BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

NGUYỄN VĂN HUY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN NPM1 VÀ
FLT3 Ở BỆNH NHÂN LƠ XÊ MI CẤP DÒNG TỦY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2011 – 2015

HÀ NỘI - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN VĂN HUY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN NPM1 VÀ
FLT3 Ở BỆNH NHÂN LƠ XÊ MI CẤP DÒNG TỦY

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2011 – 2015

Người hướng dẫn khoa học:



Nguyễn Văn Huy


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, do nỗ lực
của bản thân dưới sự hướng dẫn tận tình của ThS. Nguyễn Vũ Bảo Anh. Các
số liệu, kết quả được trình bày trong nghiên cứu này là trung thực do tôi thu
thập tỷ mỉ và chính xác tại Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương.
Kết quả nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ tài liệu nào
khác. Nghiên cứu chỉ nhằm mục đích khoa học, không nhằm mục đích riêng
nào khác.
Hà Nội, ngày 25 tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Văn Huy


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 2
1.1. LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ GỌI TÊN LƠ XÊ MI CẤP ...................... 2
1.2. CƠ CHẾ BỆNH SINH LƠ XÊ MI CẤP ............................................... 2
1.2.1. Sinh tế bào máu bình thường và LXMc ......................................... 2
1.2.2. Sự liên quan giữa hệ thống gen trong tế bào với ung thư............... 3
1.2.3. Cơ chế tổn thương phân tử dẫn đến LXMc ................................... 3
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ XẾP LOẠI LXMc ........... 5

FLT3-TKD theo giới .................................................................... 25
3.2.3. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và
FLT3-TKD theo nhóm tuổi .......................................................... 26
3.2.4. Tỷ lệ đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD theo
xếp loại FAB................................................................................. 27
3.3. ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ HUYẾT HỌC Ở BỆNH NHÂN CÓ
CÁC ĐỘT BIẾN GEN NPM1-MUTA, FLT3-ITD VÀ FLT3-TKD ..... 28
3.3.1. Đặc điểm lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân có đột biến gen
NPM1-mutA ................................................................................. 28
3.3.2. Đặc điểm lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD... 30
3.3.3. Đặc điểm lâm sàng và huyết học ở bệnh nhân có đột biến gen
FLT3-TKD.................................................................................... 32
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 34
4.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA NHÓM NGHIÊN CỨU ......................... 34


4.1.1. Đặc điểm về tuổi ........................................................................... 34
4.1.2. Đặc điểm về giới ........................................................................... 34
4.1.3. Đặc điểm phân bố thể bệnh của bệnh nhân theo xếp loại FAB .... 35
4.2. ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN NPM1-MUTA, FLT3-ITD VÀ FLT3TKD CỦA NHÓM BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU ............................... 35
4.2.1. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và
FLT3-TKD trong nhóm nghiên cứu ............................................. 35
4.2.2. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD, FLT3TKD theo giới ............................................................................... 36
4.2.3. Tỷ lệ bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và
FLT3-TKD theo nhóm tuổi .......................................................... 37
4.2.4. Tỷ lệ bệnh nhân có đột pbiến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD, FLT3TKD theo xếp loại FAB ............................................................... 37
4.3. ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ HUYẾT HỌC CỦA BỆNH NHÂN CÓ
ĐỘT BIẾN GEN NPM1-MUTA, FLT3-ITD, FLT3-TKD .................... 38
4.3.1. Đặc điểm lâm sàng và huyết học của bệnh nhân có đột biến gen
NPM1-mutA ................................................................................. 38


Hb

: Hemoglobin (Huyết sắc tố)

ITD

: Internal Tandem Duplication (Đột biến lặp đoạn liên tục)

LXMc

: Lơ xê mi cấp

MPO

: Myeloperoxydase

NPM1

: Nucleophosmin 1

NST

: Nhiễm sắc thể

PAS

: Periodic – Acid - Schiff

SLBC

FLT3-TKD theo nhóm tuổi........................................................... 26
Bảng 3.4: Tỷ lệ đột biến gen NPM1-mutA, FLT3-ITD và FLT3-TKD theo
xếp loại FAB ................................................................................. 27
Bảng 3.5: Đặc điểm tế bào học ở bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA ...... 29
Bảng 3.6: Đặc điểm tế bào học ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD ..... 31
Bảng 3.7: Đặc điểm tế bào học ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-TKD ... 33
Bảng 4.1: Tỷ lệ LXMc dòng tủy theo xếp loại FAB của một số tác giả ....... 35


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Phân bố giới tính của nhóm nghiên cứu .................................... 24
Biểu đồ 3.2: Phân bố bệnh nhân theo xếp loại FAB ...................................... 24
Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ bệnh nhân nam và nữ có đột biến gen NPM1-mutA, FLT3ITD và FLT3-TKD .................................................................... 25
Biểu đồ 3.4: Đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân có đột biến gen NPM1-mutA .... 28
Biểu đồ 3.5: Đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-ITD .... 30
Biểu đồ 3.6: Đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân có đột biến gen FLT3-TKD .. 32

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Vị trí của gen NPM1 trên NST ..................................................... 11
Hình 1.2: Vị trí của gen FLT3 trên NST....................................................... 12
Hình 2.1: Kết quả điện di trên gel của gen NPM1 ........................................ 21
Hình 2.2: Kết quả điện di trên gel của gen FLT3-ITD ................................. 21
Hình 2.3: Kết quả điện di trên gel của gen FLT3-TKD................................ 21

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1: Các bước tiến hành nghiên cứu .................................................... 22


1


FLT3.


2

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.LỊCH SỬ PHÁT HIỆN VÀ GỌI TÊN LƠ XÊ MI CẤP
Năm 1827, Velpeau thông báo ca bệnh đầu tiên. Năm 1845, Bennett đã
đặt tên cho bệnh là “leucocythemia” (tăng bạch cầu).
Năm 1856, nhà sinh lý bệnh người Đức Virchow đã dùng kính hiển vi
quang học để soi tiêu bản máu bệnh nhân và ông đã thấy bạch cầu ở những
bệnh nhân này tăng rất cao làm máu trắng như sữa. Virchow gọi bệnh này là
“leukemia” (theo tiếng Hy lạp là bệnh máu trắng) hay tiếng Việt gọi là Lơ xê
mi, tên gọi này được sử dụng cho đến hiện nay.
Năm 1877, nhờ vào phát minh nhuộm tiêu bản máu, Ehrlich đã phân biệt
được những dạng khác nhau của bạch cầu.
Năm 1889, Ebstein đã dùng thuật ngữ “acute leukemia” (lơ xê mi cấp)
để chỉ tình trạng bệnh tiến triển cấp tính. Năm 1900, Naegeli đã chia lơ xê mi
cấp thành dòng tủy và dòng lympho. Schilling đã phát hiện bệnh tổn thương
đơn dòng mono năm 1913. Vào năm 1957, Gillestad đã mô tả bệnh lơ xê mi
cấp tiền tủy bào lần đầu tiên.
Đến nay, bằng các phương pháp hình thái học và hóa học tế bào, miễn
dịch, di truyền chúng ta đã hiểu rõ và có cái nhìn cụ thể về bệnh lơ xê mi cấp.
1.2. CƠ CHẾ BỆNH SINH LƠ XÊ MI CẤP
1.2.1. Sinh tế bào máu bình thường và LXMc
Bằng các nghiên cứu thực nghiệm in vivo và nuôi cấy tế bào in vitro,
người ta phát hiện rằng tạo máu là một quá trình tăng sinh và biệt hóa, bắt
nguồn từ tế bào gốc vạn năng tạo ra các tế bào máu đa năng rồi tới tế bào máu
đầu dòng cho từng dòng [5]. Tế bào gốc được biệt hóa theo dòng nào là do



