ bình cấy máu của 50 bệnh nhân người Việt
Nam nghi ngờ bị nhiễm khuẩn huyết được lấy từ Bệnh viện Thanh Nhàn.
Mẫu máu được lấy từ bệnh nhân nghi ngờ nhiễm khuẩn huyết do bệnh viện
Thanh Nhàn cung cấp.
Các cặp mồi được tổng hợp bởi Proligo (Sigma-Aldrich, Corporation, USA)
(Bảng 2.1)
Bảng 2.1. Trình tự Nucleotide của các cặp mồi
Cặp mồi

2.2.1. Tách chiết DNA từ vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm cấy máu bằng phương
pháp đun sôi
Bổ sung lysozyme nồng độ 1 mg/ml vào 1 ml mẫu bệnh phẩm cấy máu, ủ ở
37o trong 30 phút. Sau đó đun sôi mẫu ở 100 oC trong 10 phút rồi làm lạnh nhanh
trong nước đá 5 phút. Ly tâm mẫu với tốc độ 12 000 vòng/phút trong 5 phút để lấy
dịch nổi (chứa DNA).
2.2.2. Tách chiết DNA vi khuẩn trong mẫu máu của bệnh nhân nghi nhiễm
khuẩn huyết
DNA vi khuẩn trong mẫu máu của bệnh nhân được tách theo chỉ dẫn của kit
Qiagen theo thứ tự các bước như sau:
Hút 1 ml máu của bệnh nhân vào ống eppendorf 1,5 ml, ly tâm 7000 v/ph
để thu tế bào.
Hòa tan tế bào trong 180 µl đệm lysis chứa enzyme lysozyme 1 mg/ml và ủ
ở 37oC trong 30 phút.
Bổ sung 4 µl enzyme RNase 10 mg/ml, ủ mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 5
phút.
Bổ sung 200 µl EtOH (96-100%), đảo đều.
Hút dịch lên cột, ly tâm cột 8000 v/ph, 1 phút, bỏ dịch qua cột.
Bổ dung 500 µl dung dịch AW1 lên cột, ly tâm 8000 v/ph trong 1 phút, bỏ
dịch qua cột.
Bổ sung 500 µl dung dịch AW2 lên cột, ly tâm 12 000 v/ph trong 5 phút, bỏ
dịch qua cột.
Bổ sung 100 µl nước khử ion vô trùng lên cột, để khoảng 1 phút, sau đó ly
tâm 8000 v/ph để thu DNA.
2.2.3. Xác định nồng độ DNA
Nồng độ DNA mạch kép được xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước
sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280).
Nồng độ DNA được tính theo công thức:
CDNA = OD260 × 50 × d
Trong đó: d: độ pha loãng mẫu khi đo

với các thành phần: 12,5 µl Mastermiex, 1 µl random hexamer, 8 µl khuôn DNA và
3,5 µl H2O. Chương trình phản ứng: bước 1: biến tính 95 oC trong 3 phút; bước 2:
chu trình lặp lại 20 chu kỳ (94oC trong 45 giây, 50oC trong 45 giây, 72oC trong 1
phút 30 giây); bước 3: hoàn thiện sản phẩm ở 72 oC trong 8 phút; bước 4: làm mát
sản phẩm PCR ở 10oC trong 30 phút.
2.2.6. Điện di trên gel agarose
Chuẩn bị gel agarose 1% : cân 1 g agarose cho vào 100 ml dung dịch TAE
1X, đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn. Để nguội khoảng 50 oC rồi rót
dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lược. Sau khoảng 30 phút, khi
gel đã đông, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di. Rót đệm TAE 1X vào bể để

21