TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

TRẦN MỸ KHUÊ

ẢNH HƯỞNG CỦA
CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT
VÀ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NGOẠI CẢNH
ĐẾN VI NHÂN GIỐNG CÂY NGHỆ ĐEN
(Curcuma zedoaria (Berg.) Roscoe)

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: TRỒNG TRỌT

Cần Thơ, 2010


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: TRỒNG TRỌT

ẢNH HƯỞNG CỦA
CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT
VÀ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NGOẠI CẢNH
ĐẾN VI NHÂN GIỐNG CÂY NGHỆ ĐEN
(Curcuma zedoaria (Berg.) Roscoe)

Giảng viên hướng dẫn:
TS. Lê Văn Bé

Luận văn tốt nghiệp kèm theo với đề tài: “ ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU
HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ ĐIỀU KIỆN NGOẠI CẢNH ĐẾN VI
NHÂN GIỐNG CÂY NGHỆ ĐEN (CURCUMA ZEDOARIA (BERG.)
ROSCOE) ”, do sinh viên TRẦN MỸ KHUÊ thực hiện và bảo vệ trước Hội Đồng
chấm luận văn tốt nghiệp và đã được thông qua.
Luận văn tốt nghiệp được Hội Đồng đánh giá ở mức:…………………………..
Ý kiến của Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:…………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày…..tháng 6 năm 2010.

Duyệt Khoa
Trưởng khoa Nông Nghiệp & SHƯD

Chủ tịch Hội đồng

iii


TIỂU SỬ CÁ NHÂN

Họ tên:

Trần Mỹ Khuê

Ngày sinh:


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Tất cả các số liệu, kết
quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố
ở bất kỳ công trình luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn

TRẦN MỸ KHUÊ

v


LỜI CẢM ƠN

Xin tỏ lòng tri ân sâu sắc!
Thầy Lê Văn Bé đã tận tình hướng dẫn, đóng góp những ý kiến quý báu
trong suốt quá trình thực hiện đề tài, người đã chỉ cho tôi cách mở khóa đến với
thành công.
Cô Lê Thị Điểu, anh Nguyễn Văn Kha, thầy Nguyễn Văn Ây đã trực tiếp chỉ
dẫn, luôn động viên và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong thời gian qua.
Cô cố vấn học tập Lê Thị Xua, đã quan tâm dìu dắt và giúp đỡ tôi trong
những năm học vừa qua.
Quý Thầy, Cô Trường Đại học Cần Thơ, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng
dụng đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức bổ ích cho tôi trong suốt
khóa học.
Chân thành cảm ơn!
Chị Nguyễn Thị Phiên, các bạn lớp Nông học K32: Thúy Hằng, Diễm Trinh,
Thị Linh, các bạn lớp Trồng trọt K32: Minh Truyền, Liên Quốc, Hoàng Anh, Hồ
Nam, Băng Tuyền, Kiều Oanh, Minh Thuận, Thị Diểm… và các em Như Thơ,
Thành Nhân… đã nhiệt tình giúp đỡ, luôn gắn bó, động viên, chia sẻ những khó
khăn cũng như vui, buồn trong suốt quá trình học tập và làm luận văn.

1.2.3 Ưu và khuyết điểm của phương pháp vi nhân giống ................................. 12
1.2.3.1 Ưu điểm........................................................................................... 12
1.2.3.2 Khuyết điểm .................................................................................... 13
1.3 KẾT QUẢ VI NHÂN GIỐNG MỘT SỐ CÂY THUỘC HỌ ZINGIBERACAE .
............................................................................................................................. 14
1.4 TÍNH ƯU VIỆT KHI VI NHÂN GIỐNG CÂY VỚI GIÁ THÀNH THẤP ..... 16
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................. 17

vii


2.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM ..................................................................... 17
2.1.1 Thời gian và địa điểm .............................................................................. 17
2.1.2 Vật liệu thí nghiệm................................................................................... 17
2.1.3 Điều kiện thí nghiệm ................................................................................ 17
2.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .................................................................... 18
2.2.1 Giai đoạn chuẩn bị ................................................................................... 18
2.2.2 Giai đoạn nhân chồi in vitro ..................................................................... 19
2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với IBA và điều
kiện môi trường ngoại cảnh đến khả năng nhân chồi nghệ đen ................... 19
2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và điều kiện môi trường
ngoại cảnh đến sự thành lập rễ in vitro ....................................................... 20
2.3 PHÂN TÍCH SỐ LIỆU ................................................................................... 21
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ................................................................... 22
3.1 GHI NHẬN TỔNG QUAN ............................................................................ 22
3.2 THÍ NGHIỆM 1: ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ BA ,IBA VÀ ĐIỀU KIỆN
MÔI TRƯỜNG NGOẠI CẢNH ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN CHỒI NGHỆ ĐEN IN
VITRO .................................................................................................................. 22
3.2.1 Các chỉ tiêu về chồi .................................................................................. 22
3.2.2 Hàm lượng diệp lục tố .............................................................................. 25

indole acetic acid

HgCl2

Clorua thủy ngân

DPU

diphenylurea

IMA

imazalil

TDZ

thidiazuron

MS

môi trường Murashige & Skoog (1962)

ANOVA

Analysis of variance

dd

dung dịch



30

3.4

Ước tính giá thành sản xuất một chồi nghệ đen (C. zedoaria) cấy mô

34
35

x


DANH SÁCH HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

1.1

Đặc điểm hình thái và cấu trúc giải phẫu cây nghệ đen (Curcuma
zedoaria (Berg.) Roscoe)

3

2.1



TÓM LƯỢC

Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria (Berg.) Roscoe) là cây được sử dụng nhiều
trong đông y vào những năm gần đây. Hiện nay thực tế sản xuất cần một lượng giống
lớn để trồng. Do vậy vi nhân giống cây nghệ đen cần được nghiên cứu và sau đó áp
dụng vào sản xuất. Giai đoạn vi nhân chồi và ra rễ in vitro được thực hiện trong hai
điều kiện môi trường ngoại cảnh khác nhau là phòng tăng trưởng có ánh sáng nhiệt độ
nhân tạo (1.000 – 2.000 lux, 27 ± 3oC) và ngoài phòng tăng trưởng (lồng kiếng) với
nguồn sáng, nhiệt độ tự nhiên (6.000 – 12.000 lux, 31 ± 3oC). Kết quả cho thấy từ một
chồi ban đầu cấy vào môi trường nền MS (Murashige and Skoog, 1962), bổ sung 20%
nước dừa có hay không có mặt 1 mgBA/lít + 0,5 mgIBA/lít đều cho ra 4 chồi/1 chồi
ban đầu sau 5 tuần nuôi cấy. Nếu gia tăng nồng độ BA và IBA vào môi trường không
làm tăng thêm số chồi hữu hiệu (chồi có chiều cao 7 cm). Môi trường nuôi cấy có chứa
0,4 mgNAA/lít có tác dụng kích thích hình thành rễ cao nhất (6 rễ/chồi sau 2 tuần nuôi
cấy).
Kết quả nghiên cứu này cho thấy cây nghệ đen có thể nuôi cấy trong lồng kiếng
với ánh sáng tự nhiên thay cho phòng tăng trưởng với ánh sáng và nhiệt độ nhân tạo sẽ
giảm được khoảng 28% giá thành sản xuất do không phải chi trả tiền điện.


MỞ ĐẦU

Xu thế sử dụng nguồn dược liệu tự nhiên của y học cổ truyền ngày càng gia tăng
và trở thành xu thế chung của lĩnh vực y học đương đại. Nghệ đen (Curcuma zedoaria
(Berg.) Roscoe), thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) được biết đến một cách gần gũi và
phổ biến như vị thuốc có tác dụng rất tốt đối với các bệnh lý về đường tiêu hóa: viêm
niêm mạc dạ dày và loét tá tràng, ăn uống chậm tiêu, đầy hơi, đau bụng, buồn nôn…
Đây là loại thuốc hoạt huyết chữa các chứng bệnh gây ra do xung huyết, ứ huyết (huyết
trệ). Ngoài ra còn dùng làm thuốc bổ dưới dạng thuốc sắc, thuốc bột hoặc viên.

Đài Loan và các tỉnh phía nam lục địa Trung Quốc. Ngoài ra, cây còn phân bố cả ở
Madagasca. Ở Việt Nam, nghệ đen phân bố rộng rãi khắp các tỉnh miền núi và trung
du, nhất là Hà Giang, Lai Châu, Yên Bái, Lào Cai, Tuyên Quang, Sơn La, Cao
Bằng,… ở phía nam có tỉnh Bình Định và Quảng Nam. Cây còn được trồng rải rác
trong nhân dân. Ở Hưng Yên (vùng Nghĩa Trai), nghệ đen được trồng đại trà ở ruộng,
để chủ động cho việc cung cấp nguyên liệu (Đỗ Huy Bích et al., 2004).
1.1.2 Đặc điểm hình thái
Theo Võ Văn Chi (2003), nghệ đen thuộc loại thân thảo, cao từ 1 – 1,5m, có
thân rễ hình nón, có khía dọc; củ tỏa ra theo hình chân vịt, dày, nạc, màu vàng nhạt ở
trong; củ già có những vòng màu đen. Ngoài những củ chính ra, còn có những củ phụ
có cuống trái xoan hay hình quả lê, màu trắng. Lá có bẹ dài ở gốc, phiến hình mũi mác,
dài tới 60 cm, rộng 8cm, có những đốm đỏ dọc theo gân chính, không có cuống hay có
cuống ngắn. Cán hoa ở bên cạnh thân có lá, mọc từ rễ, dài tới 20 cm, thường xuất hiện
trước khi ra lá. Cụm hoa hình trụ, dài tới 20 cm, rộng 5 cm; lá bắc phía dưới hình trái
xoan hay hình mũi mác tù, lợp lên nhau, màu lục nhạt, viền đỏ ở mép; các lá bắc trên
không sinh sản màu vàng nhạt, điểm thêm màu hồng ở chóp. Hoa nhiều, dài 4 – 5 cm,


màu vàng. Đài hình ống, có lông, có 3 răng không đều. Tràng hình ống dài hơn đài 3
lần, các thùy hình mũi mác tù. Bao phấn hình trái xoan có các ô kéo dài xuống phía
dưới thành cựa rẽ ra, ngọn trung đới dạng bản tròn; chỉ nhị dính với các nhị lép. Cánh
môi thót lại ở gốc, lõm lại ở đỉnh, màu vàng. Nhị lép hình mũi mác tù hay thuôn, dính
nhau ở nửa dưới. Bầu có lông; nhụy lép hình dùi.

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc giải phẫu cây nghệ đen
Curcuma zedoaria (Berg.) Roscoe
(Nguồn: Koehler's Medicinal-Plants, 1887)

3



Theo Đỗ Huy Bích et al., (2004), các sesquyterpen trong củ nghệ đen thuộc
nhiều nhóm:
o Germaran: curdion, dehydrocurdion, germacron – 7, 8 – epoxyd, 13 –
hydroxygermacron, zederon, furanodienon, furanogermenon, furanodien,
isofuranodienon.
o Eleman:

zedoaron,

curzerenon,

epicurzerenon,

curzeren

(isofuranogermacren).
o Cadinan: curzeon
o Eudesman: curcolon
o Guaian: procurcumenol, curcumadiol, isocurcumenol, zedoarondiol,
zedoarol, và một số chất thuộc nhóm khác: curcumenon, curcumanolid
A, curcumanolid B.
Ngoài ra, còn có một số chất khác như curcumin, bis (4 – hydroxycinamoyl) –
methan, 4 – hydroxy – cinamoyl feruloylmethan, ethyl p – methoxycinamat. Chất ethyl
p – methoxycinamat có tính kháng nấm. Trong củ nghệ đen còn chứa Sr, Zn, Cu, Ni,
Fe, Mn, Ti, Cr, Pb, Ca, K (Vũ Ngọc Lộ et al.,1997).
1.1.6 Tác dụng dược lý của nghệ đen
Trong y học cổ truyền, nghệ đen được xếp vào nhóm thuốc hoạt huyết cùng các
vị thuốc như ngưu tất, xuyên khung, ích mẫu, khương hoàng, tô mộc với tên nga truật
(Rhioma curcumae zedoriae). Thuốc hoạt huyết là những thuốc chữa các chứng bệnh

* Giai đoạn chuẩn bị: lựa chọn, chuẩn bị cây mẹ
Theo George (1993) trước khi tiến hành vi nhân giống, cần phải chú ý đến sự
lựa chọn cây mẹ. Chúng phải là điển hình của giống hoặc loài và không có bất kỳ triệu
chứng bệnh nào. Sự chuẩn bị này có thể tạo thuận lợi cho việc xử lý mẫu cấy của cây
trồng được chọn góp phần thành công cho quá trình nuôi cấy in vitro.
* Giai đoạn 1: Bắt đầu nuôi cấy, giai đoạn này bao gồm việc lấy mẫu, khử trùng và
nuôi dưỡng trong điều kiện vô trùng
Thông thường một đợt khử trùng mẫu cấy được chuyển vào môi trường trong
cùng một thời gian. Sau một thời gian nuôi cấy, bất kỳ mẫu nào bị phát hiện nhiễm vi

6


sinh vật đều bị loại bỏ. Giai đoạn này được xem là thành công nếu có đủ một số lượng
mẫu sống sót và phát triển mà không nhiễm vi sinh vật (George, 1993).
* Giai đoạn 2: Nhân nhanh số lượng.
Số lượng cây sẽ được nhân nhanh thông qua số lần cấy chuyền sang môi trường
mới (Debergh và Read, 1991; Altman, 2000).
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là kích thích sự tái sinh chồi từ các
mầm ngủ. Mầm ngủ thực chất có cấu tạo không khác đỉnh sinh trưởng thân. Do tính ưu
thế chồi ngọn, các chồi bên ở trạng thái miên trạng và không phát triển. Do đó, khi các
chồi bên được xử lý với chất điều hoà sinh trưởng sẽ phá vỡ miên trạng và phát triển
thành những chồi có đầy đủ như thân chính. Các chồi có thể được tách ra, đưa vào môi
trường tạo rễ để tạo thành cây hoàn chỉnh hay sử dụng cho quá trình nhân giống trở lại.
* Giai đoạn 3: Kéo dài và kích thích ra rễ.
Giai đoạn này giúp cây con phát triển hoàn chỉnh trước khi chuyển ra điều kiện
bên ngoài (Debergh và Read, 1991; Altman, 2000). Ra rễ là giai đoạn rất quan trọng
của bất kỳ chương trình nhân giống in vitro nào. Một số ít loài hình thành rễ bất định
trong suốt giai đoạn 3, nhưng thông thường cần phải tiến hành ra rễ trong một môi
trường hoặc một phương pháp đặc biệt để kích thích ra rễ. Để giảm chi phí vi nhân

một số vi lượng đặt biệt là boron và maganese (Cohen, 1995).
* Nguồn cacbon
Đường sucrose là nguồn cacbon được sử dụng phổ biến vì giá thành rẻ, dễ kiếm,
khá bền khi thanh trùng, cây trồng dễ đồng hóa. Một số cacbohydrate khác cũng được
sử dụng như glucose, maltose, galactose…(Fowler, 2000).
* Chất điều hòa sinh trưởng
Các nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm: cytokinin, auxin, gibberellin,
ethylene và abscisic acid.
Sự sinh trưởng và phát triển hình thái in vitro được điều hòa bởi sự tác động qua
lại và cân bằng giữa những chất điều hòa sinh trưởng được bổ sung trong môi trường
nuôi cấy và những chất điều hòa sinh trưởng nội sinh (George, 1993). Cung cấp auxin
và cytokinin vào môi trường nuôi cấy là công cụ để điều khiển sự phân chia tế bào, kéo
dài tế bào và sự hình thành hình thái (John và Lorin, 1985). Sự cân bằng giữa hàm
lượng auxin và cytokinin là nhu cầu chủ yếu cho sự thành lập chồi và rễ bất định. Ở
8


cây thuốc lá nuôi cấy mô, người ta thấy rằng sự thành lập chồi và rễ tùy thuộc vào tỷ lệ
auxin và cytokinin trong môi trường nuôi cấy. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích
sự ra rễ, còn tỷ lệ auxin/cytokinin thấp lại dẫn đến sự thành lập chồi (Taiz và Zeiger,
1991).
Sự cân bằng chất điều hòa sinh trưởng còn tùy thuộc và các yếu tố khách quan
trong in vitro (cấy chồi, rễ, mô) và vi nhân giống ở giai đoạn nào (khởi đầu, nhân
nhanh hay ra rễ). Ở giai đoạn nhân nhanh, mức độ cytokinin thông thường phải cao
hơn auxin. Còn ở giai đoạn ra rễ, ngược lại sử dụng cytokinin trong một số trường hợp
là không cần thiết và hàm lượng auxin cao hơn có thể bổ sung vào môi trường nuôi
cấy.
Cytokinin đóng vai trò quan trọng trong sự tạo chồi bên của cây nuôi cấy mô,
tuy nhiên khi sử dụng cytokinin ở nồng độ cao để kích thích tạo chồi bên có thể làm
cản trở sự tăng chiều cao của chồi và ảnh hưởng đến khả năng tạo rễ của chồi ở giai

trưởng hoặc sự phát sinh hình thái thể hiện trong điều kiện in vitro bị giảm bớt khi cây
mẹ được xử lý ánh sáng trước khi lấy mẫu .
Khi được cung cấp đầy đủ CO2 và năng lượng ánh sáng, theo lý thuyết những
chồi có lá hoặc cây con in vitro đủ khả năng đồng hóa carbon từ quang hợp để tồn tại
dạng tự dưỡng. Nếu CO2 hoặc ánh sáng dưới ngưỡng cho phép, quang hợp đạt tới điểm
bù của nó, tại đây tỷ lệ chất khô tích lũy không đủ để cung cấp cho hô hấp. Nếu quá
trình này xảy ra lâu dài ở điều kiện in vivo thì một phần hay cả cây trồng sẽ chết. Trong
tình huống ánh sáng không đủ để đưa quang hợp lên trên điểm bù có thể đưa đến tích
lũy CO2 trong bình nuôi cấy, vì tỷ lệ hô hấp vượt quá sự quang hợp (George, 1993).
* Sự hình thành diệp lục tố trong nuôi cấy mô
Diệp lục tố là sắc tố màu xanh trong cây trồng rất cần cho quang hợp. Tất cả các
hoạt động của sắc tố được tìm thấy trong lục lạp. Điểm nổi bật nhất về cấu trúc lục lạp
là hệ thống mở rộng của các màng nội bào gọi là thylakoids. Tất cả các diệp lục tố
được chứa đựng trong hệ thống màng này, là vị trí của các phản ứng ánh sáng của sự
quang hợp. Các sắc tố hiện diện trên màng thylakoids của thực vật bậc cao chủ yếu
gồm có hai loại chlorophylls (chl) là chl a và chl b. Cũng có sắc tố từ màu vàng tới cam
của carotenoids, có hai loại là hydrocacbon tinh khiết carotenes và xanthophylls có

10


chứa oxygen. Ngoài ra còn có violaxanthin (là một xanthophyll) cũng hiện diện trên vỏ
lục lạp, làm cho nó có màu vàng ( Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
Khi các mô sẹo hay tế bào huyền phù được chuyển ra ngoài sáng, chúng có thể
phát triển lục lạp và bắt đầu quang hợp, nhưng hiếm khi trở nên tự dưỡng. Màu xanh
nói chung xuất hiện rất chậm so với những chồi của cây nẩy mầm trong tối, và có thể
mất khoảng 8 tuần để đạt được hàm lượng diệp lục tố tối đa (George, 1993). Sự hình
thành lục lạp trong các tế bào nuôi cấy có khuynh hướng bị biến dạng cấu trúc nhiều
hơn so với lục lạp trong tế bào lá. Có thể chúng không phát triển đến một tỷ lệ nhất
định và có thể bị biến dạng phiến thylakoids (Davey et al., 1971). Ở một số ít loài thực

liệu do nhiệt độ về đêm giảm (George, 1993).
1.2.2.4 Số lần cấy chuyền
Mục đích thông thường của vi nhân giống là có thể đạt được tỷ lệ nhân giống
cao nhất (Jámbor-Benczúr và Márta-Riffer, 1990) mà không bị biến dị hay thủy tinh
thể. Tuy nhiên, tính nhạy cảm của mẫu cấy thay đổi theo thời gian và số lần cấy
chuyền (Debergh và Maene, 1981). Ở cây Fragaria số lần cấy chuyền không giới hạn
đã gây ra sự biến dị nghiêm trọng khi đưa ra ngoài đồng như không mọc rễ, hoặc rễ rất
yếu, hoa mọc quá nhiều một cách bất thường, trái nhỏ và bị biến dạng, cây trồng dị
dạng. Ở cây khóm (Ananas comosus), chồi cấy chuyền nhiều lần cũng có xuất hiện
hiện tượng chồi nhỏ, nhiều bất thường, bạch tạng, sọc lá (Nguyễn Quang Thạch et al.,
2005).
1.2.3 Ưu và khuyết điểm của phương pháp vi nhân giống
1.2.3.1 Ưu điểm
Theo George (1993) vi nhân giống có các lợi điểm sau:
- Bắt đầu từ những mẫu cấy nhỏ, chỉ cần một khoảng không gian nhỏ để nuôi
cấy hoặc nhân lên thành một số lượng rất lớn.
- Quá trình nhân giống được thực hiện trong điều kiện vô trùng, không mang
mầm bệnh. Do đó cây con tạo ra không nhiễm khuẩn, nấm và các vi sinh vật khác.
- Có thể tạo ra một số lượng lớn cây sạch virus.
- Hệ số nhân giống cao, có thể tạo ra một số lượng lớn cây trồng trong cùng một
thời gian.

12