4

Những gen này truyền tín hiệu kích thích phát triển tế bào thông qua
receptor tyrosin kinase kích hoạt phosphoryn hóa làm cho tế bào tăng sinh.
Do đột biến, gen này trở thành gen ung thư làm thay đổi hình thể protein dẫn
đến thay đổi chức năng của chúng. Một số gen hoạt động theo con đường này
là BCR-ABL, c-Kit, FLT3. Gen này có vai trò trong sự tiến triển thành LXMc
chứ không có vai trò trong biến đổi ác tính tiên phát [6].
 Tổn thương các gen hoạt hóa sự sao chép
Các gen Ig lymphocyte B và gen receptor lymphocyte T: khi các tế bào
T và B chưa trưởng thành, thường có hiện tượng xoắn hai chuỗi đơn của
ADN lại để tạo ra các protein đa dạng, có khả năng gắn với các protein lạ (các
Ig và các receptor tế bào T). Quá trình này dễ bị sai lạc và nếu sai lạc xảy ra ở
các proto - oncogene thì có thể dẫn đến tăng sinh ác tính [8].
 Tổn thương gen liên quan đến quá trình tế bào chết theo chương trình
Nhiều loại tế bào được lập trình trước bởi các gen đặc biệt để biệt hóa rồi
chết sau đó qua một thời gian sống nhất định. Khi các gen này bị tổn thương,
tế bào tiếp tục được sinh ra nhưng không già và chết đi như bình thường đã
lập trình trước, nên sẽ ứ đọng lại và gây mất cân bằng. Hai gen tổng hợp
protein tyrosin kinase và protein P53 tác động theo cơ chế này [6], [8].
 Hoạt hóa oncogene ở bệnh máu ác tính
Có nhiều mối liên quan rõ ràng giữa sự hoạt hóa các oncogene hoặc sự
bất hoạt các anti-oncogene với sự tăng sinh và biệt hóa tế bào. Nếu chỉ có sự
hoạt hóa của một oncogene thì chưa đủ điều kiện dẫn tới chuyển dạng ác tính.
Cần có sự phối hợp của nhiều oncogen hoặc sự biến đổi anti-oncogene mới
làm các tế bào bình thường chuyển thành ác tính. Cơ chế chuyển dạng ác tính
gồm 4 dạng chính sau [9]:
 Chuyển đoạn và cấu trúc lại NST:

6

Bằng phương pháp nhuộm giêmsa tiêu bản máu ngoại vi và tiêu bản tủy
xương, dựa vào hình thái tế bào để xác định tỷ lệ tế bào blast, ngoài ra ta có
thể nhận biết một số khác biệt giữa các dòng tế bào ác tính.
1.3.2. Phương pháp hóa học tế bào
Từ những năm 1940 - 1970, các phát hiện về rối loạn chuyển hóa đặc
trưng cho từng dòng tế bào đã được vận dụng để hình thành các phương pháp
nhuộm hóa học tế bào, các phương pháp phổ biến hiện nay đang sử dụng cho
xếp loại LXMc như: nhuộm Myeloperoxydase (MPO), Sudan đen, Periodic
Acid - Schiff (PAS), Esterase không đặc hiệu có và không có ức chế bằng
NaF, Esterase đặc hiệu [13], [14].
Kỹ thuật nhuộm MPO dựa trên nguyên lý là các tế bào hạt dòng tủy và
mono có chứa men MPO có tác dụng oxy hóa các cơ chất như gốc phenol,
một số acid thơm và acid amin. Các tế bào hạt dòng tủy cho phản ứng dương
tính, dòng mono có thể dương tính ở mức độ thấp riêng dòng lympho thì hoàn
toàn âm tính.
Phương pháp nhuộm Sudan đen sử dụng Sudan đen là chất tan trong
lipid nhằm phát hiện các hạt lipid trong tế bào. Kết quả nhuộm Sudan đen
dòng bạch cầu hạt dương tính mạnh nhất, dòng mono dương tính ở các mức
độ khác nhau còn dòng lympho thường âm tính. Trên cùng một tế bào thì mức
độ dương tính của Sudan đen thường mạnh hơn MPO nhưng thường có sự
song hành kết quả giữa hai phương pháp này [13].
Phương pháp nhuộm PAS là sử dụng Periodic Acid - Schiff để nhuộm
glycogen, các tế bào máu có sự phân bố glycogen khác nhau trong bào tương.
Nhuộm PAS cho kết quả thường âm tính với các tế bào dòng bạch cầu hạt và
mono nhưng lại dương tính mạnh với dòng lympho [14].
Nhuộm Esterase không đặc hiệu được sử dụng trong chẩn đoán LXMc
dòng mono vì các tế bào thuộc dòng mono cho phản ứng dương tính mạnh và bị




