TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THỊ HƯƠNG THẢO

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA
VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ RÔ ĐỒNG (Anabas
testudineus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

\

2012


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THỊ HƯƠNG THẢO

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA
VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ RÔ ĐỒNG (Anabas
testudineus)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

Giáo viên hướng dẫn
PGs. Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

cá1 não3, cá2 não, cá3 não, cá4 não). Qua kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản như
nhuộm gram, tính di động, oxydase, catalase, tiến hành định danh theo
phương pháp truyền thống và kit API 20 Strep được cả 5/6 chủng là
Streptococcus agalactiae. Tuy nhiên kết quả kiểm tra API lại sai khác đối với
một số chỉ tiêu (GLYG, RIB).
Kháng sinh đồ được thực hiện trên cả 6 chủng Streptococcus
agalactiae với 12 loại thuốc kháng sinh. Kết quả chỉ có kháng sinh
Cefazoline, Florfernicol, Neomycine thể hiện tính nhạy. Các loại kháng sinh
còn lại thể hiện tính nhạy trung bình hoặc kháng với các chủng vi khuẩn trên.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn với các kháng sinh
Cefalecin, Enrofloxacin, Trimethoprim/Sulfamethoxazol Kết quả chỉ có
Cefalecin, Enrofloxacin là còn nhạy, nhưng giá trị MIC vẫn còn ở mức cao. Vi
khuẩn thể hiện tính kháng với kháng sinh Trimethoprim/Sulfamethoxazol .

ii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm tạ .......................................................................................................i
Tóm tắt.......................................................................................................... ii
Mục lục ........................................................................................................ iii
Danh sách hình ..............................................................................................v
Danh sách bảng ............................................................................................vi
Phần 1 : Giới thiệu ........................................................................................1
1.1 .

Giới thiệu .....................................................................................1

1.2 . Mục tiêu ........................................................................................2


Kết quả thí nghiệm gây cảm nhiễm .............................................27
iii


Phần 5 : Kết luận và đề xuất ......................................................................30
5.1. Kết luận .......................................................................................30
5.2. Đề xuất.........................................................................................30
Tài liệu tham khảo ......................................................................................31
Phụ lục ........................................................................................................33

iv


DANH SÁCH HÌNH
Hình 1.

Cá rô ............................................................................................3

Hình 4.1

Vi khuẩn Streptococcus agalactiae được phục hồi trên BHIA ............21

Hình 4.2

Nhuộm Gram vi khuẩn có dạng hình cầu và không gây tan huyết21

Hình 4.3

Kết quả API20 Strep......................................................................22


v


DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1

Các kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ ........................15

Bảng 3.2

Thao tác pha loãng thuốc kháng sinh ..........................................17

Bảng 3.3

Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau........................18

Bảng 4.1

Độ nhạy của vi khuẩn với thuốc kháng sinh................................24

Bảng 4.2

Kết quả MIC...............................................................................25

Bảng 4.3 Số cá chết ở mỗi bể ......................................................................28
Bảng 5. Kết quả định danh vi khuẩn Streptococcus agalactiae bằng phương
pháp sinh lý, sinh hóa truyền thống ...............................................................36
Bảng 6.

