VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT
TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ XẠ ĐEN
(Ehretia asperula Zoll. & Mor)

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2017


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN THỊ THU THỦY

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT
TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ XẠ ĐEN
(Ehretia asperula Zoll. & Mor)

CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGUYỄN TIẾN ĐẠT


tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành bản luận văn này.
Luận văn được tiến hành dưới sự hỗ trợ của đề tài: “Nghiên cứu thành
phần hóa học, đánh giá hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được
từ cây Xạ đen tại tỉnh Hoà Bình. Thử nghiệm tạo chế phẩm làm thực phẩm
chức năng từ các cao chiết tiềm năng”, do GS. TS. Đặng Đình Kim, Viện
Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam làm
chủ nhiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn GS. TS. Đặng Đình Kim, ThS. Vũ Thị
Nguyệt đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành bản
luận văn này.
Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình thân yêu, bạn bè, người thân và đồng
nghiệp – những người đã luôn ở bên tôi, luôn động viên, khích lệ và là chỗ
dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2017

Học viên

Nguyễn Thị Thu Thủy


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... vi
KÝ HIỆU VIẾT TẮT.................................................................................... vii
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 3

2.4.1. Phân lập hợp chất Ed 3.2 và Ed 5.5 ................................................. 33
2.4.2. Phân lập hợp chất Ed 17.3 ................................................................ 35
2.4.3. Phân lập hợp chất Ed 11.4 ................................................................ 36
2.5. Hằng số vật lý và các số liệu phổ nghiệm .............................................. 37
2.5.1. Hợp chất Ed 3.2 ................................................................................ 37
2.5.2. Hợp chất Ed 5.5 ................................................................................ 37
2.5.3. Hợp chất Ed 17.3 .............................................................................. 38
2.5.4. Hợp chất Ed 11.4 .............................................................................. 38
2.6. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity) ...................... 39
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 42
3.1. Hợp chất 1: Ed 3.2 .................................................................................. 42
3.2. Hợp chất 2: Ed 5.5 .................................................................................. 44
3.3. Hợp chất 3: Ed 17.3 ................................................................................ 47
3.4. Hợp chất 4: Ed 11.4 ................................................................................ 50
3.5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào. ........................................ 54
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................. 56
4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................ 56
4.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 58
PHỤ LỤC PHỔ ............................................................................................. 62


v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Ehretia asperula Zoll. & Mor ........................................................... 3
Hình 1.2: Cấu trúc một số hợp chât theo tài liệu ............................................. 8
Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu ....................................... 9
Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu . .................................... 10

Bảng 3.4. Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của Ed 11.4 với số
liệu phổ 1H-NMR của Methyl rosmarinate .................................................... 53
Bảng 3.5: Kết quả hoạt tính gây độc tế bào .................................................... 54


vii

KÝ HIỆU VIẾT TẮT
Ký hiệu

Tiếng Việt

Ehretia asperula Zoll. & Mor

Xạ đen

C-NMR

Carbon (13) Nucleaedr
Magnetic Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
carbon (13)

H-NMR

Hydro (1) Nucleaedr Magnetic
Resonance

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

ppm

Part per million

Một phần triệu

Ed
13

1

Tiếng Anh

s

Singlet

d

Doublet

dd

Double of doublet

Rf

retardation factors

Hep-G2


M

Methanol

E

Ethyl acetate

A

Acetone

LU-1
MCF-7
HeLa


1

LỜI MỞ ĐẦU
Vai trò quan trọng của các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đã
được khẳng định từ các nền y học cổ truyền cho đến y học hiện đại. Giá trị
của chúng không chỉ có công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh mà còn có
thể dùng làm nguyên mẫu hoặc cấu trúc dẫn đường cho sự phát hiện và phát
triển nhiều dược phẩm mới. Việt Nam được đánh giá có nguồn tài nguyên
dược liệu phong phú và có nhiều kinh nghiệm sử dụng nguồn dược liệu này
nhờ vào nền y học cổ truyền lâu đời. Theo thống kê ở Việt Nam hiện có hơn
13000 loài thực vật trong đó khoảng 4000 loài được sử dụng làm thuốc. Đây
là một lợi thế để chúng ta khai thác nguồn dược liệu này phục vụ cho cuộc

 Nghiên cứu về thành phần hóa học:
-

Phân lập các chất sạch

-

Xác định cấu trúc các chất phân lập được.

 Nghiên cứu về tác dụng sinh học:
- Khảo sát khả năng gây độc tế bào của các hợp chất đối với bốn dòng
tế bào ung thư: Hep-G2, LU-1, MCF-7, HeLa.


3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về lá Xạ đen.
1.1.1. Đặc điểm sinh thái và sự phân bố.

Hình 1.1. Ehretia asperula Zoll. & Mor
Xạ đen có tên khoa học là Ehretia asperula Zoll. & Mor thuộc họ
Vòi voi cây thân gỗ, bụi hay cây thảo có hình trụ, lá đơn mọc so le, không
có lá kèm, trên thân và cả lá bao phủ những lông cứng hoặc mềm. Hoa hầu
như luôn đều, đài hợp nhiều hoặc ít, tồn tại trên quả, sau đó lớn lên. Nhị
luôn dính với ống tràng, nhưng có phần chỉ nhị hoặc lớn hoặc nhỏ rời nhau.
Nhụy gồm 2 lá noãn và lúc đầu là bầu trên, 2 ô, với 2 noãn trong mỗi ô.
Nhưng ngay sau đó, ở đa số các cây họ Vòi voi, mỗi ô của bầu lại được
sớm phân chia bằng một vách ngăn giả. Do đó bầu nhụy trở thành có 4 ô
chứa mỗi ô một noãn. Do sự phát triển của các vách trong mỗi ô của bầu

Xạ đen được biết đến bởi mang trong mình nhiều hoạt tính sinh học
quý giá như điều trị mụn nhọt, ung thư, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch
trong xơ gan cổ chướng và đặc biệt trong chữa trị ung thư. Có tác dụng thông


5
kinh lợi niệu, cây dùng trị kinh nguyệt không đều, bế kinh, viêm gan, bệnh
lậu. Điều trị ức chế và ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư, tiêu hạch,
tiêu độc, thanh nhiệt, mát gan, hành thủy, điều hòa hoạt huyết, giảm đau, an
thần, tăng cường sức đề kháng cho cơ thể. Ở Việt Nam cũng như trên thế giới
đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính
sinh học của cây Xạ đen nhằm khai thác triệt để tiềm năng y học của cây
thuốc này. Dưới đây là một số công trình khoa học, nghiên cứu trong và ngoài
nước đối với cây xạ đen.
Năm 2012 nhóm nghiên cứu Phạm Thị Lương Hằng, Đoàn Thị Duyên,
Nguyễn Thị Yến, Ngô Thị Trang thuộc khoa Sinh học của trường Đại Học
Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia Hà Nội tiến hành thử hoạt tính sinh
học của cây xạ đen bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Họ thử
nghiệm bốn loại dịch chiết của xạ đen là dịch chiết n-Hexane, dịch chiết
EtOAc, dịch chết MeOH và dịch chiết nước trên vi khuẩn Gram dương
(Bacillus subtilis và Sarcina sp), vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli ATCC
25922 và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853). Kết quả hoạt tính sinh học
được tổng hợp ở (Bảng 1.1) [3].
Bảng 1.1. Hoạt tính sinh học của các cắn chiết xạ đen trên vi khuẩn
Gram dương Gram âm
D-d (mm)

B. subtilis

Sarcina sp.


-

-

Nước

7

-

-

-

Dịch chiết


6
Trong luận án tiến sĩ hóa học của Nguyễn Huy Cường năm 2008 với đề
tài Nghiên cứu thành phần hoá học và thăm dò hoạt tính sinh học cây Xạ đen[2,
10], đã phân lập được một số hợp chất trong cây xạ đen và khảo sát hoạt tính
sinh học của chúng trên một vài dòng tế bào ung thư. Trong luận án có bốn
chất khung friedelan: 3α-friedelanol (1), 3-friedelanon (2), D:A-friedoolednon-3,21-dion (3), canophyllol (4); năm hợp chất có khung lupan là: lup20-en-3β-ol (5), lup-12-en-3β-ol (6), lup-20-en-3-ol (lupenon, 7), lup-12-en-3on (8), lup-20-en-3β, 11β-diol (9); và hai hợp chất khác là clionasterol (10),
axit glucosyringic (11). Kết quả thử hoạt tính trên hai tế bào ung thư gan (HepG2) và ung thư phổi (Lu-1) cho thấy các hợp chất thử (1, 2, 3 và 9) đều không
thể hiện hoạt tính đối với hai dòng tế bào ung thư này. Một số hợp chất của xạ
đen có cấu trúc như sau:


7

chiều, phổ phân giải cao. Các hợp chất phân lập được là glucosyringic acid
(18), lup-20(29)-ene-3β,11β-diol (19), lup-20(29)-ene-3-one (20) và lup5,20(29)-diene-3-one (21).[8, 10]

Hình 1.4: Cấu trúc của một số hợp chất theo tài liệu [8,10].
Vào năm 1995 một số nhà khoa học của Trung quốc tên là Yao-Haur
Kuo, Chieh-Fu Chen và Li-Ming Yang Kuo[16] đã phân lập được hai hợp
chất từ cây xạ đen, một hợp chất là celahinine A (22) và một hợp chất
alkaloid mới tên của nó là sesquiterpene pyridine alkaloid emarginatine A
(23). Hợp chất mới này có tác dụng gây độc tế bào mạnh đối với tế bào Hepa2 (hepatoma), Hela, Colo 205 và các tế bào ung thư biểu mô KB (in-vitro), có


11
ED50 (KB)=4,0 µg/ml. Công thức hóa học của chúng được các tác giả xác
định bằng các phương pháp phổ 1H, 13C-NMR, COSY, NOESY và HMBC.

Hình 1.5: Cấu trúc một số hợp chất theo tài liệu [16]
Vào năm 1997 Kuo YH và Kuo LM đã phân lập được bốn hợp chất
triterpene là celasdin A, celasdin B, celasdin C và maytenfolone A từ xạ đen.
Trong bốn hợp chất hai hợp chất celasdin A và celasdin C là hai hợp chất
mới, celasdin B. Hợp chất maytenfolone A có tác dụng gây độc tế bào,


12
Maytenfolone A được tiếp tục nghiên cứu X-ray và kết quả sinh học đã cho
thấy Maytenfolone A gây độc tế bào chống lại gan (HEPA-2B ED50

=

2,3


1.1.4. Một số bài thuốc y học cổ truyền:
Bài thuốc hỗ trợ điều trị ung thư từ xạ đen lưu truyền trong dân gian là:
Dùng 50g cây xạ đen khô, 40g cây bạch hoa xà và 20g cây hoàng cầm râu, tất
cả các nguyên liệu trên đem sắc với 1,5 lít nước, sắc đến khi còn khoảng 1 lít
thì chắt ra uống. [24]
Điều trị các bệnh về gan, giúp thanh nhiệt, giải độc: Dùng 50g cây xạ
đen khô, 10g cây bá bệnh và 30g cây cà gai leo đem sắc với nước uống. [24]
Để giúp điều trị mụn, tiêu viêm lấy lá cây xạ đen đem rửa sạch rồi đun
sôi dùng thay trà uống hàng ngày, nó còn giúp cho tăng cường sức khỏe, cải
thiện giấc ngủ hiệu quả. [24]
1.2. Giới thiệu chung về các phương pháp Sắc kí.
1.2.1. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (SKLM).
a. Nguyên tắc.
Dựa vào hệ số phân tích khác nhau của chất cần phân tích giữa pha
động và pha tĩnh. Chất cần phân tích được hấp phụ (hoặc phân bố, trao đổi
ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc


14
vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động) trên pha tĩnh
trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu chất
được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác
nhau. Dựa vào hệ số phân bố khác nhau của mỗi chất đối với pha động và pha
tĩnh ta có thể tách riêng từng thành phần trong hỗn hợp phân tích. Các thành
phần sau khi phân tách riêng biệt ra khỏi hỗn hợp được lưu trữ trên pha
tĩnh.[6]
Sau đó có thể nhận biết các chất cần phân tích bằng ánh sánh thường
(nếu chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở bước sóng 254 nm, 365
nm hay phun thuốc thử hiện màu[6]….tùy thuộc bản chất chất cần phân tích
mà sử dụng một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn

những dung dịch pha loãng chất cần phân tích.
- Máy ảnh thích hợp có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày.
- Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng.
- Micropipet nhiều cỡ từ l, 2, 5, 10 đến 20 ml, các ống mao quản.
- Bản mỏng tráng sẵn silica gel.
c. Cách tiến hành.
Chuẩn bị bình khai triển thường là bình thủy tinh, hình hộp hay hình
trụ, có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu của các bản mỏng sử
dụng.Hệ dung môi thích hợp được cho vào bình triển khai sắc kí cho bão hòa
dung môi.[6]


16
Chấm một lượng chất phân tích vừa phải lên bản mỏng, nếu lượng chất
quá lớn làm cho vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số Rf
gần nhau sẽ bị chồng lấp còn nếu lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện
được do độ nhạy của thuốc thử không đủ. Lượng mẫu thông thường cần đưa
lên bản mỏng là 0,1 - 50 mg ở dạng dung dịch trong ether, c1oroform, nước
hay dung môi thích hợp khác. Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 0,005 ml
đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2 ml
khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng vạch như trong trường hợp sắc ký điều
chế. Ðối với các dung dịch có nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trực tiếp
trên bản mỏng bằng cách chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi
lần chấm.
Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5cm - 2 cm và kẻ
vạch xuất phát cách bề mặt dung môi từ 0,8 - 1cm, vạch tiền tuyến dung môi
là vạch kết thúc đường đi của dung môi. Các vết chấm phải nhỏ, có đường
kính 2 - 6 mm và cách nhau 15 mm. Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản
mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ. Với những trường hợp phân tích bán
định lượng phải dùng các mao quản định mức chính xác. Khi không cần định