Header Page 1 of 116.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƢỢC

ĐÀO THỊ HỒNG BÍCH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG

THÀNH PHẦN TANSHINON IIA
TỪ CÂY ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza Bunge)
PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM TRA CHẤT LƢỢNG
DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH DƢỢC HỌC

Khóa

: QH.2012.Y

Người hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU TÙNG

Hà Nội - 2017

Footer Page 1 of 116.


Header Page 2 of 116.

LỜI CẢM ƠN

Butanol

2.

CC

Sắc ký cột

3.

DAD

Đầu dò UV (Diode array detector)

4.

EtOAc

Etyl acetat

5.

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High performance Liquid Chromatography)

6.

Hex

12. PL

Phụ lục

13. Rf

Hệ số lưu giữ

14. RSD

Độ lệch chuẩn tương đối

15. SKC

Sắc ký cột

16. TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

17. UV-VIS

Phổ hấp thụ phân tử

18. UV

Tia tử ngoại

19. Φ


1.2.2. Đặc điểm tanshinon IIA .............................................................................7
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG NGHIÊN CỨU ......8
1.3.1. Phương pháp sắc kí cột...............................................................................8
1.3.2. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) .........................................................8
1.3.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ....................................10
1.3.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ................................13
1.3.5. Phương pháp phân tích khối phổ (MS) ....................................................14
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................16
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ...................................16
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ...........................................................................16
2.1.2. Dung môi, hóa chất ..................................................................................16
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu .............................................17
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................................................17
2.2.1. Phương pháp chiết xuất và tinh chế tanshinon IIA từ đan sâm ................17
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc của tanshinon IIA ..................................17
2.2.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất.......................17
2.2.4. Phương pháp phân tích định lượng bằng HPLC ......................................17
2.2.5. Phương pháp phân tích định tính, định lượng mẫu dược liệu đan sâm ...19
2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................19
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................20
3.1. CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ TANSHINON IIA TỪ ĐAN SÂM ..............20
3.1.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu ..............................................................20
3.1.2. Phương pháp phân lập và tinh chế ...........................................................20

Footer Page 4 of 116.


Header Page 5 of 116.

3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC TANSHINON IIA ..................................................22


Trang

Bảng 3.1

Kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

23

Bảng 3.2

Kết quả phân tích độ tinh khiết của tanshinon tinh chế

25

Bảng 3.3

Chương trình gradient trong 45 phút

26

Bảng 3.4

Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

26

Bảng 3.5

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của tanshinon IIA



Header Page 7 of 116.

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình vẽ

Tên hình vẽ, đồ thị

Trang

Hình 1.1 Cây đan sâm

2

Hình 1.2 Cấu trúc một số abietane diterpenoid

3

Hình 1.3 Cấu trúc một số acid phenolic

4

Hình 1.4 Cấu trúc một số triterpenoid có trong đan sâm

5

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA


Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của tanshinon IIA

27

Hình 3.6 Sắc ký đồ của cao chiết mẫu nghiên cứu đan sâm thu hái ở Sapa

30

Footer Page 7 of 116.


Header Page 8 of 116.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ðan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge thuộc họ Bạc
hà (Lamiaceae) là một cây thuốc quý được dùng nhiều trong Đông y trong các bài
thuốc bổ máu và điều trị bệnh tim mạch [21-23]. Gần đây tác dụng chống ung thư
của đan sâm, đặc biệt là của thành phần tanshinon được phát hiện và thu hút sự
quan tâm nghiên cứu trên thế giới [21-23].
Ở nước ta, nghiên cứu về đan sâm đang được quan tâm để phát triển ứng
dụng loại dược liệu quý này trong y học hiện đại. Nghiên cứu của Viện Dược liệu
đã cho thấy cây đan sâm trồng ở Sapa có hàm lượng tanshinon IIA cao bên cạnh
một số thành phần tanshinon khác [15,21]. Gần đây, tác giả Nguyễn Thanh Hải và
cộng sự đã công bố phân lập thêm một số thành phần tanshinon [23] và hai hợp chất
triterpen là acid ursoli và acid 2β-hydroxypomolic [23]. Các kết quả nghiên cứu ban
đầu về tác dụng sinh học và dược lý cho thấy dịch chiết đan sâm có tác dụng chống
đông máu, kết tập tiểu cầu [22]; hợp chất tanshinon IIA có tác dụng ức chế sự phát
triển của nhiều dòng tế bào ung thư phổi PC9 [21].
Theo các tài liệu công bố, tanshinon IIA là thành phần hoạt chất chính và
được sử dụng làm chất đánh dấu để đánh giá chất lượng dược liệu đan sâm như qui

