LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả thu được trong luận án hoàn
toàn trung thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa được ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả luận án

Lê Trung Hiếu


LỜI CẢM ƠN
Luận án này được hoàn thành tại Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học, Đại
học Huế.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS. Trần Thị
Văn Thi là Người đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện tốt nhất
giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Ban Giám Hiệu Trường Đại
học Khoa học, Phòng Đào tạo Sau Đại học Trường Đại học Khoa học, Phòng Đào tạo
Sau Đại học Đại học Huế đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa và Quý Thầy Cô trong
Khoa Hóa đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm
luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Thị Hoài, PGS. TS. Phạm Cẩm
Nam, PGS. TS. Võ Thị Mai Hương, TS. Hồ Việt Đức và NCS. Lê Lâm Sơn đã
giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên
tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn !
Thừa Thiên Huế, ngày…tháng…năm 2017
Tác giả luận án


2.4.2. Thiết bị ................................................................................................... 40
2.5. Phương pháp chiết cao toàn phần và các cao phân đoạn ............................. 40
2.5.1. Nguyên tắc: chiết rắn lỏng hoặc chiết lỏng - lỏng ................................. 40
2.5.2. Thực nghiệm .......................................................................................... 41
2.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa....................................... 42
2.6.1. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa hóa học ........................................... 42
i


2.6.2. Phương pháp chống oxy hóa sinh học ................................................... 44
Thực nghiệm được thực hiện ở Phòng thử nghiệm sinh học - Viện Công nghệ
sinh học, Viện hàm lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam. .............................. 44
2.6.3. Phương pháp hóa học tính toán để xác định khả năng chống oxy hóa 48
2.7. Phương pháp xác định hàm lượng tổng các hợp chất phenol và flavonoid . 48
2.7.1. Hàm lượng tổng các hợp chất phenol .................................................... 48
2.7.2. Xác định hàm lượng tổng flavonoid ...................................................... 49
2.8. Phương pháp phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc các cấu tử ............. 49
2.8.1. Phương pháp phân lập và tinh chế các cấu tử ....................................... 49
2.8.2. Quy trình phân lập các hợp chất ............................................................ 50
2.8.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các cấu tử ...................... 59
2.9. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để phân tích hàm lượng
các hợp chất trong các loài dược liệu .............................................................. 59
2.9.1. Nguyên tắc ............................................................................................. 59
2.9.2. Chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký ....................................................... 60
2.9.3. Điều kiện phân tích sắc ký ..................................................................... 60
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 62

3.1. Hoạt tính chống oxy hóa của 7 loài dược liệu .......................................... 62
3.1.1. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao toàn phần ................................... 62
3.1.2. Hàm lượng tổng các hợp chất phenol và hàm lượng tổng flavonoid .... 65

dược liệu ........................................................................................................ 117
3.4.2. Kiểm tra phương pháp định lượng....................................................... 118
3.4.3. Hàm lượng methyl gallate, rutin, quercetin, quercitrin và α-tocopherol .. 122
3.4.4. Mối tương quan giữa hàm lượng 5 hoạt chất chống oxy hóa xác định
bằng phương pháp HPLC với tổng các hợp chất phenol và với tổng các chất
chống oxy hóa ................................................................................................ 124
KẾT LUẬN ............................................................................................................. 126
TÍNH MỚI CỦA LUẬN ÁN .................................................................................. 129
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ........................................................................ 131
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 133