tượng nuôi đã góp phần nâng cao hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản. Bên cạnh
các đối tượng chủ lực như cá tra, cá basa, cá điêu hồng… một số đối tượng mới
đã được người dân đưa vào mô hình ao nuôi và thâm canh hóa như cá lóc, sặc
rằn, rô đồng, lươn…được nuôi ngày càng phổ biến góp phần tăng thu nhập cho
người nuôi. Tuy nhiên việc mở rộng diện tích nuôi cũng như việc đa dạng đối
tượng nuôi và thâm canh hóa đối tượng nuôi đã phát sinh nhiều vấn đề quan
tâm như: môi trường, con giống, thức ăn, quản lý ao nuôi và dịch bệnh.
Cá rô đồng (Anabas testudineus) là loài cá bản địa vùng ĐBSCL và có tiềm
năng lớn, thịt cá thơm ngon, có giá trị và được mọi người ưa chuộng. Chúng
được nuôi nhiều ở các nước như Thái Lan, Lào, Campuchia. Ở nước ta, cá rô
đồng được nuôi chủ yếu ở các tỉnh ĐBSCL như An Giang, Đồng Tháp, Sóc
Trăng (Phuong et al., 2002; Hien et al., 2003; Trieu và Long, 2001). Do chủ
động được con giống, thức ăn và nước cấp nên mô hình nuôi cá rô đồng ngày
được thâm canh hóa mang lại lợi nhuận cao.
Bên cạnh việc nuôi thâm canh hóa với mật độ cao thì vấn đề quản lý chất lượng
nước ao nuôi, quản lý dịch bệnh là rất khó khăn nên bệnh xuất hiện trong quá
trình nuôi là không thể tránh khỏi. Tuy nhiên, hiện nay thông tin về bệnh ở cá
rô đồng còn rất hạn chế và nhất là các nghiên cứu bài bản về bệnh ở đối tượng
nuôi này còn rất hiếm. Vì vậy, việc xác định tác nhân gây bệnh để tìm ra
phương pháp trị bệnh phù hợp nhằm giảm bớt thiệt hại khi mầm bệnh tái xuất
hiện trong quá trình nuôi là cần thiết. Do đó đề tài “Phân lập và xác định đặc

1


điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng (Anabas testudineus)” được
thực hiện.
1.2. Mục tiêu đề tài
Đề tài được thực hiện nhằm tìm hiểu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa, kiểu
huyết thanh và khả năng gây bệnh của vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng để cung

Giống:
Anabas
Loài:
Anabas testudineus

Hình 1. Cá rô đồng
Cá rô đồng là loài có phân bố rộng, chúng có thể sống ở các thủy vực nước
ngọt và nước lợ. Chúng phân bố nhiều ở các quốc gia trên thế giới như Ấn Độ,
Philippin, Thái Lan, Lào, Campuchia, Trung Quốc, Việt Nam…và nhiều quốc
gia Châu Á khác.
Cá rô đồng sống chủ yếu ở kênh, rạch, ao, hồ, đầm lầy và cửa sông. Chúng
cũng có thể được tìm thấy ở các con sông lớn, những nơi ngập lụt và nơi tù
đọng. Do cá có cơ quan hô hấp khí trời nên có thể chịu đựng được các điều
kiện bất lợi của môi trường như thiếu oxy, những ao tù đọng. Cá rô đồng có thể
vùi mình dưới bùn vào mùa khô để chờ những cơn mưa xuống, chúng cũng có
thể di chuyển trên cạn bằng hai nắp mang để tìm nơi cư trú thích hợp (Trương
Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993; Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hổ, 2003;
Fishbase, 2010).
3


Ngoài tự nhiên cá rô đồng ăn mùn bã hữu cơ, các phiêu sinh vật, cá, tôm nhỏ
(Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993; Fishbase, 2010). Mùa vụ
sinh sản của cá từ tháng 4-10, đẻ tập trung vào đầu mùa mưa, tháng 6-7 (Ngô
Trọng Lư và Thái Bá Hổ, 2003). Sau 5-6 tháng tuổi thì cá bắt đầu bắt cặp sinh
sản.
Cá được nuôi dưới nhiều hình thức từ nuôi trong ao, trong ruộng lúa, nuôi ghép
với nhiều loại cá khác và đang là một trong những đối tượng giúp người dân
thoát nghèo. Do việc nuôi cá rô đồng mang lại năng suất và lợi nhuận cao trong
những năm gần đây nên một số tỉnh đã đầu tư để phát triển loài thủy sản này.