Lá chét dài 2-7,5 cm, rộng 0,8-5 cm. Mép lá chét có răng cưa tù. Mặt trên lá chét
màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh tro, cũng có lông nhưng
dài hơn. Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá thành nhiều múi nhỏ. Cụm hoa mọc
thành chùm ở đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm. Hoa mọc vòng, mỗi vòng
3-10 hoa, thường là 5 hoa. Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, 2 môi, môi trên trông
nghiêng hình lưỡi liềm, môi dưới xẻ 3 thùy, thùy giữa có răng cưa tròn. Hai nhị ở
môi dưới, bầu có vòi dài lòi ra ở môi trên. Quả nhỏ, dài 3 mm, rộng 1,5 mm [1,14].
1.1.2. Phân bố, sinh thái
S. miltiorrhiza được phân bố rộng rãi ở miền Bắc Trung Quốc. Nó cũng có
mặt tại Nhật Bản [31]. Cây đan sâm Việt Nam có nguồn gốc Trung Quốc [1] thích
hợp với đất cát ẩm, được trồng bằng rễ vào mùa xuân [6]. Cây trồng ở trại thuốc Sa
Pa (Viện Dược liệu) tỏ ra thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao.
Cây sinh trưởng phát triển tương đối tốt, ra hoa quả hàng năm, hạt giống thu được
đã gieo đi gieo lại nhiều năm. Một số cây đưa xuống trại thuốc Tam Đảo (Viện
Dược liệu) sinh trưởng kém hơn [1]. Cây trồng tốt nhất vào tháng 2-3 để đến tháng
2

Footer Page 9 of 116.


Header Page 10 of 116.

11-12 thu hoạch [1]. Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo), mùa quả tháng 6-9 [14]. Thu
hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [6].
1.1.3. Thành phần hóa học
Cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học
của đan sâm. Thành phần hóa học chính là acid phenolic, diterpenoid, flavonoid và
một số thành phần khác. Bộ phận trên mặt đất của có chứa flavonoid, triterpenoid
và monoterpenoid đặc biệt là trong hoa và lá. Trong khi đó, diterpenoid và acid
phenolic lại được tìm thấy chủ yếu ở rễ [28].

R = R1 = H, Δ5(10),6(7)

19-21.Tanshinon I, II, III

24. Isocryptotanshinon

22-23. Isotanshinon I, II

25. Cryptotanshinon

Hình 1.2. Cấu trúc một số abietane diterpenoid
b. Các dẫn xuất của acid phenolic
Các acid phenolic là thành phần chính trong nhóm chất tan được trong nước
của đan sâm. Thành phần chính của nhóm này là acid rosmarinic và các acid
salvianolic từ A - K [35].

3

Footer Page 10 of 116.


Header Page 11 of 116.

Hình 1.3. Cấu trúc một số acid phenolic
c. Flavonoid
Thành phần có mặt nhiều nhất chính là flavon, flavonol và các dẫn xuất của
chúng [35].
- Flavon và aglycon flavon: thành phần chính là apigenin (5,7,4’-trihydroxyflavon)
và luteolin (5,7,3’,4’- tetrahydroxyflavon) và các dẫn xuất 6- hydroxylat của chúng.
- Flavon và flavonol glycosid: các flavon O-glycosid xuất hiện phổ biến trong các

- Làm giãn mạch vành, chống huyết khối, chống thiếu máu cục bộ. Các tác
dụng này do các thành phần tanshinon IIA, acid rosmarinic, danshensuan B, acid
salvinolic B, militron và salvinon. Ngoài ra, đan sâm còn được chứng minh có tác
dụng chống đau thắt ngực [1-2,14,21,25,29].
- Tác dụng làm hạ đường huyết do có chứa thành phần là acid polyphenolic [25].
- Rễ đan sâm có tác dụng hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở
tế bào [2,10].
- Tác dụng an thần do thành phần miltiron nên được sử dụng điều trị chứng
mất ngủ [7,10].
- Dịch chiết đan sâm có tác dụng chống vi khuẩn, kể cả vi khuẩn
Staphylococus kháng thuốc. Các thành phần như dihydrotanshinon I,
hydroxytanshinon II-A, cryptotanshinon, methyl tanshinat và tanshinon II-B được
chứng minh có tác dụng chống vi khuẩn Staphylococus aureus [10,12,21,36].

5

Footer Page 12 of 116.


Header Page 13 of 116.

- Chống nấm, tốt cho trường hợp nấm ngoài da, mụn trứng cá, rụng tóc,
ngứa và mày đay [10].
- Hoạt tính chống viêm do có thành phần tanshinon IIA có tác động trên hệ
miễn dịch [11].
- Hoạt tính chống oxy hóa gây bởi dihydrotanshinon I [2], acid salvinolic A,
B, acid rosmarinic [1], và các chất thuộc nhóm polysaccarid [12].
- Mang lại lợi ích cho bệnh nhân suy thận mạn tính [2].
- Tanshinon IIA còn có tác dụng chống ung thư [10-11].
- Đan sâm có tác dụng làm mềm và thu nhỏ thể tích của gan và lá lách khi

vú [1,2].
- Đan sâm còn được dùng để điều trị các bệnh viêm gan, xơ gan, suy thận
mạn tính, tiểu đường và các biến chứng của tiểu đường [2].
Liều dùng: 8-20g [3].
Chú ý: không dùng chung với Lê lô [6].
1.2. Tổng quan về tanshinon IIA
Trong chuyên luận Dược điển của nhiều nước bao gồm Trung Quốc, Anh và
Việt Nam, tanshinon IIA là một trong những chất chính được dùng để định tính, có
thể định lượng dược liệu đan sâm và cao đan sâm [7][24][34].
1.2.1. Cấu trúc hóa học

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của tanshinon IIA
- Tên IUPAC:
1,6,6-trimethyl-8,9-dihydro-7H-naphthol[1,2-g][1]benzofuran-10,11-dion.
- Công thức phân tử: C19H18O3
- Khối lượng phân tử: 294,3444g/mol
1.2.2. Đặc điểm tanshinon IIA
- Là bột màu đỏ, rất ít tan trong nước (0,0042 mg/l ở 25oC), tan tốt trong các
dung môi hữu cơ nhất là các dung môi kém phân cực trong methanol (5 mg/ml),
ethanol (5mg/ml) ở 25oC, EtOAc và dimethyl sulfoxit (25mg/ml) [27].
- Tanshinon IIA thuộc nhóm diterpenoid có khung terpenoid, ngoài ra trong
phân tử còn có nhóm lacton và xeton. Tính chất hóa học của tanshinon IIA có đầy

7

Footer Page 14 of 116.


Header Page 15 of 116.



8

Footer Page 15 of 116.


Header Page 16 of 116.

tách riêng từng thành phần trong hỗn hợp phân tích. Các thành phần sau khi được
phân tách riêng biệt khỏi hỗn hợp được lưu giữ trên pha tĩnh.
Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu các
chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bước sóng 254 nm, 366 nm
hoặc phun thuốc thử hiện màu, hoặc quét lên bề mặt bản mỏng thiết bị
densitometer, một thiết bị đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến của
chất cần phân tích… Tuỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng
một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích.
- Các đại lượng đặc trưng
+ Hệ số lưu giữ Rf
Đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ số
lưu giữ Rf. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất
phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

R

f

d
d

=

Header Page 17 of 116.

1.3.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
a. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
- Nguyên tắc
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp sắc ký tách các chất ra khỏi
hỗn hợp phân tích trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một
chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay
một chất mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký
lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ.
- Một số thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

Hình 1.6. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng
 Thời gian lưu :
- tR: (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ
thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.
- t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống
sắc ký
- tR’(Thời gian lưu thực): tR’= tR – t0
- (Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất
nhất định khi tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định).
- W : là chiều rộng đáy pic.
- W1/2 : là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic.
 Hệ số dung lượng k’:

10

Footer Page 17 of 116.



sự phân bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân bằng. Mỗi tầng được giả
định như một pha tĩnh có chiều cao H.
R
N  16  tW



2

Hoặc




1/2 

N  5,54  Wt R


2

Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính
bằng công thức:

H

L
N

 Hệ số bất đối AF (tailing factor):

N  α  1  k'B 





4  α  1  k'B 
WB  WA
W1/2B  W1/2A

- Độ phân giải cơ bản đạt được khi RS = 1,5 khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ
ràng, chỉ xen phủ nhau 0,3 %
Rs = 1,0: Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4 %
RS = 0,75: Hai pic chưa tách nhau
b. Ứng dụng của phương pháp HPLC:
 Định tính:
Dựa vào thời gian lưu, hình dáng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hoặc chồng
phổ của pic thử và pic chuẩn để định tính chất thử.
 Xác định tạp chất:
Dùng để kiểm tra tạp chất trong mẫu, trên sắc ký đồ không có pic tại thời
gian lưu của tạp chất (dùng chất đối chiếu) khi chạy sắc ký trong cùng điều kiện.
 Định lượng:
Dựa trên nguyên tắc nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích
pic của nó. Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng:
- Phương pháp chuẩn ngoại
- Phương pháp chuẩn nội
- Phương pháp thêm chuẩn

12


mau

: là độ dịch chuyển hoá học
: tần số của mẫu phân tích

TMS

:

may

: là tần số làm việc của máy

là tần số của mẫu chuẩn tetramethylsilane

 Hằng số tương tác spin
Khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu bội được biểu hiện bằng Hz, đặc
trưng cho sự tương tác spin gọi là hằng số tương tác spin (J). Trị số J phụ thuộc vào
tương quan không gian và mật độ điện tử ở vùng lân cận của 2 proton tương tác.
 Diện tích dưới tín hiệu

13

Footer Page 20 of 116.


Header Page 21 of 116.

Diện tích dưới tín hiệu tỷ lệ với số lượng proton cho tín hiệu đó. Đường
cong tích phân diện tích dưới tín hiệu cho biết số lượng tương đối của proton


Footer Page 21 of 116.


Header Page 22 of 116.

Phân tích định lượng khối phổ tương tự như các kỹ thuật khác dùng cách
thiết lập đường chuẩn hoặc thêm đường chuẩn cùng với đo cường độ vạch phổ để
xác định nồng độ [20].

15

Footer Page 22 of 116.


Header Page 23 of 116.

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
Rễ đan sâm sử dụng để nghiên cứu chiết tách được thu hái tại Sapa (Lào Cai)
tháng 9/2016 và được TS. Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện
Dược liệu giám định tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge, họ Bạc hà
(Lamiaceae). Tiêu bản của mẫu nghiên cứu (DS2016.01) được lưu tại Viện Dược
liệu và Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Hình 2.1. Một số hình ảnh cây đan sâm ở huyện Bắc Hà, tỉnh Lào Cai.
2.1.2. Dung môi, hóa chất
Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập như ethanol (EtOH), methanol
(MeOH), n-hexan, dicloromethan (CH2Cl2), chloroform (CHCl3), ethyl acetat

40oC và 4 giờ/lần, cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cao.
- Hòa tan cao và chiết phân bố lỏng-lỏng, cất loại dung môi ở các phân đoạn,
chạy sắc ký cột, phân lập được chất.
2.2.2. Phƣơng pháp xác định cấu trúc của tanshinon IIA
Trên cơ sở các số liệu đã được công bố trong tài liệu tham khảo, hợp chất
được xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp hóa lý gồm:
- Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân NMR.
- Phương pháp phổ khối ESI-MS.
2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất
Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất dựa vào phương pháp sắc ký: sắc
ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
2.2.4. Phƣơng pháp phân tích định lƣợng bằng HPLC
a. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký

17

Footer Page 24 of 116.


Header Page 25 of 116.

Dùng phương pháp HPLC pha đảo để tách, định tính, định lượng tanshinon
trong rễ đan sâm. Cụ thể, khảo sát các điều kiện sắc lý như nhau:
- Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo.
- Pha động: Qua tham khảo tài liệu, khảo sát các loại pha động với thành
phần, tỉ lệ, tốc độ dòng khác nhau.
- Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 3 loại detector UV,
FLD, DAD để đảm bảo vừa phát hiện được chất phân tích, vừa tiện lợi cho quá
trình phân tích và phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất.