BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
---------  ---------

NGUYỄN XUÂN DŨNG

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi
ĐỂ TẠ

D NG
I U

N Dendrobium CÓ KHẢ N NG

HẢ

HÁNG

NG Cymbidium mosaic virus)

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số: 62.62.01.11

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP

TP. Hồ Chí Minh, 2017



dụng cho mục đích sản xuất hoa cắt cành và hoa chậu. Dendrobium đã thực sự
trở thành một giống lan chủ lực đối với ngành sản xuất hoa lan ở Việt Nam
trong nhiều năm qua. Tại Thành phố Hồ Chí Minh, một trong những trung tâm
sản xuất hoa lan lớn nhất cả nước, cùng với lan Mokara, Dendrobium là một
trong hai giống lan đóng góp chính vào tổng sản lượng thu hoạch 6,7 triệu chậu
và 68,9 triệu cành hoa lan (đạt giá trị 613,9 tỷ đồng) của ngành sản xuất hoa
lan thành phố trong năm 2015 (UBND Tp. Hồ Chí Minh, 2016). Tuy nhiên,
hiện tại việc sản xuất lan Dendrobium nói riêng và hoa lan nói chung tại Thành
phố Hồ Chí Minh cũng như cả nước vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu trong
nước. Hoa lan vẫn được nhập khẩu từ các nước như Thái Lan, Đài Loan, Trung
Quốc để cung cấp cho thị trường trong nước. Việc nghiên cứu nâng cao năng
suất và sản lượng hoa lan là một trong những vấn đề có ý nghĩa quan trọng đối
với ngành sản xuất hoa lan Việt Nam.
Có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến năng suất và sản lượng hoa lan,
trong đó bệnh hại là một trong những yếu tố gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất.
Nhiều loại bệnh khác nhau gây hại trên lan Dendrobium cũng như hoa lan nói
chung đã được ghi nhận, nhưng đáng chú ý nhất là bệnh do virus gây ra. Hiện
có hai loại virus gây hại phổ biến trên hoa lan đó là virus khảm vàng
(Cymbidium mosaic virus - CyMV) và virus đốm vòng (Odontoglossum
ringspot virus - ORSV) (Zettler và cs, 1990). Trong đó, tỷ lệ nhiễm virus
CyMV cao hơn so với virus ORSV trên các giống lan ở Việt Nam (Dũng và cs,
2009, Hồng và cs, 1999; Quỳnh và cs, 2007), và đặc biệt là lan Dendrobium
được trồng ở một số khu vực thuộc Thành phố Hồ Chí Minh chỉ bị nhiễm virus
CyMV, với tỷ lệ lên đến 67,5%, mà không bị nhiễm virus ORSV (Dũng và cs,
2009). Như vậy, có thể thấy virus CyMV hiện đang lây nhiễm rất nghiêm trọng
trên giống lan Dendrobium ở Việt Nam.
Cây lan nhiễm virus thường bị giảm sức sống, giảm số lượng và chất lượng
hoa, từ đó ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và sản lượng thu hoạch.

1

2. Mục tiêu và yêu cầu
Nghiên cứu áp dụng và đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen RNAi
trong việc tạo ra khả năng kháng virus CyMV cho lan Dendrobium trong điều
kiện nuôi cấy in vitro.

2


3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trên lan Dendrobium Sonia và virus CyMV gây
bệnh trên lan. Các dòng lan chuyển gen được tạo ra qua việc chuyển cấu trúc
RNAi của gen CP và ORF2-4+CP từ virus CyMV vào mô lan (PLBs) bằng kỹ
thuật chuyển gen qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (A.
tumefaciens). Các thí nghiệm khảo sát, đánh giá trong nghiên cứu được giới
hạn trong điều kiện in vitro.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
* Ý nghĩa khoa học
- Góp phần làm sáng tỏ vấn đề về mức độ bảo thủ của trình tự gen CP phân
lập từ virus CyMV tại Việt Nam.
- Góp phần hoàn thiện kỹ thuật chuyển gen qua trung gian vi khuẩn A.
tumefaciens trên đối tượng lan Dendrobium.
- Tạo tiền đề quan trọng cho việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen RNAi để
tạo ra khả năng kháng virus cho lan Dendrobium cũng như hoa lan nói chung.
* Ý nghĩa thực tiễn
Tạo ra được các dòng lan Dendrobium chuyển gen có khả năng kháng virus
CyMV trong điều kiện in vitro, là nguồn vật liệu cho nghiên cứu tạo giống lan
kháng virus thông qua lai tạo.
5. Đóng góp mới của luận án
- Chứng minh được tính bảo thủ của trình tự gen CP phân lập từ virus
CyMV tại Việt Nam.

2009; Hồng và cs, 1999; Quỳnh và cs, 2007) và đặc biệt là lan Dendrobium
được trồng ở một số khu vực thuộc Thành phố Hồ Chí Minh chỉ bị nhiễm virus
CyMV, với tỷ lệ lên đến 67,5%, mà không bị nhiễm virus ORSV (Dũng và cs,
2009). Như vậy, có thể thấy virus CyMV hiện đang lây nhiễm rất nghiêm trọng
trên giống lan Dendrobium ở Việt Nam.
Sự can thiệp RNA (RNA interference - RNAi) là hiện tượng im lặng gen
sau phiên mã do phân tử RNA mạch kép cảm ứng, được công bố ban đầu ở
giun tròn (Ceanorhabditis elegans) (Yamada và cs, 2007). Việc khám phá ra
RNAi đã cách mạng hóa lĩnh vực nghiên cứu chọn giống cây trồng. RNAi hiện
diện như một công cụ mới đầy tiềm năng cho việc chọn giống cây trồng qua
việc áp dụng các đoạn trình tự RNA không mã hóa nhỏ, có khả năng kiểm soát
sự biểu hiện gen một cách chuyên biệt trình tự (Abhary và Rez, 2015). RNAi
cũng được xem là một cơ chế quan trọng để tạo ra khả năng kháng virus cho
cây trồng (Baulcombe, 2004). Hiệu quả của RNAi trong việc tạo ra khả năng
kháng virus lần đầu tiên đã được thông báo với kết quả kháng virus PVY
(Potato virus Y) ở khoai tây. Nhiều nghiên cứu ứng dụng RNAi để tạo ra khả
năng kháng các loại virus thực vật khác nhau đã được công bố (Abhary và Rez,

4


2015). Tuy nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng RNAi để tạo ra khả năng kháng
virus cho lan Dendrobium hiện còn rất hạn chế. Đối với nghiên cứu ở nước
ngoài, công trình duy nhất về vấn đề này đã được Chuphrom và cộng sự (2009)
công bố trên lan Dendrobium Sonia. Trong đó, nhóm tác giả đã chuyển cấu
trúc RNAi của gen CP từ virus CyMV vào PLBs bằng phương pháp bắn gen.
Tuy nhiên, kết quả của nghiên cứu này chỉ mới dừng ở mức thu được các dòng
lan có mang gen CP. Còn nhiều vấn đề chưa được làm rõ như khả năng kháng
virus và tính ổn định của gen chuyển như thế nào, hiệu quả tạo ra tính kháng
virus khi áp dụng RNAi ra sao,… Ngoài ra, việc sử dụng phương pháp bắn gen


Trình tự mồi

SP(bp)

5’- GGGATCCATGGGAGAGTCCACTCCAAC-3’
5’-GGAATTCTTATTCAGTAGGGGGTCCAGGC-3’

672

5


Kiểm tra gen F-pJET1.2 5’- CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC- 3’
trong
vector
R-pJET1.2 5 - AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG- 3’
pJET1.2

807

Khuếch
đại Fi-ORF2-4 5’- CACCGCGGCCAATATAAAGA- 3’
đoạn gen từ
vector pBSK
Ri-CCP
5’- AGTCGACGGCATCGAAGAAG-3’

500


450
780/820
257
297

2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện trên cây lan Dendrobium Sonia trưởng thành và
virus CyMV gây bệnh trên hoa lan.
Nội dung 1: Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào PLBs lan
Dendrobium Sonia qua trung gian vi khuẩn A. tumefaciens.
Nội dung 2: Nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen CP của virus
CyMV ở Việt Nam.
Nội dung 3: Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen RNAi mang phân đoạn
gen CP và gen ORF2-4 của virus CyMV.
Nội dung 4: Nghiên cứu tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của
gen CP và gen ORF2-4+CP.
Nội dung 5: Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan
chuyển gen bằng phương pháp lây nhiễm virus nhân tạo trong điều kiện in vitro.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia
* Xác định các điều kiện thích hợp để tạo PLBs
Thực hiện thí nghiệm nuôi cấy để xác định các yếu tố: nồng độ Ca(OCl)2
(15-30%) để khử trùng đoạn thân mang chồi ngủ; nồng độ BA (0,1-0,5 mg/l),
NAA (0,5-5 mg/l) bổ sung vào môi trường MS để tạo PLBs từ lát cắt thân cây
lan in vitro và sự tăng sinh của PLBs.

6


* Xác định nồng độ acetosyringone (AS), thời gian nuôi cấy và chủng vi

LB + 100 mg/l spectinomycin. Kiểm tra gen bằng PCR khuẩn lạc với mồi M13
và enzyme cắt hạn chế XbaI và HindIII (nằm trên vector). Biến nạp vector tái
tổ hợp vào A. tumefaciens C58 và sàng lọc trên môi trường LB + 50 mg/l
ampicilin, 100 mg/l spectinomycin và 50 mg/l rifamycin.

7


2.2.4. Tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi
* Chuyển cấu trúc RNAi vào PLBs bằng A. tumefaciens
Lây nhiễm PLBs với A. tumefaciens C58 mang vector RNAi, nuôi cấy trên
môi trường MS + 0,3 mg/l BA, 1,0 mg/l NAA và 100 M AS trong 3 ngày, loại
vi khuẩn với 300 mg/l cefotaxime. Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển với
500 mg/l kanamycin và kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển bằng PCR.
* Thu nhận cây lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển
PLBs mang cấu trúc gen chuyển được nuôi cấy trên môi trường ½ MS để
thu nhận cây lan hoàn chỉnh.
2.2.5. Đánh giá khả năng kháng CyMV của cây lan chuyển gen
Ly trích dịch virus từ mẫu lá lan nhiễm virus, lọc vô trùng và tiêm vào cây
lan trong điều kiện in vitro để lây nhiễm. Đánh giá khả năng kháng virus của
cây lan bằng quan sát hình thái và phản ứng RT-PCR.
2.2.6. Phân tích và xử lý số liệu
Các thí nghiệm đều được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Số liệu
nghiên cứu được được phân tích ANOVA, so sánh khác biệt ở mức p< 0,05 và
phân hạng (nếu có) theo Duncan bằng phần mềm SPSS.
2.2.7. Điều kiện nuôi cấy
Mẫu thực vật được nuôi cấy ở điều kiện: ánh sáng 2.500  500 lux, thời gian
chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt độ 25  2oC, ẩm độ 55  5%. Vi khuẩn được nuôi
cấy trong tối, nhiệt độ 28oC (A. tumefaciens) hay 37oC (E. coli), lắc 200 vòng/phút.
2.2.8. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

20
50,00b
20
3
25
70,00a
4
30
46,70b
ANOVA
*
*: Khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05.
*

1cm

A

Hình

3.1.

1 cm

B

Chồi

ngủ


14
15
ANOVA

Nồng độ (mg/l)
BA
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5

NAA
0,5
1
2
3
5
0,5
1

9


Đến 6 tuần nuôi cấy, bắt đầu có sự hình thành cấu trúc mới từ các lát cắt. Tuy
nhiên, chỉ có môi trường MS bổ sung BA 0,5 mg/l kết hợp với NAA 0,5 hay 1,0
mg/l phù hợp cho lát cắt tạo PLBs và tiếp tục nhân lên (Hình 3.2 - K, L).

A

H

B

I

C

D

J

K

F

E

L

M


2 cm

Hình 3.3. Sự tăng sinh PLBs của lan Dendrobium Sonia trên môi trường MS bổ
sung BA và NAA sau 10 tuần nuôi cấy. (A). MS, (B). 0,1 mg/l BA + 1,0 mg/l
NAA, (C). 0,3 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA, (D). 0,5 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA.
Bảng 3.3. Sự thay đổi trọng lượng PLBs trên các môi trường
Nghiệm thức
1. MS
2. MS + 0,1 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA
3. MS + 0,3 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA
4. MS + 0,5 mg/l BA + 1,0 mg/l NAA
ANOVA
*: Khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05.

Trọng lượng PLBs (g)
1,50c
2,34bc
8,47a
3,15b
*

10


3.1.2. Nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi
khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs
* Trường hợp chủng C58
Tỷ lệ mẫu dương tính GUS đạt cao nhất (71,67%) ở thời điểm 3 ngày
với cả hai trường hợp có (100 µM) và không có AS (Bảng 3.4).