những tổn thương ở da, cơ (Das et al., 2006).
4


Đặc biệt các nghiên cứu gần đây đã chứng minh sự hiện diện của vi khuẩn
Edwardsiella tarda trên loài cá này cùng với sự suy giảm chất lượng nước, hàm
lượng chất hữu cơ cao, nhiệt độ môi trường thay đổi làm cá bị stress, nuôi với
mật độ cao (Mohanty và Shoo, 2007). Một số thí nghiệm cảm nhiễm trước đó
cũng đã chứng minh khả năng gây bệnh của E. tarda trên cá rô đồng, kết quả
gây cảm nhiễm ở nhiệt độ nước 20-22oC cho thấy cá mẫn cảm với mầm bệnh
E. tarda ở mật độ 107 và 108 tế bào, cá bệnh có biểu hiện bỏ ăn, lờ đờ, bụng cá
trương to có màu vàng ánh đến hơi đỏ, xuất huyết bề mặt cơ thể và các vây. Cá
chết 100% ở mật độ 109 tế bào trong vòng 3 ngày (Sahoo et al., 2000).
Một loài vi khuẩn gram âm khác cũng đã được công bố là gây bệnh trên cá rô
đồng. Vi khuẩn Flavobacterium columnare hình que, di động trượt đã được
phân lập trên cá rô đồng (Sarker et al., 2002; Dash et al,. 2009). Kết quả cảm
nhiễm cho thấy ở mật độ 107 và 10 8 CFU/ml, cá mẫn cảm nhanh với mầm bệnh
và chết 50-100% trong vòng 7 ngày, riêng ở mật độ F. columnare 106 CFU/ml,
sau 7 ngày cá chết 10-30%. Các điều kiện bất lợi như thiếu thức ăn cùng với
độc lực của vi khuẩn gây bệnh đủ mạnh thì bệnh sẽ xảy ra với tốc độ nhanh và
các tổn thương khá đặc trưng (Sarker et al., 2002; Sahoo et al., 2010).
2.3.

Bệnh do vi khuẩn Streptococcus

2.3.1. Dấu hiệu bệnh lý
Cá bệnh có một số biểu hiện bên ngoài là cơ thể sậm màu, một bên hoặc hai
bên mắt bị lồi và đục, xuất huyết ở các vây và xương nắp mang. Cá bị bệnh vận
động khó khăn, bơi không có định hướng, não, thận và tỳ tạng là những cơ
quan bị làm tổn thương nhiều nhất và đây là lý do gây chết cá. Cá bệnh cấp tính

Theo Robinson và Meyer (1966) bệnh có thể lây nhiễm trực tiếp bằng cách gây
cảm nhiễm khi ngâm cá vào bể kính với mật độ vi khuẩn 106CFU/ml trong 10
phút (trích dẫn Inglis, 1993).
Trần Thị Viên (2007) nghiên cứu một số bệnh trên cá rô phi (Oreochromis sp).
Thí nghiệm được thực hiện qua các bước như: thu thập thông tin, tiếp theo là
thu và bảo quản mẫu, phân tích và định danh mầm bệnh, kiểm tra kháng sinh
đồ và viết báo cáo. Kết quả tìm thấy chủ yếu là Trichodina và Gyrodactylus.
Bên cạnh đó kết quả phân tích vi sinh đã định danh được bốn loài vi khuẩn S.
iniae, S. agalactiae, Vibrio proteolyticus,
V. cholerae và
1 giống
Staphylococcus sp. Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ cho thấy các loài vi khuẩn
này nhạy với doxycyline và ofloxacin, nhưng kháng lại với sulfamethoxazoletrimethoprim.
Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị Hoàng Oanh (2010) nghiên cứu đặc điểm mô
học ở cá điêu hồng nhiễm vi khuẩn S agalactiae trong điều kiện thí nghiệm.
Thí nghiệm được thực hiện với chủng vi khuẩn S. agalactiae S09-01 phân lập
từ cá điêu hồng, gây cảm nhiễm trên cá khỏe với mật độ 4.23x101 – 4.23x10 6
CFU/ml. Mẫu thu vào ngày thứ 1, 3, 5, 10, 14 sau khi gây cảm nhiễm. Kết quả
kính phết mẫu tươi mô gan thận và tỳ tạng tất cả các mẫu đều phát hiện vi
khuẩn hình oval hoặc hình cầu, kích thước khá nhỏ, gram (+) không có sự biến
đổi mô da, cơ của các mẫu cá thu. Mô thận và tỳ tạng ở cá nhiễm mật độ 4.23x
104 - 4.23x 106 CFU/ml bị thay đổi vào ngày thứ 3, biến đổi nặng vào ngày thứ
5 và bị phá hủy vào ngày thứ 10. Mô gan biến đổi chậm bắt đầu bị biến đổi vào
ngày thứ 5 ở mật độ 4.23x 105 - 4.23x 10 6 CFU/ml, cấu trúc mang ít bị biến đổi
6


đến ngày thứ 5 mới bắt đầu bị biến đổi ở mật độ vi khuẩn là 4.23x 105 - 4.23x
106 CFU/ml.
2.4.


Nhóm Tetracylin
Là nhóm kháng sinh có tác dụng kiềm khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở
nồng độ cao, có tác dụng đối với vi khuẩn gram (-) và (+) (Bùi Thị Tho, 2003).
Nhóm này được chia làm 2 thế hệ. Thế hệ I bao gồm các loại kháng sinh như:
tetracylin, chlotetracylin và oxytetracylin. Đây là những loại thuốc có thời gian
7


tác động ngắn và trung bình. Thế hệ II bao gồm các chất bán dược tổng hợp
gần đây có thời gian tác động dài như: doxycyclin, minocyclin (Poole, 2004).
Trong đó, tetracylin được dùng để điều trị nhiễm khuẩn toàn thân và nhiễm
trùng ruột. Độc tính của tetracylin là có thể gây xáo trộn tiêu hóa, xáo trộn chức
năng gan, thận… Khi điều trị bệnh không nên kết hợp với các loại kháng sinh
ampicillin, colistin…vì nó sẽ làm giảm tác dụng điều trị và gây ra hiện tượng
kháng thuốc (Bùi Kim Tùng, 2001).
Nhóm Sulfonamid
Thuốc có phổ kháng khuẩn rộng, bao gồm nhiều vi khuẩn Gram âm và Gram
dương. Tuy nhiên sự đề kháng của vi khuẩn với thuốc nhanh. Đại diện cho
nhóm này là: sulfadiazine, sulfadimidine, sulfamethoxazone. Sulphamid với
liều kiềm khuẩn sẽ ức chế sự sinh sản phát triển của vi khuẩn do thuốc cạnh
tranh với acid para amonozenzoic một yếu tố sinh trưởng của mọi loài tế bào
trong đó có tế bào vi khuẩn (Bùi Thị Tho, 2003).
Nhóm Quinolone
Là nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn, chúng có tác dụng ức chế tổng hợp
ADN. Các thuốc thuộc nhóm này được phát triển qua 2 thế hệ với phổ kháng
sinh và cơ chế kháng khuẩn khác nhau. Thế hệ I có phổ kháng khuẩn hẹp, tác
dụng chủ yếu trên vi khuẩn Gram âm. Thế hệ II có phổ kháng khuẩn vừa
nhanh, vừa mạnh, tác dụng trên cả Gram âm và Gram dương. Đại diện cho
nhóm này là: enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin ,



Phần 3:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
-

Thời gian thực hiện đề tài : từ tháng 02/2012 đến tháng 05/2012.
Địa điểm nghiên cứu : phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy
sản, Khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ.

3.2. Vật liệu nghiên cứu
-

Nguồn vi khuẩn : được phục hồi từ tủ - 80oC từ bộ sưu tập vi khuẩn
thuộc bộ môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản - Khoa Thủy Sản - Trường
Đại học Cần Thơ. Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường BHIA, ủ
trong tủ ấm ở 30 oC. Sau 24 – 48 giờ, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn
lạc, kiểm tra tính thuần.

-

Thiết bị : tủ cấy vô trùng, nồi Autoclave, kính hiển vi, cân điện tử, bếp
nhiệt, máy li tâm, máy vortex , tủ lạnh, tủ ấm…
Môi trường : Brain heart ifusion agar, Brain heart ifusion broth.
Hóa chất: cồn, nước cất, ethanol, NaCl, paraffin, hóa chất nhuộm Gram,
hóa chất dùng để test các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa, định danh vi khuẩn,
kíp API20 Strep…
Kháng sinh

