BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA Bacillus subtilis
ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH – Staphylococcus aureus,
Escherichia coli và Salmonella

Họ và tên sinh viên : ĐẶNG THỊ LÊ HÂN
Ngành : DƯỢC THÚ Y
Niên khóa : 2004-2009

i


Tháng 9/2009

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA Bacillus subtilis
ĐỐI VỚI VI KHUẨN GÂY BỆNH – Staphylococcus aureus,
Escherichia coli và Salmonella

ĐẶNG THỊ LÊ HÂN

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng bác sĩ thú y chuyên ngành
Dược thú y

Giáo viên hướng dẫn: PGS. TS NGUYỄN NGỌC HẢI

ii


bệnh là Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Salmonella.
Phương pháp nghiên cứu
1. Phân lập và định danh Bacillus subtilis
2. Kháng sinh đồ khuyếch tán trên thạch
Kết quả thu được
1. Bacillus subtilis đã được phân lập từ đất
2. Phần lớn các chủng Bacillus subtilis phân lập từ đất đã thể hiện khả năng
đối kháng chống lại Staphylococcus aureus (21/24 chủng), một số ít hơn các
chủng phân lập có khả năng đối kháng với Escherichia coli (11/24 chủng) và
Salmonella (5/24 chủng)
3. Các chủng Bacillus subtilis được kiểm tra đã thể hiện khả năng đối kháng
mạnh nhất với Staphylococcus aureus và khả năng này yếu hơn đối với
Escherichia coli và Salmonella.
4. Tác động kháng khuẩn của Bacillus subtilis chịu sự ảnh hưởng của thời
gian nuôi cấy, tác động này là mạnh nhất khi Bacillus subtilis trải qua 24 giờ nuôi
cấy và giảm dần ở 36 giờ và 48 giờ nuôi cấy.
5. Sự hiện diện của các vi khuẩn khác có thể đóng vai trò như 1 yếu tố dẫn dụ
cho sự sản xuất các hợp chất kháng khuẩn của Bacillus subtilis.
iv


MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN……...……………………………………………………..……….i
TÓM TẮT………………………………………………………………………...ii
MỤC LỤC…………………………………………………………………...…...iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………….vi
DANH MỤC BẢNG…………………………………………………………….vii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ.......................................................................................ix
DANH MỤC SƠ ĐỒ……………………………………………………………...x
DANH MỤC HÌNH……………………………………………………………...xi

2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy…………………………………………………………14
2.4.3. Khả năng gây bệnh của Salmonella……………………………………….15
Chương 3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ
NGHIỆM………………………………………………………………………...16
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện……………………………………………..16
3.2. Vật liệu thí nghiệm…………………………………………………………..16
3.2.1. Đối tượng khảo sát…………………………………………………………16
3.2.2. Dụng cụ - Thiết bị………………………………………………………….16
3.2.3. Môi trường nuôi cấy……………………………………………………….16
3.3. Nội dung nghiên cứu…………………………………………………………17

vi


3.4. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………….17
3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất………………………………….17
3.4.2. Đánh giá khả năng đối kháng của Bacillus subtilis đối với Staphylococcus
aureus, Escherichia coli và Salmonella…………………………………………..19
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………………...26
4.1. Kết quả phân lập Bacillus subtilis……………………………………………26
4.2. Kết quả thí nghiệm 1…………………………………………………………28
4.3. Kết quả thí nghiệm 2…………………………………………………………33
4.4. Kết quả thí nghiệm 3…………………………………………………………38
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………40
5.1. Kết luận………………………………………………………………………40
5.2. Đề nghị……………………………………………………………………….41
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………42
PHỤ LỤC………………………………………………………………………..44

vii

Bảng 4.3: Kết quả của thí nghiệm đánh giả khả năng đối kháng trên thạch của
Bacillus subtilis chống lại Escherichia coli
Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng trên thạch của
Bacillus subtilis chống lại Salmonella
Bảng 4.5: Tác động kháng khuẩn trên thạch của Bacillus subtilis đối với các
vi khuẩn kiểm nghiệm theo thời gian
Bảng 4.6: Tác động kháng khuẩn trên thạch của Bacillus subtilis đối với 3 vi
khuẩn kiểm nghiệm
Bảng 4.7: Đường kính các vòng vô khuẩn tạo ra theo thời gian bởi dịch canh
ly

tâm

Bacillus

subtilis

trên

thạch

được

phết

Staphylococcus aureus
Bảng 4.8: Đường kính các vòng vô khuẩn tạo ra theo thời gian bởi dịch canh
ly tâm Bacillus subtilis trên thạch được phết Escherichia coli
Bảng 4.9: Đường kính các vòng vô khuẩn tạo ra theo thời gian bởi dịch canh
ly tâm Bacillus subtilis trên thạch được phết Salmonella

các chủng B. subtilis phân lập
Sơ đồ 3.5: Thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng của dịch canh khuẩn
B. subtilis.
Sơ đồ 3.6: Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch nuôi cấy chung
giữa B. subtilis và các vi khuẩn kiểm nghiệm.

