Header Page 1 of 120.

Bộ y tế
viện dinh dỡng
-------------------------------ZY-----------------------------

báo cáo tổng kết đề tài

xác định d lợng penicillin g và v
trong thực phẩm bằng phơng pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Trần quang thủy

7106
16/02/2009

Hà Nội - 2008
luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 1 of 120.


Header Page 2 of 120.

MỞ ĐẦU
An toàn vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong công tác bảo vệ sức
khoẻ con người. Trong tiến trình gia nhập WTO, thị trường hàng hoá của Việt nam được
mở rộng, đặc biệt trong lĩnh vực xuất khẩu các mặt hàng nông sản, thuỷ sản. Tuy nhiên,
do việc kiểm soát dư lượng hoá chất kháng sinh có hại đến sức khoẻ người tiêu dùng
chưa được thực hiện nghiêm túc nên một số lô hàng bị thị trường nhập khẩu phát hiện
kháng sinh có hại vẫn còn cao. Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế cho
các doanh nghiệp mà còn ảnh hưởng nghiệm trọng đến uy tín chất lượng hàng Việt nam

1.1 Giới thiệu về kháng sinh nhóm Penicillin
1.1.1

Đại cương

Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện một nấm mốc thuộc giống Penicillium ức
chế sự phát triển của vi khuẩn. Fleming gọi chất kháng khuẩn chưa được biết tới này là
Penicillin. 10 năm sau, một nhóm các nhà khoa học thuộc trường Đại học Oxford bắt
đầu nghiên cứu chất này trên chuột thí nghiệm. Penicillin được hoan nghênh như một
thứ thuốc thần kỳ và đã cứu sống vô số người trong chiến tranh thế giới thứ II [5]
Penicillin là kháng sinh thể hệ đầu tiên có tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều
loại vi khuẩn. Penicillin được chiết ra từ dịch nuôi cấy nấm Penicillium chrysogenum.
Penicillin lần đầu tiên phát hiện có tác dụng chống vi khuẩn gram dưng Staphylococcus,
Diplococcus...nhưng hầu như không có tác dụng chống vi khuẩn gram âm và nấm men.
Vài thập niên trở lại đây đã phát hiện ra nhiều loại pencillin mới trong đó một số có hiệu
quả chống lại vi khuẩn gram âm và nấm men như Saccharomyces cerevisae đơn bội và
E.coli [5]
1.1.2 Phân loại
Pencillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo
gần giống nhau, bao gồm một vòng tiasolidin, một
vòng β-lactam, một nhóm amino có gắn với CO2
và một mạch bên (R). Hai loại Penicillin được
tổng hợp đầu tiên là benzylpenicillin(PenicillinG;
R = C6H5CH2-) và Phenoxymethylpenicillin
(PenicillinV; R = C6H5OCH2-). Và một số loại bán
tổng hợp: Amoxycillin, Ampicillin, Oxacillin,
Cloxacillin...[5]

M¹ch bªn


tăng phân huỷ vách tế bào vi khuẩn, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt.
1.1.4

Tác hại của penicillin khi tồn dư trong thực phẩm

Phần lớn các kháng sinh an toàn khi sử dụng đúng. Tuy nhiên dù ít hay nhiều
chúng đều có thể gây ra các tác dụng không mong muốn và tai biến.
Penicillin là kháng sinh ít độc, ít tác dụng không mong muốn, ngoại trừ phản ứng
dị ứng. Các sản phẩm phân huỷ kết hợp với protein tạo thành các kháng nguyên là
nguyên nhân của dị ứng và tuỳ theo cơ địa từng người phản ứng ở mức độ nào.
¾ Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh trong thực phẩm như sau:
Một là, có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh và
có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong chăn nuôi
+ Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho gia súc.
+ Kháng sinh cho vào nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh
+
Kháng
sinh
cho
vào
nước
uống
để
chữa
bệnh
gia
súc.
+ Kháng sinh cho thêm vào thức ăn cho gia súc để bảo quản súc sản lâu hư.
+ Kháng sinh tiêm vào súc vật hoặc cho súc vật uống trước khi giết thịt với mục đích kéo
dài thời gian, tránh hư hỏng thịt tươi.

(350,39)

Cấu trúc hóa học

(2S,5R,6R)-3,3-dimethyl-7oxo-6-[(2phenylacetyl)amino]-4thia-1azabicyclo[3.2.0]heptane-2carboxylic acid

pKa

T1/2

2,76

(2S,5R,6R)-3,3-dimethyl-7oxo-6-[[2(phenoxy)acetyl]amino]-4thia-1azabicyclo[3.2.0]heptane-2carboxylic acid

2,73

30 40
phút

1.2.2 Tính chất và tác dụng
Penicillin G và Penicillin V là hai penicillin tự nhiên thu được từ môi trường nuôi
cấy nấm penicillium chrysogenum.
Chúng được chỉ định trong bệnh nhiễm khuẩn thông thường: nhiễm khuẩn đường
hô hấp, tai mũi họng, nhiễm khuẩn huyết…
Penicillin G và V có độc tính thấp, nhưng cũng giống như các penicillin khác dễ
gây dị ứng thuốc: mẩn ngứa, mày đay, ngoại ban, hội chứng Stevens- johnson và Lyell,
nguy hiểm nhất là shock phản vệ.
Ngoài ra có thể gây viêm tĩnh mạch huyết khối, thiếu máu tan máu, giảm bạch cầu.
1.2.3 Tình hình sử dụng Penicillin
Mặc dù thuốc kháng sinh đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc chống lại

Việt nam [6]

TCN thuỷ
sản

Quốc gia

EU

Penicillin G

Sũa

Gan,
bầu
dục

Thịt

Thịt

Gan

Thận

Sũa

4

50

phản ứng tạo phức đặc trưng và hoàn toàn định lượng của cadimi với thuốc thử
phenaltrolin-cadimi sinh ra phức bền. Chiết phức này bằng nitrobenzen và đo phổ hấp thụ
luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 6 of 120.

5


Header Page 7 of 120.

nguyên tử AAS của kim loại cadimi trong phức ở pha hữu cơ, hay phân hủy pha hữu cơ
lấy cadimi vào dung dịch HCl 1% và đo phổ của cadimi. Phương pháp này phức tạp,
không đặc trưng và chỉ xác định được lượng tổng Penicillin.
Tiêu chuẩn ngành thuỷ sản TCN 197-2004 [8] qui định phương pháp định lượng
Penicillin trong sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Penicillin trong sản
phẩm thuỷ sản được tách ra khỏi nền mẫu bằng dung dịch đệm phosphat, pH 9, làm sạch
và cô đặc dịch chiết trên cột Bond Elut C18, dẫn xuất hoá và định lượng bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao với detector PDA. Qui trình này trải qua quá trình dẫn xuất phức tạp và
mới chỉ dừng lại ở phạm vi thuỷ sản.
1.3.2 Thế giới
a) Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS
Tác giả Titus A.M.Msagati [13] và cộng sự đã xác định dư lượng các β-lactam
trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng - khối phổ. Các tác giả đã chiết và làm sạch mẫu sử
dụng hỗn hợp đệm phosphat, tetraethylammonium clorua Et4NCl và acetonitril. Sau đó,
các β-lactam sẽ được tách và định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ chế độ ion dương
(LC-PI-ESI-MS). Giới hạn phát hiện của phương pháp này đối với Penicillin G và
penicillin V trong gan và bầu dục là 1 ng/kg ; trong sữa là 0,7 µg/L.
b) Phương pháp sắc ký lỏng cặp ion với detector UV
Tác giả Yuko Ito [14] và cộng sự thuộc Viện sức khỏe cộng đồng (Nhật Bản) đã
ứng dụng kĩ thuật làm sạch qua cột trao đổi ion để xác định 6 penicillin: Penicillin G,
Penicillin V, Oxacillin, Cloxacillin, Nafcillin, và dicloxacillin trong thịt. Các penicillin

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 8 of 120.

7


Header Page 9 of 120.

CHƯƠNG II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu
Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh (trong thức ăn, điều
trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến bộ của công nghệ sinh
học, nhằm làm vật nuôi mau lớn. Thế nhưng, việc tuỳ tiện sử dụng thuốc kháng sinh dễ
dẫn đến hậu quả: Lượng thuốc kháng sinh tồn dư trong sản phẩm vượt ngưỡng cho phép,
người sử dụng loại thực phẩm này trong thời gian dài có thể gây nguy hại cho sức khoẻ.
Mục tiêu của đề tài là: Xây dựng được phương pháp xác định penicillin G và V với độ
nhạy và độ chính xác cao. Phân tích một số mẫu thực tế để thẩm định lại qui trình.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Việc phát triển các kỹ thuật xác định dư lượng penicillin G và V trong thực phẩm
là rất cần thiết giúp cho các cơ quan chức năng kiểm soát tốt hơn việc sử dụng kháng sinh
trong chăn nuôi. Để phù hợp với điều kiện của hầu hết các phòng thí nghiệm trong nước,
chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tử ngoại để
phát hiện và định lượng penicillin G và V. Cơ sở lí thuyết của phương pháp được tóm tắt
dưới đây:
2.2.1 Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha
động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn)[4].Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới
dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa
pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất
lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha

ký lỏng pha liên kết; sắc ký trao đổi ion; sắc ký cặp ion, sắc ký điện di mao quản;
sắc ký phân bố lỏng-lỏng; sắc ký rây phân tử...Phương pháp được sử dụng rộng
rãi nhất là sắc ký lỏng pha liên kết.

2.2.2 Phân tích định tính và dịnh lượng trong HPLC
Một trong các đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký của các chất trong một hệ
pha đã chọn là thời gian lưu của các chất. Nghĩa là trong một hệ pha và trong các điều
kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích sẽ có thời gian lưu khác nhau và cố định.
Chính đại lượng này là một tính chất hay thông số để định tính các chất trong một hỗn
hợp mẫu.
Vì vậy, sau khi đã chọn được các điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký, tiến hành
ghi sắc đồ của mẫu phân tích, và xác định thời gian lưu của từng pic ứng với mỗi chất
trong sắc đồ. Sau đó so sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu của chất
chuẩn, từ đó sẽ xác định được trong mẫu phân tích có những chất nào.
Trong HPLC có thể dùng một trong 2 phương pháp là phương pháp đường chuẩn
hoặc phương pháp thêm tiêu chuẩn để định lượng. Việc dùng phương pháp nào trong hai
phương pháp đó tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích
Hi = k1.Ci
Si = k2. Ci
Hi, Si là chiều cao pic và diện tích pic tương ứng của chất i
Ci là nồng độ chất i
K1, k2 là các hằng số thực nghiệm
Phương pháp đường chuẩn có ưu điểm là có thể phân tích hàng loạt mẫu của cùng
một đối tượng, nhanh, đơn giản, dễ làm. Tuy nhiên khi thành phần mẫu phân tích phức
tạp, việc pha dung dịch chuẩn để phù hợp với mẫu phân tích về thành phần nền, thành

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 10 of 120.

9


(C16H17N2NaO4S)

-

Chuẩn phenoxymetyl penicillin Kali (Penicillin V) (viện kiểm nghiệm thuốc trung
ương) C16H17KN2O5S (98,90%)
-

Acetonitril

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 11 of 120. 10


Header Page 12 of 120.

-

Methanol

-

Natri tungstat

-

Thuỷ ngân (II) clorid

-

1,2,4- triazole

gốc penicillin G 1000 mg/l cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng
nước cất.
2.3.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Penicillin V
- Dung dịch chuẩn gốc Penicillin V 1000mg/l: cân chính xác 0,1g chuẩn Penicillin V, hoà
tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml.
- Dung dịch chuẩn trung gian Penicillin V 10 mg/l: hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn
gốc penicillin V 1000 mg/l cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng
nước cất.
2.3.3.3 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc của 2 penicillin 2µg/ml: hút chính xác 1ml
dung dịch chuẩn trung gian 10 mg/l của mỗi penicillin vào bình định mức 5ml và định
mức đến vạch bằng nước cất
Các dung dịch chuẩn penicillin được bảo quản lạnh (nhiệt độ 2 – 4oC), tránh ánh sáng.
2.3.3.4 Đệm photphat 0,1M pH 6.5
Cân 7,98 gam K2HPO4.3H2O; 8,84 gam KH2PO4 và 3,89 gam Na2S2O3. Hoà tan hỗn hợp
trên vào nước và chuyển vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch bằng nước cất.
2.3.3.5 Chuẩn bị pha động chạy sắc ký.
luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 12 of 120. 11


Header Page 13 of 120.

- Kênh A: Lấy 240ml acetonitril, 60 ml metanol cho vào bình định mức 1000 ml và định
mức đến vạch bằng đệm photphat pH 6,5.
- Kênh B: Lấy 300ml acetonitril và 200 ml metanol cho vào bình định mức 1000 ml và
định mức đến vạch bằng đệm photphat pH 6,5.
2.3.3.6 Chuẩn bị dung dịch Natri tungstat 0,68M
Cân 22,43 gam Na2WO4.2H2O, hoà tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml.
2.3.3.7 Chuẩn bị dung dịch acid sulfuric 0,68M
Hút 3,8 ml dung dịch H2SO4 đặc vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng
nước cất..


%A

%B

0

100

0

3

100

0

8

63

37

19

63

37

20


PenV 15.083 1498533 90893

75

50

25

0

16

18

20

22

24

Minutes

Hình 3: Sắc đồ chạy chuẩn PenG 25ppm – Pen V 56ppm (không dẫn xuất)
luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 14 of 120. 13

mAU

50
0

40

Bơm mẫu thịt lợn thêm chuẩn thu được sắc đồ sau:

0
0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

Minutes

A: Đệm photphat 0,1M; pH 6,5; B: ACN; C: MeOH
Cố định các điều kiện:
- Cột Symmestry waters C18 (150mm × 4,6mm × 5µm)
- Detectơ: PDA 323nm
- Nhiệt độ buồng cột: 40oC
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
- Mẫu phân tích: dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 penicillin 0,4ppm.
Khảo sát các thành phần pha động khác nhau, thu được kết quả sau:
Bảng 4: Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thời gian lưu của 2 penicillin.
Thành phần pha
động

Kết quả

%A

%B

%C

Thời gian lưu của Pen G (phút)

Thời gian lưu của Pen V (phút)

90

0

10


3,669

4,107

60

25

15

4,843

5,440

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 16 of 120. 15


5

5

0

mAU

Name
Retention Time
Area

10

thấp và chúng không tách khỏi nhau được. Thành phần pha động có cả đệm photphat,
ACN và MeOH với các tỉ lệ khác nhau thì thời gian lưu có cao hơn nhưng khả năng tách
của 2 chất ra khỏi nhau vẫn chưa tốt. Do vậy, chúng tôi sử dụng chế độ gradient với
chương trình rửa giải như sau:
A: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 700 : 240 : 60
B: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 500 : 300 : 200
Bảng 5: Chương trình gradient rửa giải các penicillin (dẫn xuất)
Thời gian (phút)

Thành phần pha động
%A

%B

0

100

0

20

0

100

21

100




3

Header Page 18 of 120.

0

2

4

6

PenV 9.557 24359 1225

0

1

8

2
mAU

mAU

2

PenG 8.512 53587 2414

-

Detectơ: PDA 323nm

-

Nhiệt độ buồng cột: 40oC

-

Tốc độ dòng: 1ml/phút

-

Mẫu phân tích: dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 penicillin 0,4ppm

2

4

6

8

mAU

mAU
1
0



luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 18 of 120. 17

20


4

6

8

10

12

mAU

mAU
2
1

2

PenV 14.016 34526

3

PenG 12.640 45263


3

4

mAU

mAU
2
0
0

4.427 35132 2492

4

4.032 55994 4502

6

6

4

Hình 8: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 2 penicillin nồng độ 0,4ppm
(cột Symmestry waters: 250mm × 4,6mm × 5µm)

2

0


A: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 700 : 240 : 60
B: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 500 : 300 : 200

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 19 of 120. 18


Header Page 20 of 120.

Thời gian (phút)

Thành phần pha động
%A

%B

0

100

0

20

0

100

21

100


Li tâm 6000 v/ph, 5 phút

bã

Lọc / bình nón 50ml
Chỉnh đến pH phù hợp

5ml đệm photphat 25mM

rửa tạp

hoạt hoá

SPE

3ml MeOH
3ml H2O

Hút khô 1 phút
Rửa giải bằng 10ml ACN/bình cất quay
Cô quay đến cạn, 40oC
+ 500µL đệm photphat 25mM, pH 9
+ 500µL hỗn hợp dẫn xuất
Rung siêu âm ở 55oC, 30 phút
HPLC

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 21 of 120. 20




4

6

8

10

12

2

PenV 14.208 6003

1
mAU

mAU

PenG 12.800 12964

1

2

Loại cột SPE

0



12

PenV 14.165 4877

1
mAU

mAU

PenG 12.779 9287

1

2

0

14

16

18

20

22

24


8,23

8,56

9,15

10,01

11,07

Diện tích
pic PenG
(mAU)

14902

15039

17596

18853

19563

17755

13493

5236


0
4

6

8

10

12
pH

Hình 12: Đồ thị sự ảnh hưởng của pH đến hiệu quả chiết qua SPE
Từ các kết quả trên chúng tôi nhận thấy, trong khoảng nồng độ pH từ 8-9, hiệu quả chiết
đạt giá trị cực đại, giảm ít khi pH < 8 và giảm mạnh khi pH > 9. Điều này có thể giải
thích như sau: trong môi trường acid, nhóm –OH trên các penicillin kết hợp với H+ tạo
thành dạng cation, độ phân cực tăng, khả năng lưu giữ trên cột polymeric giảm (nên bị
mất trong quá trình nạp mẫu hoặc rửa tạp). Mặt khác, penicillin G kém bền trong môi
trường pH thấp. Nó tồn tại không quá 5 phút ở môi trường pH < 3 [12]. Trong môi trường
bazơ, các penicillin ở dạng nguyên thể với độ phân cực kém và tương tác tốt hơn với cột
polymeric. Tuy nhiên, nếu môi trường bazơ quá mạnh, các penicillin dễ bị phân huỷ và
hiệu lực của cột SPE cũng giảm. Do đó hiệu suất chiết giảm đáng kể. Cũng từ đồ thị trên

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 23 of 120. 22


Header Page 24 of 120.

4


QUY TRÌNH CHIẾT PENICILLIN G VÀ V TRONG THỰC PHẨM

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 24 of 120. 23

mAU

1.5
0.5

2

PenV 14.709 26868

2.0

2.0

PenG 13.269 15596

2.5

2.5

1.0

mAU

nhận thấy, tương tác giữa penicillin G và penicillin V với cột SPE khá giống nhau. Một
số tài liệu đã sử dụng penicillin V làm nội chuẩn khi xác định các penicillin khác.


Rửa giải 10ml ACN/bình cất quay
Cô quay đến cạn, 40oC
+ 500µL đệm photphat 25mM, pH 9
+ 500µL hỗn hợp dẫn xuất
Bề điều nhiệt 55oC, 30 phút
HPLC

luan van thac si-tai lieu - luan an -kinh te -Footer Page 25 of 120. 24