NS

76,67
60,00
56,67
61,67
41,67
NS

3 ngày

4 gày

5 ngày

a

55,42
41,67
26,67
43,89
50,00
NS

57,92a
41,67b
51,67ab
45,00b
48,33ab
*

10

Tỉ lệ mẫu dương tính GU
1 ngày
53,33
36,67
60,00
53,33
26,67
NS

2 ngày
60,00
58,33
68,33
56,67
68,33
NS

3 ngày
51,67b
50,00b
75,00a
46,67b
44,44b
*

%)

4 ngày

gen
10
10
10
10
10

Tỉ lệ mẫu dương tính GU

%)

1 ngày 2 ngày 3 ngày
4 ngày 5 ngày
b
c
0
20,00
43,33
33,33
20,00d
00,00b
a
ab
b
50
40,00
50,00
58,67
61,11
13,33b

NS
*
*
*
*: Khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05; NS: không có sự khác biệt.
Như vậy, với cả 3 chủng vi khuẩn, hiệu quả chuyển gen đều đạt cao nhất ở

100 µM AS sau 3 hay 4 ngày đồng nuôi cấy.
* Về mức độ biểu hiện gen GUS
Các mẫu chuyển gen ở cả 3 trường hợp đều có sự xuất hiện màu (xanh
chàm) khác biệt so với đối chứng không chuyển gen (không màu), với 3 mức
độ khác nhau: biểu hiện dạng khảm, biểu hiện thành mảng hay biểu hiện trên
toàn mẫu (Hình 3.4).

A

B

C

D

0,5 mm

Hình 3.4. Các mức độ biểu hiện gen GUS của PLBs chuyển gen.
(A). Đối chứng không chuyển gen, (B). Biểu hiện dạng khảm, (C). Biểu
hiện thành mảng, (D). Biểu hiện trên toàn mẫu.
Tóm lại, việc chuyển gen vào PLBs của lan Dendrobium Sonia có thể
được thực hiện thành công với cả 3 chủng vi khuẩn C58, EHA105 và
LBA4404. Sự chuyển gen xảy ra ổn định sau 3 ngày (C58 và EHA105) hay 4

khuẩn
khuẩn

0
300
500
700

100,00
93,30
86,70
80,00

+++
++
+
-

100,00aa
80,00
40,00b
0,00c

+++
-

ANOVA
NS
*
*: Khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05; NS: không có sự khác biệt,

26,67b
100,00a
100,00a
100,00a

ANOVA

*

*

*: Khác biệt có ý nghĩa ở mức p < 0,05.

13


- Trường hợp kanamycin
Sau 40 ngày, tỷ lệ PLBs chết chia thành 3 mức: thấp (100 - 300 mg/l), trung
bình (400 - 500 mg/l) và cao (700 mg/l) (Bảng 3.9). Nồng độ thấp không phù
hợp cho chọn lọc, nhưng nồng độ trung bình có thể dùng cho sàng lọc sơ bộ
trước khi chuyển sang nồng độ cao.
Bảng 3.9. Tỷ lệ PLBs chết do tác động của kanamycin ở các nồng độ khác
nhau, theo thời gian nuôi cấy
Nồng độ
Tỷ lệ mẫu chết theo thời gian
kanamycin (mg/l)
(%)
20 ngày
40 ngày
0

XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN CP CỦA CyMV

3.2. PHÂN LẬP

3.2.1. Phân lập gen CP
Kết quả PCR thu được sản phẩm có kích thước gần 700 bp (Hình 3.5), phù
hợp với kích thước của gen cần phân lập (672 bp). Như vậy, gen CP đã được
khuếch đại thành công.
L

1

2

3

4

1

2

3

4

5

6


có 100 mg/l ampicilin. Khuẩn lạc tiếp tục được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi

14


F-CCP/R-CCP định vị trên gen. Kết quả đã khuếch đại được một phân đoạn
DNA ở vị trí khoảng 700 bp, phù hợp với sản phẩm dự kiến 672 bp (Hình 3.6).
Khuẩn lạc tiếp tục được kiểm tra với mồi F-pJET1.2/R-pJET1.2 định vị
trên vector và đã thu được phân đoạn DNA gần 800 bp, phù hợp với dự kiến
(807 bp) (Hình 3.7). Plasmid từ vi khuẩn cũng được kiểm tra với enzyme
BamHI và EcoRI và cũng thu được phân đoạn DNA gần 700 bp, phù hợp với
dự kiến (672 bp) (Hình 3.8). Như vậy, gen CP đã được tạo dòng thành công.
L

1

2

3

L

1

2

3000bp
1000bp

700bp

Trình tự
HCM1
HCM2
DaLat
HaNoi
BacGiang
ThaiNguyen

HCM1

HCM2

DaLat

HaNoi

Bac
Giang

Thai
Nguyen

100
99
96
95
96

100
99

các nước. Tỷ lệ tương đồng dao động từ 95-99% (Bảng 4.11). Như vậy, trình
tự gen CP của virus CyMV có tính bảo thủ cao giữa các vùng. Điều này đảm
bảo cho sự kháng virus hiệu quả của cây chuyển gen tạo ra bằng RNAi.
Bảng 3.11. Tỷ lệ tương đồng giữa các trình tự gen CP của virus CyMV ở Việt
Nam và một số khu vực trên thế giới
Tỷ lệ tương đồng (%)
Trình tự
HCM1
HCM2
DaLat
HaNoi
BacGiang
ThaiNguyen
3.3. THIẾT

KF85326 AY429021 AB693982 AF405728 AB541560 EF125180
China
Taiwan Indonesia Singapore
Korea
Hawai

97
97
97
97
96
96
Ế ECT

96

97
96
96

CHUYỂN GEN RNAi

Vector RNAi được thiết kế với đoạn gen CP (450 bp) thu nhận từ vector
nhân dòng mang gen CP; và đoạn gen ghép nối ORF2-4+CP (496 bp), được
tổng hợp nhân tạo từ phân đoạn 302 bp (nt 819-1120) trên gen ORF2-4 và phân
đoạn 194 bp (nt 279-472) trên gen CP và gắn vào vector pBSK.

16


3.3.1. Tạo vector pENTRTM/D-TOPO® có gắn gen CP/ORF2-4+CP
* Khuếch đại đoạn gen CP và gen ORF2-4+CP từ vector
Theo tính toán, đoạn gen CP và ORF2-4+CP sẽ có kích thước tương ứng là
450 bp và 500 bp. Kết quả đã thu được phân đoạn DNA ở gần vị trí 450 bp
(CP) và 500 bp (ORF2-4+CP). Điều này cho thấy, đoạn gen mục tiêu đã được
khuếch đại thành công (Hình 3.10).
1

L

1

L
1

2

750bp

250bp

Hình 3.10. Kết quả kiểm tra sản
phẩm khuếch đại gen CP (A)
và ORF2-4+CP (B). (1). Mẫu,
(L). Thang DNA.Chứng âm.

Hình 3.11. Kết quả kiểm tra phân
đoạn gen CP trong các dòng vi
khuẩn biến nạp vector pENTR/CP
với cặp mồi M13.

* Gắn đoạn gen CP và ORF2-4+CP vào vector pENTR TOPO
(L). Thang DNA, (1-10). Mẫu
Kết quả kiểm tra các dòng tế bào biến nạp vector (đã gắn gen) bằng PCR với
mồi M13 cho thấy có hiện diện phân đoạn DNA ở vị trí gần 750 bp (CP) và giữa
750-1000 bp (ORF2-4+CP) (Hình 3.11 và 3.12), phù hợp với kích thước dự kiến
(780 bp và 820 bp. Điều này cho thấy gen mục tiêu đã được gắn vào vector.
1
1

2

3

4

5

ORF2-4+CP (B) trong vi khuẩn
bằng enzyme SalI và NotI.

B

Hình 3.13. Kết quả kiểm tra sự hiện
diện của phân đoạn gen CP (A) và
ORF2-4+CP (B) trong vi khuẩn
bằng enzyme SalI và NotI.

Kết quả cắt plasmid pENTR tái tổ hợp với enzyme SalI và NotI đã thu được
các phân đoạn DNA ở vị trí 3000 bp và 250 bp (CP), 2500 bp và 500 bp (ORF24+CP) (Hình 3.13), phù hợp với kích thước tính toán: 2839 bp và 201 bp (CP),
2574 bp và 502 bp (ORF2-4+CP). Điều này một lần nữa khẳng định phân đoạn
gen CP và ORF2-4+CP đã được gắn thành công vào vector pENTR.