xii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis ở độ phóng đại 1000 lần
Hình 2.2: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus
Hình 2.3: Khuẩn lạc Salmonella trên thạch máu
Hình 4.1: Kết quả phân lập mẫu đất trên thạch TSA
Hình 4.2: Vòng vô khuẩn quan sát ở thời điểm 24giờ ủ tạo bởi các chủng
Bacillus subtilis trên thạch đã được phết vi khuẩn kiểm nghiệm
Hình 4.3: Kết quả đối kháng trên thạch giữa dịch canh B. subtilis ủ 24h và
S. aureus
Hình 4.4: Kết quả của tác động đối kháng tạo bởi 2 loại dịch canh khuẩn nuôi
cấy chung thu được bằng 2 cách – ly tâm và lọc

xiii


Chương 1
PHẦN MỞ ĐẦU
1.1.

ĐẶT VẤN ĐỀ



15


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 SƠ LƯỢC VỀ Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử
Bacillus subtilis đã được sử dụng rộng rãi trong vòng nhiều năm và được thương
mại hóa trên khắp nước Mỹ và châu Âu từ năm 1946 như 1 loại dược phẩm nhờ vào
tác động kích thích miễn dịch do hoạt hóa sự tiết các kháng thể đặc hiệu như IgM, IgG
và IgA.

2.1.2. Đặc điểm phân loại
Bảng 2.1: Phân loại Bacillus subtilis
Giới

Bactéria

Ngành

Firmicutes

Lớp

Bacilli

Bộ

Bacillales

0,8-1,8 µm ở trung tâm tế bào vi khuẩn (Tô Minh Châu, 2000). Chúng có khả năng di
động như vào hệ thống các lông roi phủ trên bề mặt vi khuẩn (Kenethe Todar, 2008).

(http://dic.academique.ru/pictures/enwiki/66/bacillus_subtilis/gram)

Hình 2.1: Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis ở độ phóng đại 1000 lần
Bacillus subtilis có khả năng tạo bào tử dưới dạng hình ovale với kích thước
0,8-1,8 µm ở trung tâm tế bào vi khuẩn (Tô Minh Châu, 2000). Chúng có khả năng di
động như vào hệ thống các lông roi phủ trên bề mặt vi khuẩn (Kenethe Todar, 2008).
Trên thạch dinh dưỡng: khuẩn lạc Bacillus subtilis trong mờ và gù lên. Những
khuẩn lạc nay có màu trắng kem, bề mặt sáng với viền nhăn nheo. Đường kính khuẩn
lạc từ 3-5 mm. Sau 1-4 ngày nuôi cấy, bề mặt khuẩn lạc trở nên nhăn nheo với màu
nâu nhạt (Nguyễn Đức Duy Anh, 2005).
Trong môi trường lỏng: Bacillus subtilis tạo những lớp màng mỏng trên bề mặt
sau thời gian nuôi cấy (Kenethe Todar, 2008).
2.1.5. Đặc điểm nuôi cấy
Bacillus subtilis là loài vi khuẩn ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 3656oC và nồng độ NaCl có khả năng ức chế vi khuẩn là 10-1 (Lương Đức Phẩm, 2000).
17


Nhu cầu Oxy: Bacillus subtilis là loài hiếu khí và yếm khí tùy nghi
Bacillus subtilis có thể phát triển trong những môi trường phức tạp hoặc khá
đơn giản. Sự phân lập bước đầu có thể được thực hiện trên thạch dinh dưỡng (peptone
5 g/l, cao thịt 3 g/l, agar 15 g/l, pH 6,8) hoặc trên J-agar (tryptone 5 g/l, chiết nấm men
15 g/l, K2HPO4, glucose 2 g/l, agar 20 g/l, pH 7,4). (Kenethe Todar 2008).
2.1.6. Kháng sinh do Bacillus subtilis tổng hợp
Tiềm năng sản xuất các kháng sinh của B. subtilis đã được nhận thấy khoảng 50
năm trước. Những kháng sinh có bản chất peptide chiếm ưu thế trong các kháng sinh
tổng hợp. Tuy nhiên, các nghiên cứu có hệ thống điều tra về phổ kháng khuẩn hoàn
chỉnh của các kháng sinh tổng hợp bởi các chủng B. subtilis khác nhau thì vẫn còn

Fen B. Fengycin có khả năng kháng nấm rất mạnh.

