ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP
GLYCOPROTEIN (GP5) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP
VÀ SINH SẢN Ở LỢN (PRRSV)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên, 2015

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng
dẫn của PGS.TS. Lê Văn Sơn các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và
chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Hà Đăng Chiến

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN




DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu
bp

Tên tiếng Anh
Base Pairs

CS

Tên tiếng Việt
Cặp bazơ nitơ
Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic Acid

dNTP

Deoxynucleoside Triphosphate

E.coli

Escherichia coli

EtBr

Ethidium Bromide


Optical Density

Mật độ quang

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

Porcine Reproductive and

Hội chứng rối loại hô hấp

Respiratory Syndrome

và sinh sản ở lợn

Porcine Reproductive and

Virus gây hội chứng rối loại

Respiratory Syndrome virus

hô hấp và sinh sản ở lợn

PRRS

PRRSV
RNA

X-gal

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-BetaD-Galacto-Pyranoside

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


iv

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................i LỜI CẢM
ƠN ..................................................................................................ii DANH MỤC CÁC TỪ
VIẾT

TẮT

...............................................................

iii

MỤC

LỤC

......................................................................................................iv

DANH

MỤC


2.1.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ......................................................... 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ 19
2.2.1. Tạo dòng gen gp5 ............................................................................. 19
2.2.2. Tạo vector tái tổ hợp mang gen gp5 ................................................ 21
2.2.3. Phương pháp biểu hiện và tinh sạch protein GP5 ........................... 25
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................... 29
3.1. Tạo dòng vector mang gen mã hóa protein GP5 .................................... 29
3.2. Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen mã hóa protein GP5...................... 32
3.3. Biểu hiện và tinh sạch protein GP5 trong E.coli .................................... 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 41
1. Kết luận...................................................................................................... 41
2. Đề nghị....................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 42

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS ................................................... 10
Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pBT .......................................................... 16
Hình 2.2. Cấu trúc vector biểu hiện pET 32a(+) ........................................... 17
Hình 3.1. Kết qủa điện di sản phẩm colony - PCR khuẩn lạc mang gen GP5 ...... 30
Hình 3.2. Kết quả cắt kiểm tra và tinh sạch pBT-GP5 .................................. 31
Hình 3.3. Kết quả cắt kiểm tra plasmid pET 32a(+) bằng enzyme cắt giới hạn
SacI và HindIII .............................................................................................. 32
Hình 3.4. Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn
SacI và HindIII .............................................................................................. 34
Hình 3.5. Kết quả điện di SDS-PAGE dịch nuôi vi khuẩn mang vector tái

giới và được ghi nhận lần đầu tiên tại Bắc Mỹ năm 1987, do lợn mắc bệnh thường bị
xung huyết ở tai, lúc đầu đỏ sẫm sau đó tím xanh. Đặc trưng của bệnh, với lợn cái,
PRRS gây hậu quả nghiêm trọng như sảy thai, đẻ non, lợn con sinh ra yếu ớt, chết
non, tình trạng bệnh âm ỉ gây rối loạn sinh sản như động dục kéo dài, chậm động dục
trở lại. Đối với lợn đực giống, PRRS làm giảm số lượng tinh dịch, chất lượng tinh dịch
kém, ảnh hưởng đến tỷ lệ thụ thai và chất lượng đàn con [9]. “Lợn tai xanh” là bệnh
truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, do virus PRRS (PRRSV), thuộc họ Arteriviridae, bộ
Nidovirales gây ra. Bệnh lây lan nhanh và làm chết nhiều lợn nhiễm bệnh [1].
Hiện nay, PRRS đã và đang trở thành dịch ở nhiều nước trên thế giới, gây tổn
thất nặng nề cho nền kinh tế. PRRS lần đầu tiên được phát hiện ở Hoa Kỳ vào năm
1987, châu Âu tại Đức năm 1990, tại Hà Lan năm 1991 và tại châu Á vào đầu những
năm 1990 [36]. Tại Việt Nam, PRRSV được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ năm
1997 bằng phản ứng huyết thanh học. Gần đây, từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên
tiếp xảy ra các đợt dịch bệnh ở nhiều địa phương trong cả nước, gây thiệt hại hàng
trăm tỷ đồng cho ngành chăn nuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn
virus lây nhiễm [7].
Virus PRRS có tính thích ứng rất cao đối với các đại thực bào ở phổi. Hệ gen
của PRRSV là phân tử RNA sợi đơn dương, có cấu trúc tương tự cấu trúc của
Coronavirus, gồm 7 khung đọc mở gối lên nhau mã hóa cho 7 protein của virus
gồm: GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, M và N. Trong số đó, protein GP5 (glycoprotein 5)
được mã hoá bởi ORF5, là một protein được

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


glycosyl hoá, gắn với màng bọc ngoài của PRRSV, có tính kháng nguyên
mạnh và chịu trách nhiệm gây bệnh của virus.
Protein GP5 là đích chủ yếu của các kháng thể trung hoà, tham gia vào cơ chế
“lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của PRRSV, do ngăn cản hiện tượng
trình diện kháng nguyên virus của các đại thực bào với các tế bào có thẩm quyền

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and
Respiratory Syndome, PRRS), là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho lợn. Biểu hiện đặc
trưng là các rối loạn sinh sản ở lợn cái như sảy thai, thai chết lưu, lợn sinh ra chết yểu,
cũng như lợn con theo mẹ và lợn cái hậu bị còn thể hiện viêm đường hô hấp rất nặng
như: sốt, ho, khó thở, chết với tỷ lệ cao [6], [20]…
Bệnh còn được gọi bằng một số tên khác như:
Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery Disease Syndome). Hội chứng vô sinh và hô hấp ở
lợn, viết tắt là SIS (Swine Infertility and Respiratory Syndromde). Hội chứng hô hấp và
sảy thai ở lợn, viết tắt là PEARS (Porcine Endemic and Respiratory Syndrome). Hội
chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory
Syndrome). Bệnh lợn tai xanh (Blue- ear Disease).
Năm 1992, Hội nghị quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St. Paul, Minnesota
(Mỹ) đã nhất trí dùng tên hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) và được
tổ chức Thú Y thế giới công nhận. Bệnh được gây ra bởi virus PRRS, tồn tại dưới
dạng hạt virion gây nhiễm.
1.1.2. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
* Cơ chế gây bệnh và các phương pháp lan truyền


Virus gây PRRS có trong dịch mũi, nước bọt, phân và nước tiểu của lợn ốm
hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trường; tinh dịch của lợn đực giống nhiễm
virus cũng là nguồn lây lan bệnh. Ở lợn cái mang thai, virus có thể từ mẹ xâm nhiễm
sang bào thai và gây bệnh.
Virus gây PRRS có thể xâm nhập vào cơ thể lợn theo đường hô hấp, tiêu hóa
và đường âm đạo. Sau khi xâm nhập, đích tấn công chủ yếu của virus là các đại
thực bào ở phế nang. Đây là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt của
virus, vì thế chúng hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong loại tế bào này
và phá hủy nó. Ở lợn mắc bệnh, một tỷ lệ lớn các tế bào đại thực bào trong nang phổi
bị virus xâm nhập rất sớm và phá hủy làm giảm khả năng phòng vệ của phổi. Lúc
đầu, PRRSV có thể kính thích sự tăng sinh của đại thực bào nhưng sau 2-3 ngày,

Hiện nay chưa có thuốc điều trị đặc hiệu lợn mắc PRRS, do vậy việc phòng
bệnh bằng vaccine và vệ sinh phòng bệnh, tiêu độc khử trùng hiện đang là hai biện
pháp hữu hiệu ở nhiều cơ sở chăn nuôi lợn. Để chủ động phòng chống dịch, cần thực
hiện đồng bộ, kiên quyết các giải pháp phòng, chống dịch như: Phát hiện sớm, bao
vây xử lý kịp thời các ổ dịch; công tác tuyên truyền thực hiện sâu rộng tới các ngành,
các cấp và người dân tham gia chăn nuôi; đặc biệt có sự chỉ đạo quyết liệt của chính
quyền các cấp từ Trung ương tới các địa phương. Trường hợp có tỷ lệ lợn trong đàn
kiểm tra huyết thanh dương tính cao thì tiêu hủy là phương pháp hiệu quả. Tuy nhiên,
phương pháp tiêu hủy rất tốn kém và có thể dẫn đến mất đi những giống thuần. Điều
này cho thấy trong chăn nuôi lợn việc chẩn đoán sớm những con lợn mang trùng mà
chưa có dấu hiệu lâm sàng là rất cần thiết và cấp bách. Các biện pháp quản lý
không được kết hợp để cải thiện điều kiện chăn nuôi thì nguy cơ dịch viêm phổi vẫn
sẽ tồn tại [35].
* Tình hình dịch bệnh trên thế giới và ở Việt Nam
+ Trên thế giới
Từ năm 2005 trở lại đây, 27 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục
trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức Thú y thế giới khẳng định phát hiện có bệnh Tai
xanh lưu hành.
Hiện nay, hội chứng này đã trở thành dịch địa phương ở nhiều nước
trên thế giới, kể cả các nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển như Mỹ, Hà

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức... và đã gây ra những tổn thất rất lớn về kinh tế
cho người chăn nuôi lên đến hàng trăm triệu đô la [27]. Như hàng năm Mỹ phải
chịu tổn thất cho bệnh Tai xanh gây ra khoảng 560 triệu USD. Các nước trong khu vực
có tỷ lệ bệnh Tai xanh lưu hành rất cao. Ở Trung Quốc là 80%. Đài Loan là 94,7% 96,4%, Philippine là 90%, Thái Lan là
97%, Malaysia là 94%, Hàn Quốc là 67,4% - 73,1%[5].
Tại Trung Quốc: Theo báo cáo của đoàn chuyên gia quốc tế và chuyên gia của

và cả đàn được tiêu hủy ngay [6]. Tuy nhiên, theo điều tra ở một số địa bàn thuộc
thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận cho thấy 25% mẫu huyết thanh lợn có
kháng thể virut PRRS (596/2308 mẫu) và
5/15 trại (chiếm 33%) có lưu hành huyết thanh bệnh lợn Tai xanh. Năm
2003, tỷ lệ huyết thanh dương tính với bệnh tai xanh trên lợn nuôi tập trung
ở Cần Thơ là 66,86%. Như vậy, PRRS đã được phát hiện ở Việt Nam từ năm
1997, tuy nhiên, từ năm 1997 đến trước tháng 3 năm 2007 chưa phát hiện
các ổ dịch lâm sàng trên đàn lợn. Việc xảy ra các ổ dịch lần đầu ở các tỉnh phía Bắc
có liên quan đến tình hình dịch ở các nước láng giềng. Theo thông báo của các tổ
chức quốc tế, trong năm 2006, dịch xảy ra nghiêm trọng ở một số nước trong khu
vực. Từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy ra các đợt dịch bệnh ở nhiều địa
phương trong cả nước, gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho ngành chăn nuôi do phải
tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn virus lây nhiễm. Mặc dù chưa có những
nghiên cứu cụ thể về tốc độ lây lan của virus, nhưng quan sát dịch tễ học đợt dịch lần
thứ nhất (tháng 3, 4 năm 2007) cho thấy chỉ một thời gian ngắn sau khi Hải Dương
có dịch thì sáu tỉnh lân cận của vùng đồng bằng Bắc Bộ là Hưng Yên, Quảng Ninh,
Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hải Phòng. Số lợn mắc bệnh 31.750 con, số lợn
chết và xử lý 7.296 con [15].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


1.1.3. Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRSV)
Qua nghiên cứu giải mã gen của virus tại Mỹ và Trung Quốc cho thấy các
chủng PRRSV tại Việt Nam có mức tương đồng về amino acid từ 99% đến 99,7% so
với chủng virus gây bệnh thể độc lực cao ở Trung Quốc và đều bị mất 30 axít amin.
Điều này cho thấy các chủng PRRSV ở nước ta hiện nay thuộc dòng Bắc Mỹ, có độc lực
cao giống chủng ở Trung Quốc [16].
Nhiều nghiên cứu của các tác giả trong nước từ năm 2009 đến nay đã nhận
định PRRSV tại Việt Nam hiện nay được xác định thuộc chủng Bắc Mỹ dòng Trung

C;

o
trong điều kiện 4 C virus có thể sống một tháng; nhiệt độ cao virus đề kháng kém ở
o
o
37 C chịu được 48 giờ, 56 C bị chết sau một giờ, virus thích hợp ở pH 5 -7. Với
các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit, virus dễ dàng bị tiêu
diệt. Dưới tác động của ánh nắng mặt trời hoặc tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng
[10], [12].
+ Khả năng gây bệnh của virus
Người và các động vật khác không mắc PRRS, tuy nhiên trong các loài thuỷ
cầm chân màng có vịt trời (Mallard duck) lại mẫn cảm. Virus có thể nhân lên ở loài
động vật này và chính đây là nguồn reo rắc mầm bệnh trên diện rộng nên rất khó
khống chế [18]. Virus gây bệnh cho lợn ở tất cả các lứa tuổi, nhưng lợn con và lợn cái
mang thai thường mẫn cảm hơn cả. Lợn rừng là động vật mang trùng và có thể coi là
nguồn dịch thiên nhiên [12]. Về độc lực, các nghiên cứu cho thấy virus gây PRRS tồn
tại dưới 2 dạng đó là dạng cổ điển và dạng biến thể độc lực cao. Dạng cổ điển có độc
lực thấp, ở dạng này khi lợn mắc bệnh thì có tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1 - 5% trong tổng
đàn. Dạng biến thể độc lực cao gây nhiễm bệnh cho lợn lây lan nhanh, trầm trọng và
chết nhiều [34].
+ Cấu trúc và chức năng của virus
Cấu trúc:

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Hình 1.1. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS
Dưới kính hiển vi điện tử PRRSV là loại có vỏ bọc, hình cầu, có kích
thước từ 45 - 80 nm, chứa nhân nucleocapsid có kích thước từ 25 - 35 nm, trên bề

bởi ORF7, protein

màng (M-membrane) trọng lượng khoảng 19 kDa quy định bởi ORF6 và protein
vỏ glycoprotein (E-envelope, GP5) trọng
lượng khoảng 24-25 kDa quy định bởi ORF5. Những nghiên cứu gần đây cho thấy
rằng ORF 2, 3 và 4 của Lelystad virus(LV), chủng Châu Âu của PRRS virus có lẽ mã
hóa cho 3 membrane-associated glycoprotein khác là:
29-30 kD GP2, 45-50 kD GP3, 31-35kD GP4 [22], [23], [33].
1.2. Protein tái tổ hợp
1.2.1. Giới thiệu
Hiện nay nhu cầu sử dụng kháng nguyên là protein trong chuẩn đoán bệnh lý
cũng như sản xuất vaccine là rất cao. Tuy nhiên, PRRSV thường khó nuôi trên môi
trường tế bào. Chúng chỉ phát triển tốt trên môi trường đại thực bào túi phổi heo
(PAM) và một số dòng tế bào thận khỉ Châu Phi. Hiện tại

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


người ta chưa thành công trong việc tuyển lựa các dòng tế bào này trong nuôi cấy
nhân tạo. Các dòng tế bào thận khỉ thường không nhạy cảm cho tất cả các chủng virus
PRRS. Chính vì thế phương pháp sản xuất protein tái tổ hợp cho PRRSV là hướng đi
đúng và mang lại nhiều ưu điểm, đặc biệt sản xuất protein tái tổ hợp mã hóa bởi ORF5
mang tính ứng dụng cao trong các thử nghiệm như dùng làm vật liệu trong các kit
chẩn đoán, tạo vaccine tái tổ hợp thế hệ mới… Sản xuất protein tái tổ hợp mở ra
khả năng tạo số lượng lớn kháng nguyên dùng làm vật liệu trong chẩn đoán nhất
là khi dịch bệnh bùng phát. Sản xuất protein tái tổ hợp cũng góp phần khắc phục
được nhược điểm hiện tại là khó nuôi cấy PRRSV trên môi trường tế bào như đã nêu ở
trên.
1.2.2. Glycoprotein (GP5)
ORF5 của PRRSV mã hóa cho protein vỏ GP5 có kích thước khoảng

1.2.3. Sản xuất protein tái tổ hợp dựa trên ORF5
Protein tái tổ hợp được sản xuất bằng cách chèn gen ORF5 mã hóa cho
protein GP5 vào sau promoter của pET 32a(+). Kết quả tạo ra plasmid tái tổ hợp là
pET 32a(+)/GP5, có thể biểu hiện được protein có kích thước
25kDa trong tế bào E.coli chủng BL21. Protein này có kích thước tương tự
với kích thước protein GP5 biểu hiện trong tế bào túi phổi heo và vẫn giữ
được cấu trúc kháng nguyên của Protein GP5 tự nhiên. Hiện nay người ta tập trung
hướng nghiên cứu ứng dụng protein tái tổ hợp dựa trên ORF5 của virus PRRS trong
sản xuất vaccine vì protein GP5 được quy định bởi ORF này có chứa những epitope
trung hòa chính quan trọng của PRRSV [25].
Để tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với kháng nguyên của
PRRSV, các vector tái tổ hợp biểu hiện các protein của virus được gắn với các
protein khác nhau hoặc cùng biểu hiện nhiều protein của virus cùng lúc. Chuột
tiêm GP5 và M biểu hiện từ vector replication-defective adenovirus có hàm lượng
kháng thể trung hòa cao hơn đáng kể so với chuột chỉ tiệm vector biểu hiện GP5 hoặc
M riêng rẽ [35].

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


1.2.4. Vector biểu hiện pET 32a(+) và chủng biểu hiện BL21
- Vector biểu hiện pET 32a(+)
Hệ thống vector hiểu hiện pET cho phép dòng hóa và biểu hiện protein tái tổ
hợp ở dạng dung hợp với một homo oligohistidine (6xHis) trong tế bào E. coli. Sự biểu
hiện của gen mục tiêu được kiểm soát bởi promotor T7 và nhờ hoạt tính của T7
RNA Polymerase của tế bào chủ được biến đổi bởi phage T7. Vector biểu hiện này
chứa đoạn DNA mã hóa oligohistidine gọi là His-tag, đoạn này có thể chứa 6, 8 hoặc
10 acid amin. Vector biểu hiện pET
32a(+) có đầy đủ các yếu tố di truyền đảm bảo chức năng cơ bản của một plasmid
như: sao mã, phiên mã độc lập và ổn định qua các thế hệ tế bào. Ngoài ra, hệ vector

Gen hsdS: là một gen có chức năng phân giải plasmid ngoại lai xâm nhập tế
bào chủ, chủng BL21 khuyết hsdS để quá trình biến nạp vector tái tổ hợp được hiệu
quả hơn.
Gen gal: chủng BL21 (DE3) khuyết gen gal giúp tránh việc tế bào sử
dụng galactose làm nguồn cacbon cho sinh trưởng.
Gen dcm: là gen methyl hóa trình tự (CCAGG và CCTGG), chủng khuyết gen
dcm tránh việc trình tự gen ngoại lai bị methyl hóa dẫn đến sai khác trong việc biểu
hiện protein tái tổ hợp.
T7 RNA Polymerase (λDE3 và lacUV5): BL21 (DE3) có hệ promoter lacUV dùng
để điều khiển quá trình biểu hiện, đây là promoter đã được đột biến, và được tạo ra từ
phage λ, promoter này mạnh hơn bất kỳ promoter của hệ biểu hiện vi khuẩn tự nhiên
nào.

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguyên liệu
Gen mã hóa cho glycoprotein (GP5) của vius Porcine Reproductive and
Respiratory Syndrome (PRRSV) do Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công
nghệ sinh học cung cấp.
Vector tách dòng pBT do Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện
Công nghệ sinh học cung cấp.

Hình 2.1. Sơ đồ vector tách dòng pBT

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN