BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**********

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH
VÀNG LÁ GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction)

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 – 2008
Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊNH

Tháng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**********

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH BỆNH
VÀNG LÁ GREENING TRÊN CÂY CÓ MÚI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction)

Giáo viên hướng dẫn:


TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu cải tiến quy trình giám định bệnh Vàng lá Greening trên
cây có múi bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)” được tiến hành
tại Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam, từ ngày 15/05/08 đến ngày 30/08/08.
Giáo viên hướng dẫn:
ThS. NGUYỄN THỊ NGỌC TRÚC, Viện Nghiên Cứu Cây Ăn Quả Miền Nam,
Việt Nam.
Bệnh Vàng lá Greening là một bệnh rất nguy hiểm và gây thiệt hại rất lớn đối với
cây có múi ở châu Á. Việc giám định bệnh này bằng phương pháp PCR rất hiệu quả
nhưng khá tốn kém và phức tạp. Do đó, để tiết kiệm hóa chất và đơn giản việc giám
định, chúng tôi đưa ly tâm nóng vào quy trình ly trích DNA, giảm hóa chất ly trích
DNA, giảm hóa chất PCR, tạo Kit ở dạng Master Mix, thu được một số kết quả sau:
 Việc sử dụng ly tâm nóng thay ly tâm lạnh cho tỷ lệ PCR thành công là 100 %
với cặp primer OI1/OI2c. Có thể ứng dụng kết quả này trong điều kiện phòng thí
nghiệm cấp cơ sở.
 Hóa chất ly trích DNA giảm từ 750 µl của Cloroform: isopropanol xuống 550
µl, isopropanol giảm từ 650 µl xuống 450 µl và TE 1X 100 µl xuống còn 70 µl vẫn
cho tỷ lệ PCR thành công là 100%.
 Nồng độ primer OI1 và OI2c khảo sát giảm từ 0,5 µM xuống còn 0,2 µM
đều cho lệ PCR thành công là 100%. Mức độ rõ nét của band là như nhau ở các
nồng độ.
 Nồng độ Taq DNA polymerase khảo sát giảm từ 1,25 U xuống còn 0,6 U cho
vẫn cho tỉ lệ PCR thành công là 100%. Mức độ rõ nét của band giảm dần từ nồng độ
cao nhất 1,25 U đến nồng độ thấp nhất 0,6 U.
 Bộ Kit PCR VLG sản xuất thử nghiệm ở tuần thứ 4 vẫn cho hiệu quả PCR là
100%. Hai nồng độ Tween 20 là 0,05% và 0,3% đều cho lệ PCR thành công là 100%
sau 1 tháng bảo quản ở 40C.

ii


iii


MỤC LỤC
Trang tựa

Trang

Lời cảm tạ ........................................................................................................................ i
Tóm tắt............................................................................................................................ ii
Summary ....................................................................................................................... iii
Mục lục ..........................................................................................................................iv
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... vii
Danh sách các hình ...................................................................................................... viii
Danh sách các bảng .......................................................................................................ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu..................................................................................................2
1.2.1. Mục tiêu.................................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu ..................................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN.................................................................................................3
2.1. Cây có múi................................................................................................................3
2.1.1. Phân loại ................................................................................................................3
2.1.2. Sinh thái.................................................................................................................3
2.1.3. Đặc điểm thực vật..................................................................................................3
2.2. Vi khuẩn Liberibacter và bệnh Vàng lá Greening trên cây có múi .........................5
2.2.1. Vi khuẩn Liberibacter ...........................................................................................5
2.2.1.1. Phân loại .............................................................................................................5
2.2.1.2. Hình thái .............................................................................................................6
2.2.1.3. Đăc điểm genome và cơ sở chẩn đoán bệnh bằng PCR .....................................6

3.2.3. Thử nghiệm sản xuất Kit PCR cho giám định bệnh VLG...................................23
3.3. Vật liệu và hóa chất ................................................................................................23
3.3.1. Mẫu lá cây có múi ...............................................................................................23
3.3.2. Cặp primer sử dụng .............................................................................................23
3.3.3. Hóa chất...............................................................................................................24
3.3.3.1. Hóa chất ly trích DNA, điện di và phân tích sản phẩm....................................24
3.3.3.2. Hóa chất PCR ...................................................................................................24
3.3.4. Thiết bị và dụng cụ ..............................................................................................24
3.4. Phương pháp tiến hành ...........................................................................................25
3.4.1. Hoàn thiện quy trình ly trích DNA......................................................................25
3.4.1.1. Thí nghiệm 1: Thay đổi nhiệt độ trong ly tâm khi li trích DNA ......................27
3.4.1.2. Thí nghiệm 2: Giảm lượng hóa chất ly trích DNA (chloroform, isopanol) .....27
v


3.4.2. Hoàn thiện quy trình chạy PCR...........................................................................28
3.4.2.1. Thí nghiệm 3: Giảm nồng độ (giảm lượng) primer OI1 và OI2c.....................28
3.4.2.2. Thí nghiệm 4: Giảm nồng độ Taq DNA polymerase .......................................29
3.4.3. Thử nghiệm tạo Kit PCR cho giám định bệnh VLG ...........................................30
3.4.3.1. Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ chất tẩy (Tween 20) .....................................30
3.4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sát nồng độ Glycerol .......................................................31
3.4.3.3. Thí nghiệm 7: Bước đầu tạo Kit PCR VLG cho giám định bệnh VLG ...........32
3.4.4. Chỉ tiêu theo dõi ..................................................................................................33
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................34
4.1. Kết quả hoàn thịên quy trình ly trích DNA ............................................................34
4.1.1. Thí nghiệm 1: Thay đổi nhiệt độ trong ly tâm khi li trích DNA .........................34
4.1.1.1. Kiểm tra chất lượng DNA ly trích....................................................................34
4.1.1.2. Kết quả PCR .....................................................................................................35
4.1.2. Thí nghiệm 2: Giảm lượng hóa chất ly trích DNA (chloroform, isopanol) ........36
4.1.2.1. Kiểm tra chất lượng DNA ly trích....................................................................36


NT:

Nghiệm thức.

PVP:

Polyvinylpyrrolidone.

BSA:

Bovine serum albumin.

dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate.
bp:

Base pair.

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid.
Taq:

Thermus aquaticus

ctv:

Cộng tác viên.

MM

Master Mix.

DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

Trang

Hình 2.1.

Cây phát sinh loài dựa trên những trình tự 16S rDNA ................................6

Hình 2.2.

Tế bào Liberobacter.....................................................................................6

Hình 2.3.

Hình minh họa nhóm gene rplKAJL-rpoBC ở E. coli và BLO...................8

Hình 2.4.

Triệu chứng bệnh Vàng lá Greening............................................................9

Hình 2.5.

Diaphorina citri .........................................................................................10

Hình 4.1.

Ly trích DNA .............................................................................................34

Hinh 4.2.


Hình 4.10. Thử nghiệm Kit PCR VLG vừa mix ..........................................................40
Hình 4.11. Thử nghiệm Kit PCR VLG mix 4 tuần .....................................................41

ix


Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây có múi là loài cây ăn quả có giá trị kinh tế cao. Ở nước ta, năm 1995, diện tích
cây có múi là 60.000 ha với sản lượng là 380.000 tấn (Lê Thị Thu Hồng, 2000). Đến
năm 1999, diện tích cây có múi là 63.400 ha với sản lượng là 405.000 tấn (Nguyễn
Văn Kế, 2000). Với diện tích và sản lượng như vậy cây có múi góp phần đáng kể vào
nền kinh tế quốc dân.
Tuy diện tích cây có múi ngày càng tăng nhưng vấn đề bệnh hại đã làm thiệt hại
đáng kể cho nhà vườn. Trên cây có múi có rất nhiều bệnh khác nhau và nhóm gây thiệt
hại mạnh là nhóm có côn trùng truyền bệnh trung gian như bệnh Tristeza do virus
Tristeza, bệnh Vàng lá Greening (VLG) do vi khuẩn mạch dẫn Liberobacter, bệnh
Stubbon do Spiroplasma citri, bệnh Witches blood trên chanh do Phytoplasma, bệnh
vàng lá Xylella fastidiosa và bệnh lùn mất màu do virus (Lê Thị Thu Hồng, 2000).
Trong đó, bệnh Vàng lá Greening hay Huanglongbing đang lan rộng trên 50 quốc
gia, đe dọa nghiêm trọng đến nguồn gen cây có múi các châu Á và thật sự là một hiểm
họa cho nghề trồng cây có múi. Việc xác định mầm bệnh thì khó khăn vì mật số vi
khuẩn trong cây kí chủ rất thấp. Bệnh này không thể chẩn đoán dễ dàng bằng phương
pháp truyền thống như kính hiển vi điện tử, cây chỉ thị, hay ELISA (Hung và ctv, 1999
được trích dẫn bởi Ruangwong và ctv, 2006). Do đó, PCR (Polymerase Chain
Reaction) là phương pháp chẩn đoán phân tử rất hữu hiệu để phát hiện vi khuẩn
Liberibacter - tác nhân gây ra bệnh VLG. Nhưng việc giám định bệnh bằng phương

Giới

Plantae

Ngành

Magnoliophyta

Lớp

Magnoliopsida

Phân lớp

Rosidae

Bộ

Spindales

Họ

Rutaceae

Chi

Citrus.

2.1.2. Sinh thái
Vùng trồng cam quýt thường tập trung từ 350 Bắc đến 350 Nam bán cầu. Nhờ kỹ

Đợt cành mùa xuân cho ra cành dinh dưỡng và cành quả, đợt cành mùa hè và mùa thu
cho ra cành mẹ của cành quả năm tới và đợt cành mùa đông mọc ra từ những cành quả
không hữu hiệu của mùa xuân. Ở Nam Bộ, do nóng quanh năm nên các đợt lộc cành
chồng chất lên nhau. Đợt cành đầu mùa mưa cho cành quả và cành dinh dưỡng và đợt
cành giữa và cuối mùa mưa là cành mẹ của cành quả năm tới,…
Lá: Bản chất lá cam quýt là lá kép, điều này còn thấy rõ ở cam 3 lá (Poncitrus
trifoliata). Lá của các giống cam trồng trọt gồm một bản lá với cuống có một eo lá hay
còn gọi là cánh lá. Cánh lá rất to ở lá bưởi, lá trúc (Citrus hystrix), nhỏ ở lá cam, rất
nhỏ ở lá quýt, tắc và không có ở chanh tây, thanh yên (Citrus medica),… Lá có hình
dạng thay đổi theo mùa, thường có dạng elip, dày, có tuyến tinh dầu, mặt dưới có
khoảng 500 khẩu bào/mm2. Số lượng lá trên cây rất quan trọng: để tạo ra một quả
bưởi cây cần tối thiểu 60 lá, một quả cam cần 50 lá, một quả chanh cần 20-30 lá,…
nên cần có biện pháp duy trì số lá xanh nhiều và tốt.
Hoa: Hoa đơn hoặc chùm mọc ở nách lá, thơm, thường có màu trắng, nhiều nhị
đực kết thành bó ở phía gốc. Ở phía Bắc bán cầu sự phân hóa mầm hoa xảy ra từ sau
thu hoạch cho tới khoảng tháng 2-3 dương lịch.
Trái: Có hình cầu (cam), hình cầu dẹp (quýt mandarin), hình quả lê (bưởi),…Vỏ
trái có một lớp chứa tinh dầu (lớp flavedo) và một lớp màu trắng xốp (lớp albedo).
Phần ruột chia làm nhiều múi, trong mỗi múi có các lông của nội quả bì mọng nước
biến thành con tép, hình dạng, màu sắc con tép thay đổi theo loài. Dịch quả trong con
tép chứa nhiều chất bổ dưỡng, hương vị thơm đặc trưng tùy loài và các enzyme.

4


Hạt: Phần lớn các loại cam quýt là hạt đa phôi. Gồm một phần phôi hữu tính và
gồm nhiều phôi vô tính phát triển từ phôi tâm. Màu của tử diệp trắng ở bưởi, cam;
xanh ở quýt; xanh nhạt ở các loài lai (cam sành, sảnh) (Nguyễn Văn Kế, 2000).
2.2. Vi khuẩn Liberibacter và bệnh Vàng lá Greening trên cây có múi
Bệnh Vàng lá Greening do vi khuẩn Liberibacter.

Hình 2.1. Cây phát sinh loài dựa trên những trình tự 16S rDNA
(Nguồn: Teixeira và ctv, 2006).

2.2.1.2. Hình thái
Bové và cộng sự (1980) đã xác định
được hai loài Liberobacter gây bệnh VLG đó
là Liberobacter asiaticum (dòng châu Á) và
Liberobacter africanum (dòng châu Phi), vỏ
có bề dày khoảng 25 nm với 3 lớp của một vi
khuẩn Gram âm thực sự. Vi khuẩn có hai
dạng: dạng dài có chiều dài đo được 1-4 µm,
đường kính 0,15-0,3 µm và dạng tròn có
đường kính 0,1 µm (Trích dẫn bởi Lê Thị
Hình 2.2. Tế bào Liberobacter

Thu Hồng, 2000).

(Nguồn: Bové, 2006).
2.2.1.3. Đăc điểm genome và cơ sở chẩn đoán bệnh bằng PCR
Vùng 16S rDNA
Người ta dựa vào trình tự gene 16S rDNA (gene RNA ribosome 16S) của vi khuẩn
Liberibacter để tìm ra vị trí phát sinh loài của chúng, 16S rDNA của dòng (strain)
Nelpruit Nam Phi và dòng Poona châu Á đã thu được từ DNA tổng số của những cây
dừa cạn bị nhiễm HLB, thông qua việc nhân bản PCR, sử dụng universal PCR-primer
f-D1/r-P1cho việc khuếch đại 16S rDNA của prokaryote (Weisburg và ctv, 1991, trích
dẫn bởi Bové, 2006). Trong những thí nghiệm này, thao tác phải được thực hiện để
ngăn chặn sự can thiệp của những 16S rDNA lục lạp và ti thể của dừa cạn. Điều này
có thể thu được bằng việc cắt 16S rDNA của ti thể với enzyme giới hạn BclI trước khi
6




Hình 2.3. Hình minh họa nhóm gene rplKAJL-rpoBC ở E. coli và BLO
(Nguồn: Villechanoux và ctv, 1993)
Trong hình 2.3, P: promoter; T: terminator; A: attenuator. Những con số thể
hiện kích thước (bp) giữa các gene, vùng giữa các gene không thể hiện ở đây.

2.2.2. Bệnh vàng lá Greening
2.2.2.1. Lịch sử bệnh VLG
Bệnh VLG có nhiều tên gọi khác nhau theo từng địa phương, ở Trung Quốc có tên
là Hoàng Long (HLB - Huanglongbin), ở Philipine gọi là Lá vàng lốm đốm (Mottle
leaf), ở Indonesia gọi là sự thoái hóa mô libe ở phiến lá (CVPD – Citrus Vein Phloem
Degeneration),... Bệnh này được Reinking mô tả lần đầu tiên vào năm 1919 ở Trung
Quốc (dạng Châu Á), triệu chứng xác định nhờ các đặc tính thể hiện ở điều kiện nhiệt
độ mát và ấm; dạng ở châu Phi được mô tả ở Nam Phi vào năm 1937 với triệu chứng
thể hiện ở điều kiện nhiệt độ từ 20 – 240C. Năm 1956, Lin đã chứng minh bệnh VLG
có thể truyền qua mắt ghép, đây là một phát hiện có ý nghĩa cho việc kiểm soát dịch
bệnh sau này. Năm 1965, A. P. D. McClean và Oberholzer đã chứng minh bệnh có thể
truyền qua mắt ghép cũng như qua rầy chổng cánh Triozea erytreae ở Nam Phi. Năm
1967, tại Ấn Độ, Capoor và cộng sự đã thành công trong việc truyền bệnh này bằng
rầy chổng cánh Diaphorina citri. Từ 1977 – 1984, Garnier và Bove đã chứng minh
được tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Gram âm bằng kính hiển vi điện tử. Năm 1995, tổ
chức IOCV (International Organization of Citrus Virologists) đặt tên chính thức của
bệnh là Huanglongbin (HLB), và đã được chấp nhận. Ngày nay, tên HLB được dùng
rộng rãi cho các dạng bệnh châu Á, châu Phi và châu Mỹ (Bové, 2006).
8


2.2.2.2. Triệu chứng
Theo Hà Minh Trung quan sát triệu chứng bệnh trên các giống cam quýt khác nhau


9


2.2.2.3. Tác nhân gây bệnh VLG
Bệnh VLG gây ra bởi vi khuẩn Liberibacter. Cho đến nay, dựa vào trình tự
16S

người ta đã xác định được 3 dòng châu Á (L. asiaticus), châu Phi (L.

africanus) và châu Mỹ (L. americanus). Hai dòng châu Á và châu Phi được phát
hiện từ rất sớm và mãi đến năm 1995, Jagoueix và ctv mới đưa ra phương pháp
phát hiện chính xác hai loài này bằng PCR; trong khi dòng châu Mỹ được phát
hiện bởi Teixeira và ctv vào năm 2005.
2.2.2.4. Tác nhân truyền bệnh VLG
Tác nhân truyền bệnh là do hai loài rầy chổng cánh. Loài thứ nhất là Diaphorina
citri Kuwayama chịu được nhiệt độ trên 300C, truyền vi khuẩn Ca.L.asiaticus (dòng
châu Á). Loài này phân bố ở châu Á như Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Indonesia,
Malaysia, Bruney, Ấn Độ,… Loài thứ hai là Triozea erytreae Del Guercio phát triển tốt
ở nhiệt độ 22-250C, truyền vi khuẩn Ca. L. africanus
(dòng châu Phi). Loài này ở châu Phi như Nam Phi,
Sudan, Madagasca.
Người ta cũng ghi nhận vài vùng có cả hai loại
rầy và cả hai loại vi khuẩn như ở Reunion,
Mauritius, Tây Nam Ả Rập. Mỗi loại rầy đều có

Hình 2.5. Diaphorina citri
(Nguồn: VNCCAQMN,

khả năng truyền cả hai loại vi khuẩn (Aubert và

 Tình hình bệnh VLG trên thế giới
Châu Á, Đông Nam Á. D. ctri là vector, Ca. L. asiaticus là tác nhân gây bệnh
HLB, và cả hai đều chịu nhiệt. Những vùng hoặc quốc gia châu Á nơi mà Ca. L.
asiaticus đã được phát hiện bằng phương pháp EM, lai DNA, và/hoặc PCR gồm: tiểu
lục địa Ấn Độ (Ấn Độ, Pakistan, Nepal, Bhutan, Bangladesh, Sri Lanka), Đông Nam Á
(Myanmar, Thailand, Malaysia, Campuchia, Lào, Việt Nam), Đông Nam Trung Quốc,
Đài Loan, Miền Nam Nhật Bản (đảo Ryukyu, Okinawa) (Miyakawa và Tsuno, 1989),
Philipine, Indonesia (Java, Sumatra, miền Đông Kalimantan, miền Nam Sulawasi,
Bali), Đông Timor (Trích dẫn bởi Bové, 2006).
Châu Phi và bán đảo Madagascar. T. erytreae là vector, Ca. L. africanus là tác
nhân gây bệnh HLB, cả hai đều nhạy với nhiệt độ những vùng và quốc gia ở miền
Nam và miền Đông châu Phi nơi mà Ca. L. africanus được phát hiện bằng kỹ thuật
EM, lai DNA và/hoặc PCR gồm: Nam Phi, Zimbabwe, Malawi, Bunruni, Kenya,
Somalia, Ethiopia. Ở miền Tây châu Phi, bệnh này chỉ có ở Cameroon (Bové, 2006).
Bán đảo A-rập. Ở A-rập Saudi, HLB hiện diện ở vùng Biển Đỏ từ Mecca đến
Najan, gần biên giới Yemeni. Vector truyền bệnh là D. citri. HLB xảy ra những ốc đảo
nóng, đó là lý do hình thành dạng chịu nhiệt. Ở Yemen, vector là T. erytreae, và HLB
11


chỉ tìm thấy những vùng đất cao lạnh lẽo. Vì thế, HLB ở Yemen là dạng chịu nhiệt
(Bové và Garnier, 1984, trích dẫn bởi Bové, 2006).
Phía nam biên giới giữa Saudi/Yemen, ở vùng Abha-Khamis Mushayt, có cả hai
vector được tìm thấy , và hai dạng HLB có thể hiện diện. Trường hợp này có thể giải
thích như sau: ở Yemen, HLB dạng châu Phi và T. erytreae đã được tìm thấy chắc
chắn từ Ethiopia gần đó, qua phía Nam Biển Đỏ, thông qua eo biển hẹp, và di chuyển
xuống phía Nam. Ở A-rập Saudi, HLB dạng châu Á và D. citri đã đi vào bán đảo Arập, có thể di chuyển đến Mecca, và đã di chuyển về phía Nam. Cuối cùng, cả hai
vector cũng như hai dạng HLB châu Á và châu Phi, đã được tìm thấy ở vùng AbhaKhamis Mushayt. Sự di chuyển xa hơn của T. erytreae lên phía Nam bị cản trở bởi khí
hậu nóng nhưng sự di chuyển của D. citri về hướng Nam Yemen không bị suy yếu bởi
khí hậu.

chứng bệnh trên cây có múi ở phía Nam cũng được tác giả ghi nhận và mô tả (Hà
Minh Trung và ctv, 1995). Sự biểu hiện của bệnh VLG trên cây có múi ở ĐBSCL
được khẳng định qua phương pháp giám định DNA tại Đại học Đoài Lan và việc giám
định nhiều mẫu cây có múi thu thấp khắp các tỉnh trong cả nước bằng lai phân tử tại
INRa, Pháp (Bové và ctv, 1995) (Trích dẫn bởi Lê Thị Thu Hồng, 2000).
2.3. Ly trích DNA và phản ứng PCR (Polymease Chain Reaction)
2.3.1. Ly trích DNA
2.3.1.1. Nguyên lý
DNA là phân tử có kích thước lớn, do đó trong quá trình thao tác cần tránh các tác
nhân cơ học hay hóa học quá mạnh có thể làm đứt gãy phân tử này.
Phương pháp tách chiết DNA gồm 3 bước:
Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (tế bào Eukaryote). Thông thường người
ta nghiền tế bào, mô trong một hỗn hợp chất tẩy (như SDS, CTAB) và proteinase
(proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra
môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein. Mẫu được lắc thật mạnh trong các dung dịch phenol và chloroform, dung dịch
phenol: chloroform có tác dụng làm biến tính protein đồng thời hòa tan các acid
nucleic. Protein khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nước có chứa acid
nucleic và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol:
chloroform. Pha nước có chứa acid nucleic được thu nhận lại.
Bước 3: Tủa acid nucleic. Mục đích của việc tủa là thu nhận acid nucleic dưới
dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của enzyme, mặt khác có
thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Hai cách tủa thông
thường là:
13


Tủa trong ethanol, việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion cao
(nồng độ muối cao), và nồng độ ethanol cao (2,5 dung dịch ethanol/1 dung dịch mẫu),

14