8

LXMc được chia làm 2 nhóm bệnh là LXMc dòng tủy và LXMc
dòng lympho. LXMc dòng lympho có 3 thể: L1, L2, L3; dòng tủy có 8 thể
từ M0 đến M7.
Bảng 1.1: Xếp loại LXMc dòng tủy theo FAB có bổ sung
Thể Đặc điểm hình thái, hóa học tế bào

Dấu ấn miễn dịch

Tế bào non chưa biệt hóa ≥ 90% các tế bào
M0 có nhân không thuộc dòng hồng cầu,

CD34+

không có thể Auer, < 3% MPO+
Tế bào non chưa biệt hóa ≥ 90% các tế bào
M1 có nhân không thuộc dòng hồng cầu, hiếm

HLA-DR, CD13,
CD33, CD15, CD11±

thể Auer, > 3% MPO+
Tế bào non chưa biệt hóa < 90% các tế bào
M2 có nhân không thuộc dòng hồng cầu, nhiều
thể Auer
M3



≥ 30% tế bào tiền thân dòng mẫu tiểu cầu

* Xếp loại LXMc theo WHO 2008

HLA-DR, CD61,
CD42, CD34±, CD33±


9

Năm 2001, WHO đã đưa ra bảng xếp loại mới cho LXMc dòng tủy dựa
trên đặc điểm tế bào di truyền, miễn dịch và bất thường di truyền ở mức độ
NST và gen. Năm 2008 được cập nhật bổ sung.
WHO đưa ra tiêu chuẩn chẩn đoán LXMc với tỷ lệ blast ≥ 20% tế bào
có nhân trong tủy.
Bảng 1.2: Xếp loại LXMc dòng tủy theo WHO 2008
1. LXMc dòng tủy có những bất thường vật chất di truyền tái diễn:
 LXMc dòng tủy với t(8;21)(q22;q22): gen AML1/ETO
 LXMc dòng tủy với inv(16)(p13.1;q22): gen CBFβ/MYH11
 LXMc tiền tủy bào với t(15;17)(q22;q12): gen PML/RARα
 LXMc dòng tủy với t(9;11)(q22;q23): gen MLLT3/MLL
 LXMc dòng tủy với t(6;9)(q23;q34): gen DEK/NUP214
 LXMc dòng tủy inv(3)(q21;q26.2): gen RPN1/EVI1.
 LXMc dòng tủy (dòng mẫu tiểu cầu) với t(1;22)(p13;q13): gen
RBM15 - MKL1
 LXMc dòng tủy có biến đổi gen NPM1
 LXMc dòng tủy có biến đổi gen CEBPA
2. LXMc dòng tủy có có liên quan đến hội chứng rối loạn sinh tủy (MDS
hoặc MPD/MDS)

vào các yếu tố tiên lượng quan trọng của LXMc dòng tủy, hay gặp nhất là các
gen sau: NPM1, FLT3, CEBPA, MLL, NRAS [19].
1.4.1. Đột biến gen NPM1 (Nucleophosmin 1)
Gen NPM1 nằm trên NST số 5q35.1 bao gồm 12 exon mã hóa 259 acid
amin. Đột biến gen NPM1 lần đầu tiên được báo cáo bởi Falini và cộng sự
năm 2005 [2], [3].


11

Hình 1.1: Vị trí của gen NPM1 trên NST
NPM1 có rất nhiều vai trò như tham gia vào quá trình phân bào, tháo
xoắn ADN, dịch mã kết hợp với riboxom tham gia tổng hợp protein và sửa
chữa ADN. Ở các tế bào bình thường, NPM1 là một phosphoprotein trong
nhân tế bào và hoạt động như một yếu tố điều hòa chu trình tế bào và con
đường ức chế khối u (ARF)/TP53.
Đột biến gen NPM1 hay gặp nhất là ở exon 12 (thêm 4 nucleotid TCTG)
là đột biến NPM1-mutA. Kết quả là protein đột biến NPM1 không tồn tại
trong nhân tế bào nữa mà xuất hiện ở trong bào tương tế bào. Có thể phát hiện
được protein NPM1 trong bào tương bằng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch.
Đột biến gen NPM1 là một biến đổi về vật chất di truyền hay gặp nhất ở
LXMc dòng tủy. Đột biến này gặp khoảng 50% ở bệnh nhân LXMc dòng tuỷ
có kiểu hình NST bình thường và thường xuất hiện ở bệnh nhi 2-8% [3].
Đột biến gen NPM1 thường phối hợp với một số đột biến gen khác: 40%
các bệnh nhân có NPM1 thường có phối hợp đột biến gen FLT3 (cả ITD và
TKD), có tới 60% kèm theo đột biến gen FLT3-ITD; có thể đi kèm với một số
bất thường NST hay gặp là +4, -Y, del(9q) và một số ít t(8,21), inv(16), t(15,17),
11q23/MLL; rất hiếm xuất hiện cùng đột biến gen CEBPA. Một số các nghiên
cứu lớn với những bằng chứng rõ ràng đã chỉ ra rằng nhóm bệnh nhân có đột
biến gen NPM1 có tiên lượng tốt hơn hẳn nếu không có đột biến gen FLT3-ITD



13

rằng bệnh nhân LXMc dòng tủy có đột biến gen FLT3-ITD có tiên lượng xấu
ở cả người lớn lẫn trẻ em, hiệu quả điều trị thấp, tỷ lệ tái phát cao và thời gian
sống chung ngắn hơn nhóm không có FLT3-ITD. Trong khi đó, ảnh hưởng
của đột biến gen FLT3-TDK lên điều trị và tiên lượng còn gây nhiều tranh cãi
và cần thêm nhiều nghiên cứu lớn khác để đánh giá tác động của đột biến này
trên LXMc dòng tủy. Khác với đột biến NPM1, đột biến gen FLT3 có thể
thay đổi giữa thời điểm chẩn đoán và tái phát, với khoảng 9% bệnh nhân sẽ
mất đột biến FLT3-ITD. Thêm nữa chiều dài của gen FLT3-ITD cũng có sự
thay đổi giữa các thời điểm chẩn đoán và tái phát, chính vì thế mà người ta
không thể sử dụng đột biến FLT3-ITD làm một marker trong theo dõi bệnh
tồn dư tối thiểu ở những bệnh nhân này [4], [20]
1.4.3. Một số đột biến gen khác
 Đột biến gen CEBPA (CCAAT/Enhancer Binding Protein, Alpha)
Gen CEBPA nằm trên NST số 19q13.11. Gen CEBPA là một yếu tố
phiên mã có tác dụng điều hòa những gen tham gia quá trình biệt hóa dòng
tủy, đặc biệt là dòng bạch cầu hạt và tế bào tiền thân dòng tủy. Có hai loại đột
biến gen CEBPA trong LXMc dòng tủy. Một loại ảnh hưởng đến vùng Nterminal, một loại ảnh hưởng đến vùng C-terminal. Đột biến gen CEBPA xuất
hiện ở 9% bệnh nhân LXMc dòng tủy nói chung và 70% trường hợp có kiểu
hình NST bình thường. Về hình thái học tế bào thì LXMc dòng tủy thể M1 và
M2 là hay gặp đột biến này nhất. Một số nghiên cứu cho rằng đột biến gen
CEBPA có tiên lượng tốt, nó tương tự như thể có đột biến gen NPM1 không
phối hợp với FLT3-ITD [19], [21]. Tuy nhiên vẫn chưa xác định được rõ là
tiên lượng của những bệnh nhân có đột biến gen CEBPA như thế nào nếu có
phối hợp đột biến gen FLT3.
 Đột biến gen MLL (Mixed-Lineage Leukemia)