iii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Các loài dược liệu
Ab

A. bauchei

Archidendron bauchei

Ac

A. clypearia

Archidendron clypearia

Hp



Reactive oxygene species

DPPH

1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl

TPC

Tổng hàm lượng các hợp

TFC

Tổng hàm lượng

chất phenol
TAC

flavonoid

Hàm lượng chất chống

TA5C-HPLC Hàm lượng tổng các

oxy hóa quy tương đương

hợp chất chống oxy
hóa xác định bằng

gallic acid


Column Chromatography

Sắc ký cột thường

HPLC

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography
TLC

Thin Layer Chromatography

Sắc ký bản mỏng

Các phương pháp phổ
1

H-NMR

13

C-NMR

APCI-MS

DEPT

COSY

Correlation Spectroscopy

Phổ tương tác hai chiều 1H- 1H

ESI-MS

Electron Spray Ionization Mass

Phổ khối ion hóa phun mù điện

Spectrometry

tử

Heteronuclear Multiple Bond

Phổ tương tác dị hạt nhân qua

Correlation

nhiều liên kết

High Resolution - Electron

Phổ khối phân giải cao ion hóa

Spray Ionization - Mass


Hz
NOESY

Nuclear Overhauser Effect

Phổ NOESY

Spectroscopy
UV

Ultraviolet Spectroscopy

Phổ tử ngoại

δ (ppm)

(ppm = part per million)

Độ dịch chuyển hóa học tính
bằng phần triệu

s

singlet

q

quartet

dt

ED50

Effective dose 50%

Liều lượng hiệu quả ở nồng độ 50%

BDE

Bond dissociation energy

Năng lượng phân ly liên kết

IE

Ionization energy

Năng lượng ion hóa

Mp

Melting point

Điểm chảy

OD

Optical Density

Mật độ quang


Water

GA

Gallic aicd

QU

Quercetin

vi


DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG
Bảng 1.1. Ưu nhược điểm của một số mô hình đánh giá khả năng chống oxy hóa in vitro hóa học .......................................................................................................... 8
Bảng 1.2. 7 loài dược liệu đã qua sàng lọc theo định hướng chống oxy hóa .......... 12
Bảng 1.3. Thành phần hóa học của một số loài trong chi Archidendron ................ 20
Bảng 1.4. Thành phần hóa học một số loài khác trong chi Leea ............................ 23
Bảng 1.5. Thành phần hóa học của một số loài trong chi Microdesmis.................. 24
Bảng 1.6. Thành phần hóa học của một số loài trong chi Pyrostegia ..................... 25
Bảng 1.7. Thành phần hóa học của một số loài trong chi Spilanthes...................... 26
Bảng 1.8. Hoạt tính sinh học của các loài trong y học dân gian ............................. 30
Bảng 1.9. Hoạt tính sinh học của một số loài trong các chi liên quan .................... 30
Bảng 2.1. Tên khoa học, địa điểm lấy mẫu, thời gian lấy mẫu của 7 loài nghiên cứu
.................................................................................................................................. 38
Bảng 2.2. Thông số của quá trình định lượng bằng HPLC ..................................... 60
Bảng 3.1. Khối lượng cao toàn phần và các cao phân đoạn tách chiết từ 7 loài dược liệu
.................................................................................................................................. 62
Bảng 3.2. Hàm lượng chất chống oxy hóa quy tương đương gallic acid trong các
mẫu dược liệu tại nồng độ cao toàn phần 0,5 mg/mL ( p = 0,95; n= 5) .................. 63

................................................................................................................................ 112
Bảng 3.24. Giá trị BDE (O – H) (kcal/mol) của các liên kết trong phân tử methyl
gallate tính toán theo hai phương pháp .................................................................. 114
Bảng 3.25. Năng lượng phân ly liên kết (BDE) của methyl gallate, quercitrin, rutin
và quercetin tính toán theo B3LYP/6-311 ++ G (2d, 2p)// PM6 ........................... 115
Bảng 3.26. Khối lượng cao toàn phần của các mẫu dược liệu (n=3) .................... 117
Bảng 3.27. Thời gian lưu của methyl gallate, rutin,quercetin, quercitrin ............. 119
và α-tocopherol ...................................................................................................... 119
Bảng 3.29. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của quercetin ............................. 120
Bảng 3.30. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của rutin ..................................... 120
Bảng 3.32. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của α-tocopherol ........................ 121
Bảng 3.34. Hàm lượng các hoạt chất trong các mẫu dược liệu ............................. 122
Bảng 3.35. Hệ số tương quan giữa các thành phần có hoạt tính chống oxy hóa .. 124

viii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây Cổ ướm (A. bauchei) ....................................................................... 13
Hình 1.2. Cây Mán đỉa (A. clypearia) ....................................................................... 15
Hình 1.3. Cây Chùm gởi (H. parasitica)................................................................. 16
Hình 1.4. Cây Gối hạc (L. rubra) ............................................................................ 17
Hình 1.5. Cây Chanh ốc (M. caseariaefolia) .......................................................... 18
Hình 1.6. Cây Rạng đông (P. venusta) .................................................................... 19
Hình 1.7. Cây Cúc nút áo (S. oleracea) ................................................................... 20
Hình 2.1. Ảnh chuột thí nghiệm. ............................................................................. 44
Hình 2.2. Sơ đồ phân lập từ hợp chất số 1 đến 4. ................................................... 51
Hình 2.3. Sơ đồ phân lập từ hợp chất số 5 đến 8. ................................................... 54
Hình 2.4. Sơ đồ phân lập từ hợp chất số 9 đến 12. ................................................. 56
Hình 2.5. Sơ đồ phân lập từ hợp chất số 13 đến 16. ............................................... 58

Hình 3.17. Phổ HMBC của hợp chất số 4. .............................................................. 88
Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất số 4: oleanolic acid. ............................. 89
Hình 3.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất số 5: daucosterol. ................................. 90
Hình 3.20. Cấu trúc của hợp chất số 6: methyl gallate. .......................................... 91
Hình 3.21. Cấu trúc của hợp chất số 7: quercetin. .................................................. 92
Hình 3.22. Cấu trúc của hợp chất số 8: rutin........................................................... 95
Hình 3.23. Cấu trúc hóa học của hợp chất số 9: α-tocopherol. ............................... 97
Hình 3.24. Tương tác HMBC của hợp chất số 10. .................................................. 98
Hình 3.25. Cấu trúc hóa học của số 10: betulinic acid. .......................................... 99
Hình 3.26. Cấu trúc hóa học của hợp chất số 11: -spinasterone. ........................ 101
Hình 3.27. Cấu trúc hóa học của hợp chất số 12: stigmasterol. ............................ 101
Hình 3.28. Cấu trúc hoá học của hợp chất số 13: 1-octacosanol. ......................... 102
Hình 3.29. Cấu trúc hoá học của hợp chất số 14: docosenoic acid. ...................... 103
Hình 3.30. Phổ HMBC của hợp chất số 15. .......................................................... 105
Hình 3.31. Cấu trúc hoá học của hợp chất 15: quercetin 3-O--Lrhamnopyranoside. ................................................................................................. 105
Hình 3.32. Tương tác HMBC chính của quercetin 3-O--L-rhamnopyranoside. 106
Hình 3.33. Cấu trúc hoá học của hợp chất số 16: 7-O-Galloyltricetiflavan. ........ 107
Hình 3.34. Tương tác HMBC và COSY chính của 7-O-galloyltricetiflavan........ 108
Hình 3.35. Giá trị IC50 của các cấu tử phân lập được so với chất đối chứng
curcumin. ............................................................................................................... 111
Hình 3.36. Đồ thị minh họa tương quan giữa chống oxy oxy hóa bảo vệ gan in
vitro và bắt gốc tự do DPPH (a): nồng độ 20 µg/mL; (b): nồng độ 100 µg/mL. .. 113
Hình 3.37. Các cấu trúc hình học của methyl gallate. .......................................... 114

x


Hình 3.38. Cấu trúc hình học tối ưu của các hợp chất (15): quercitrin, (8): rutin,
(7): quercetin. ......................................................................................................... 115
Hình 3.39. Sắc ký đồ của methyl gallate, rutin và quercetin. .............................. 118