Quan sát tính di động: Nhiều loại vi khuẩn có khả năng di động nhờ vào tiêm
mao. Sự di động này có thể quan sát bằng phương pháp giọt ép. Nhỏ một ít
nước cất hoặc nước muối sinh lý 0,85% đã được tiệt trùng lên lame, dùng que
cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn trải đều lên giọt nước. Đậy lamenla lại và quan
sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X có giọt dầu.
Phản ứng Oxydase: Dùng que cấy tiệt trùng phết một ít vi khuẩn lên giấy tẩm
cytochrome oxydase. Quan sát mẫu trong 30 giây. Kết quả: vi khuẩn cho phản
ứng oxydase (+) sẽ làm giấy tẩm cytochrome oxydase chuyển sang màu tím
đậm (so màu theo hướng dẫn của nhà sản xuất) và ngược lại.
Phản ứng Catalase: Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn để lên lame
rồi nhỏ một giọt dung dịch 3% H2O2 lên lame. Kết quả: vi khuẩn cho phản ứng
catalase (+) sẽ gây ra hiện tượng sủi bọt trong dung dịch 3% H2O2 và ngược lại.
Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (OF test): Chuẩn bị 2 ống
nghiệm chứa môi trường OF đã tiệt trùng. Dùng que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn
cấy thẳng đứng từ trên xuống đáy của 2 ống nghiệm. Cho khoảng 0,5 – 1,0 ml
dầu parafffin. Tiệt trùng vào 1 ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí (F). Ống
còn lại không phủ paraffin. Để trong tủ ấm ở nhiệt độ 28 – 30 oC. Đọc kết quả
sau 24 – 48 giờ (Bảng 1) (có thể kiểm tra kết quả trong 7 ngày).

11


Bảng 1. Bảng kiểm tra kết quả test O/F
Ống tiếp xúc không khí

Ống phủ dầu paraffin

Xanh lá cây

Xanh lá cây

 Tan huyết dạng Alpha: vi khuẩn phá vỡ một phần tế bào máu, tạo thành
khu vực màu xanh quanh khuẩn lạc.
 Tan huyết dạng Beta: vi khuẩn phá vỡ hoàn toàn tế bào máu trên môi
trường nuôi cấy.
 Tan huyết dạng Gamma: vi khuẩn không sử dụng máu trên môi trường
nuôi cấy.
Phương pháp ngưng kết miễn dịch:
Sử dụng bộ kít Streptococcus Strep – B – Latex, gồm các bước:
Chuẩn bị: Ống nghiệm chứa 3 – 5 mL nước muối sinh lý 0,9% và tăm tiệt
trùng.
Thực hiện: Dùng que cấy nhặt từ 3 – 5 khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa
nước muối sinh lý. Nhỏ một giọt dung dịch kháng nguyên lên lame. Nhỏ tiếp
10 µl dung dịch vi khuẩn. Trộn đều vi khuẩn với dung dịch kháng nguyên.
Kết quả: Phản ứng cho kết quả dương tính khi có sự kết dính giữa vi khuẩn và
dung dịch chứa kháng nguyên sau 5 – 10 giây. Nếu phản ứng xảy ra sau hơn 30
giây thì kết quả là dương tính giả.
12


Phương pháp làm tiêu bản kính phết
-

Dùng kim tiêm lấy máu, nhỏ một giọt máu ở đầu lame, kế tiếp dùng một
lame sạch khác đặt vào ngay giọt máu hợp một gốc 45o để máu lan ra sau đó
kéo về phía cuối lame.

-

Dùng nhíp tiệt trùng lấy một ít cơ quan từ gan, thận, tỳ tạng phết đều lên
lame sạch.

dung dịch gốc với ống chuẩn McFarland số 4. Hút 500 µl dung dịch gốc cho
vào API GP Medium (dung dịch 1). Lắc trộn đều vi khuẩn.
Thực hiện: Dùng pipet tiệt trùng hút 100 µl dung dịch vi khuẩn của dung dịch
gốc cho đầy vào các ô VP, HIP, ESC, PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL,
LAP. Và cho đầy (nữa ô bên dưới) vi khuẩn vào ô ADH. Cho đầy (nữa ô bên
dưới) vi khuẩn từ dung dịch 1 vào các ô còn lại (từ ô RIB đến GLYG). Tiếp tục
cho dầu (mineral oil) đã được tiệt trùng (nữa ô bên trên) vào các ô từ RIB →
GLYG. Đậy nắp khuôn nhựa. Ủ bộ kíp ở nhiệt độ 35oC +2oC.
Kết quả :
Sau 4 – 4,5 giờ, cho thuốc thử vào các ô:
13


- VP : 1 giọt VP1 + 1 giọt VP2.
- HIP : 2 giọt NIN.
- PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL, LAP : 1 giọt Zym A + 1 giọt Zym B
- Lưu ý : đọc kết quả của các phản ứng sau 10 phút.
Sau 24 giờ:
- Đọc kết quả các ô ESC, ADH, RIP → GLYG. Không đọc lại kết quả các ô
HIP, PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL, LAP.