17

L


1 2

1 2 3 4 5 6 L

3

4

Bảng 3.12. Kích thước các phân


8116
2886
1039

Mẫu

pK7

* Thiết kế vector RNAi bằng kỹ thuật Gatewway
Sau khi thực hiện phản ứng tái tổ hợp và biến nạp vào vi khuẩn, các khuẩn
lạc phát triển trên môi trường kháng sinh sẽ được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi
của đoạn gen. Kết quả đã thu được phân đoạn DNA ở vị trí 500 bp (ORF2-4+CP)
và 450 bp (CP), phù hợp với kích thước tính toán (Hình 3.14). Điều này cho thấy
có gen mục tiêu hiện diện trong các dòng vi khuẩn được chọn lọc. Pasmid tái tổ
hợp cũng được kiểm tra bằng cách cắt với enzyme XbaI và HindIII. Nếu gen
được chèn vào đúng trên vector, phản ứng cắt sẽ cho ba phân đoạn DNA (Bảng
3.12). Kết quả đã thu được các phân đoạn DNA 8116 bp, 2850 bp, 1003 bp
(pK7GWIWG2(II)/CP) và 8116 bp, 2886 bp, 1039 bp (pK7GWIWG2(II)/ORF24+CP), cho thấy gen mục tiêu đã chèn vào đúng cấu trúc (Hình 3.15).
L

1

2

3

4

5


18
(4, 5). pK7GWIWG2(II)/ORF24+CP.


vector) và 50 mg/l rifamycin (sàng lọc vi khuẩn) (Hình 3.16). Như vậy, quá
trình biến nạp đã thành công và những dòng khuẩn lạc thu được đều mang
vector mục tiêu.
3.4. TẠO CÂY LAN MANG CẤU TRÚC RNAi
3.4.1. Chuyển cấu trúc RNAi vào PLBs bằng A. tumefaciens
* Giai đoạn đồng nuôi cấy
Sau 3 ngày nuôi cấy, PLBs được lây nhiễm và không lây nhiễm đều tăng
trưởng bình thường. Ở các PLBs được lây nhiễm, có sự xuất hiện các vòng
khuẩn trắng bao quanh (Hình 3.17). Điều này cho thấy vi khuẩn đã xâm nhiễm
vào PLBs. Sự phát triển đồng thời của vi khuẩn và PLBs cho thấy quy trình lây
nhiễm đã được thiết lập thành công.
* Giai đoạn khử khuẩn
Sau 7 ngày nuôi cấy, hầu hết PLBs vẫn sống và không còn vòng khuẩn bao
quanh. Đến ngày thứ 14, bên cạnh các PLBs tiếp tục phát triển thành cụm
PLBs, bắt đầu xuất hiện các PLBs chết. Các cụm PLBs còn sống được duy trì
trên môi trường khử khuẩn đến ngày thứ 21 để loại bỏ toàn bộ vi khuẩn (Hình
3.18). Kết quả thu được cho thấy cefotaxime 300 mg/l vừa có khả năng loại
khuẩn vừa duy trì được khả năng sống của PLBs.
3.4.2. Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển
Sau 60 ngày nuôi cấy, hầu hết các cụm PLBs không chuyển gen đều chết.
Một số các cụm PLBs chuyển gen vẫn sống bên cạnh các cụm PLBs chết (Hình
3.19). Các cụm PLBs sống được xem là các mẫu giả định chuyển gen tạm thời,
và được sử dụng cho kiểm tra gen mục tiêu.

1 cm


(4889 RNAi-CP và 3925 RNAi-ORF2-4+CP) được xử lý chuyển gen, chiếm tỷ
lệ 13,99% (Bảng 3.13).
Bảng 3.13. Tỷ lệ PLBs giả định chuyển gen sau giai đoạn sàng lọc kanamycin.
Tổng số P Bs xử lý
ố P Bs thu được
ần
Tỷ lệ %)
chuyển
gen
sau sàng lọc
chuyển
gen

CP

1
2
3
4
Tổng

301
959
2529
1100
4889

ORF24+CP
300
922


93
189
748
203
1233

17,28
11,68
17,99
7,82
14,42

ORF24+CP
13,67
8,35
16,63
12,43
13,45

Tổng
15,47
10,05
17,43
9,95
13,99

3.4.3. Kiểm tra sự hiện diện gen chuyển trong PLBs
Kết quả đã thu được 2 phân đoạn DNA ở vị trí giữa 400-500 bp (CP) và
500 bp (ORF2-4+CP), phù hợp với dự kiến. Các cụm PLBs tương ứng với các


6

7

8

9

10

11 12

L

500bp

500bp

400bp

400bp

Hình 3.20. Kết quả kiểm tra gen CP
trong cụm PLBs giả định chuyển
gen. (1-6). Chuyển gen, (7). Không
chuyển gen, (8). Chứng âm, (9).
Chứng dương, (L). Thang DNA.

Hình 3.21. Kết quả kiểm tra gen

21
12
57,14
Tổng
38
20
52,63

A

B

Hình 3.22. Sự tăng trưởng của PLBs
chuyển gen trên môi trường ½ MS.
(A). Tăng sinh PLBs, (B). Tạo chồi.

Sau 6 tháng, cây lan chuyển gen đã được tạo thành. Có 3 dạng kiểu hình
cây chuyển gen (CP) khác biệt so với bình thường, bao gồm: (1) kiểu hình lá
thuôn dài, xoắn; (2) kiểu hình lá ngắn, dày; (3) kiểu hình lá ngắn, mỏng, mép lá
răng cưa (Hình 3.23). Trong đó, hai dạng kiểu hình lá ngắn tăng trưởng kém,
cây thường bị hoại tử, và chết sau một thời gian nuôi cấy (Hình 3.23-C, D).

A

B

C

D



15

44,52

10,95

Trong đó, kiểu hình (2) có tần suất xuất hiện cao nhất, kế đến là các kiểu
hình: bình thường; (3); và (1). (Bảng 3.15). Sự xuất hiện các kiểu hình khác
thường của cây lan phát triển từ PLBs chuyển gen có thể do việc chèn gen mục tiêu
vào đã tạo ra những thay đổi kiểu hình. Sự hiện diện gen mục tiêu trong cây lan
chuyển gen cũng đã được khẳng định bằng PCR với sự hiện diện của sản phẩm
khuếch đại ở vị trí 400bp (CP) và 500 bp (ORF2-4+CP) (Hình 3.24, 3.25).
1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 L

4+CP trong cây lan chuyển gen. (1-8).

(9). Không chuyển gen, (10). Đối chứng

Chuyển gen. (9). Không chuyển gen,

PCR (phát hiện gen lục lạp), (11). Chứng

(10). Đối chứng PCR, (11). Chứng âm,

âm, (12). Chứng dương. (L). Thang DNA.

(12). Chứng dương. (L). Thang DNA.

21


Kết quả kiểm tra trên tổng số 34 cây chọn ngẫu nhiên cho thấy có 14 cây
mang gen mục tiêu, chiếm tỷ lệ 41,17% (Bảng 3.16). Kết quả này cho thấy quá
trình tạo cây lan mang cấu trúc RNAi đã được thực hiện thành công.
Bảng 3.16. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của
gen mục tiêu trong cây lan phát triển từ PLBs
chuyển gen
A

Cấu trúc
Số cây Số cây Tỷ lệ
gen chuyển kiểm tra có gen (%)
RNAi-CP
25

nhóm có và không có biểu hiện triệu chứng. Các triệu chứng nhiễm virus quan
sát được bao gồm khảm vàng lá, tạo vết (đốm) hoại tử trên lá và hoại tử đi kèm
với biến dạng lá (Hình 3.26). Sau 4 tuần lây nhiễm, các triệu chứng phát triển
trầm trọng hơn (khảm vàng và hoại tử lan rộng gây chết hoàn một số cây) trên
các cây có biểu hiện nhiễm virus (Hình 3.27).
1

A

B

1 cm

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12

L
300 bp


kháng virus của cây lan giả định chuyển
gen sau 3 tuần lây nhiễm virus nhân tạo.
Cấu trúc Tổng số Số cây Tỷ lệ
gen
cây
kháng kháng
chuyển đánh giá virus
%)
RNAi-CP
68
20
29,4
RNAi4
3
75,0
ORF2-4+CP

Tổng số

72

23

31,94

1 cm

1 cm

Hình 3.29. Cây lan Dendrobium