Phương pháp lập kháng sinh đồ (theo Geert Huys, 2002)
Lập kháng sinh đồ với 12 loại kháng sinh là Neomycin (N/30µg), Florfenicol
(FFC/30 µg), Ciprofloxacin (CIP/5µg), Gentamicin (GM/10µg), Doxycycline
(DO/30µg), Cefazolin (CZ/30µg), Ampicillin (AMP/25µg), Amoxicillin
(AML/25µg), Trimethoprim + sulfamethoxazole (SXT/1.25/23.75 µg),
Tetracycline (TE/30 µg), Norfloxacin (NOR/5 µg), Enrofloxacine (ENR/5 µg).
Phương pháp xác định mật số vi khuẩn dựa vào ống chuẩn McFarland số
3 (9x10 8 cfu/ml)
-


Chuẩn đường kính vòng vô trùng
Kháng

Trung bình

Nhạy

Neomycin (N/30µg)

≤12

13 – 16

≥17

Florfenicol (FFC/30 µg)

≤16

17 – 19

≥20

Ciprofloxacin (CIP/5µg)

≤15

16 – 20


14 – 17

≥18

Amoxicillin (AML/25µg)

≤13

14 – 17

≥18

Trimethoprim+Sulfamethoxazole

≤10

11 – 15

≥16

Tetracycline (TE/30µg)

≤14

15 – 18

≥19

Norfloxacin (NOR/5µg)


Chuẩn bị: Đĩa TSA (Tryptic soy agar) + 1.5%NaCl, Ống nghiệm 10 ml TSB
(Trytic soya broth) + 1.5%NaCl; Chai 50 ml TSB (Trytic soya broth) +
1.5%NaCl; Nước muối sinh lý (dung dịch 0.85 % NaCl). Nuôi vi khuẩn trên
môi trường TSA +1.5%NaCl 24 giờ ở nhiệt độ 30°C bao gồm vi khuẩn cần xác
định MIC và vi khuẩn đối chứng (E. coli LMG 8223).
Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn bằng cách quan sát sự đồng nhất về hình
dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc và nhuộm Gram. Chọn 5 khuẩn lạc
riêng lẻ trên đĩa TSA + 1.5% NaCl cho vào ống nghiệm chứa 10 ml TSB +
1.5% NaCl, ủ ở 30°C, 24 giờ (có thể ủ lâu hơn nếu thấy vi khuẩn chưa phát
triển).
Mỗi lần xác định MIC có 10 chủng vi khuẩn trong đó có chủng đối chứng.
Ngày thứ ba
Pha thuốc: Pha 2 ống nghiệm thuốc gốc, mỗi ống 50ml (là kháng sinh hay
thuốc cần thí nghiệm), ống thứ nhất có hàm lượng thuốc là 1024ppm và ống
thứ hai có hàm lượng thuốc là 256ppm. Thuốc phải được pha bằng dung môi
phù hợp (theo hướng dẫn của nhà sản xuất). Pha loãng thuốc với độ pha loãng 2
lần từ 4- 1024ppm trong ống nghiệm 50ml (Bảng 3.2). Hàm lượng thuốc 512
và 256ppm phải được pha từ ống thuốc gốc thứ nhất (1024ppm) bằng cách
thêm nước muối sinh lý. Hàm lượng thuốc 128, 64, 32,16,8 và 4 ppm được pha
từ ống gốc thứ hai (256 ppm).

16


Bảng 3.2. Thao tác pha loãng kháng sinh (thể tích dùng cho 10 chủng vi khuẩn)
Ống
nghiệm

Nồng độ cần
đạt


4

128 ppm

25ml (dụng dịch thuốc gốc 2)

25ml

5

64 ppm

25ml (128 ppm)

25ml

6

32 ppm

25ml (64 ppm)

25ml

7

16 ppm

25ml (32 ppm)