™ Các peptide kháng khuẩn tổng hợp không dựa vào ribosome (non-RAMPs)
Những peptide kháng khuẩn tổng hợp không dựa vào ribosome bao gồm TasA
(Stover và Driks, 1999), subtilosin (Babasaki et al, 1985)
TasA: TasA có phổ kháng khuẩn rộng. Nó được tiết ra trong môi trường nuôi cấy
30 phút sau khi sự tạo bào tử bắt đầu. Nó định vị trong lớp peptidoglycan của bào tử.
TasA giúp Bacillus subtilis chiếm ưu thế trong sự hình thành (tài liệu tổng hợp bởi
Nguyễn Quỳnh Nam, 2006).
Subtilosin: là 1 bacteriocin có khả năng kháng khuẩn mạnh chống lại Listeria
monocytogenes et Bacillus cereus (tài liệu tổng hợp bởi Nguyễn Quỳnh Nam, 2006).
Sublancin: kháng sinh này không tác động lên các vi khuẩn gram âm nhưng nó có
khả năng đối kháng rất mạnh lên các vi khuẩn gram dương. Sublancin là 1 bacteriocin
bền, không mất hoạt tính sau 2 năm bảo quản trong những điều kiện bình thường (tài
liệu tổng hợp bởi Nguyễn Quỳnh Nam, 2006)
Bacilysocine:

cấu

trúc

của

bacilysocin

là

1-(12-methyltetradecanoyl)-3-

phosphoglyceroglycerol. Bacilysocin thể hiện những khả năng kháng khuẩn nói chung


• Ảnh hưởng của nguồn carbon
Người ta đã tìm ra rằng sự hình thành các kháng sinh đạt tối đa khi glycerol được
sử dụng như 1 nguồn carbon. Tuy nhiên, các hoạt động sản xuất kháng sinh sẽ tăng
đáng kể khi maltose, glucose, sorbitol và lactose được sử dụng như nguồn carbon
(Jamil et al, 2007)

• Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Sự tạo các kháng sinh đạt đến tối ưu khi acid L-glutamic được sử dụng làm nguồn
nitơ (Jamil et al, 2007). (Egorov et al, 1986) đã kết luận rằng sự thay thế glutamate bởi
20


tryptone có thể gây ra sự suy giảm đáng kể sự tăng sinh của vi khuẩn, sự tích tụ sinh
khối cũng như làm dừng quá trình tổng hợp kháng sinh.

• Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nghiên cứu của (Jamil et al, 2007) đã cho thấy rằng nhiệt độ tối ưu cho sự hình
thành các kháng sinh phụ thuộc vào các vi khuẩn kiểm nghiệm, nó là 30oC đối vời
Staphylococcus aureus, và là 37oC đối với Micrococcus luteus. Tuy nhiên, theo (Anker
et al, 1947) thì sự sản xuất kháng sinh này đạt đến tối đa ở 37oC.

2.1.7. Tính đối kháng của Bacillus subtilis
* Với vi sinh vật gây bệnh
Hình thức đối kháng chủ yếu của Bacillus subtilis đối với vi sinh vật gây bệnh là
cạnh tranh dinh dưỡng và tiết kháng sinh.
Tác dụng chủ yếu của kháng sinh đối với vi khuẩn có thể biểu hiện ở 3 hướng chủ
yếu sau:
¾ Làm ngừng tổng hợp thành (màng) tế bào hay làm tan màng tế bào vi khuẩn
và do đó phá hủy tính chất thẩm thấu của tế bào, các ion Mg++, Na+, Ca++ thoát ra

Sản sinh các acid hữu cơ: acid lactic, acid acetic làm giảm pH đường ruột.

-

Sản sinh vitamin nhóm B

-

Cạnh tranh vị trí bám dính với vi sinh vật gây bệnh.

-

Sản xuất các kháng sinh ức chế các vi sinh vật gây bệnh

-

Bacillus subtilis còn được xem là tác nhân kích thích miễn dịch trong điều trị
một số bệnh.

* Trong công nghiệp
Bacillus subtilis được ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất ra enzyme và một số
chất hóa học cho công nghiệp như amylase, protease, inosine, ribosides,
aminoacid,…Trong đó, protease được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chất tẩy
rửa.
* Trong y học
Việc trao đổi gen giữa những chủng thuộc Bacillus subtilis khi chúng cùng phát
triển trong đất đã được biết đến khá lâu. Klier và cộng sự đã chứng minh khả năng
trao đổi plasmid giữa Bacillus subtilis và Bacillus thuringensis. Một số nghiên cứu chỉ
ra rằng Bacillus subtilis chuyển gen có khả năng kích ứng hay làm ức chế khả năng
biểu hiện độc tố hay 1 số thành phần độc tố trong các vi khuẩn trong các bệnh ho gà,

chùm nho là hình dạng đặc trừng cho giống vi khuẩn Staphylococus. Vi khuẩn này
không tạo bào tử, không di động, đường kính từ 0,5 đến 2,5 µm (trung bình 0,8 - 1
µm).
Staphylococcus aureus hình thành các khuẩn lạc lớn màu vàng cam trên các môi
trường giàu dinh dưỡng. S. aureus thường có khả năng dung huyết trên thạch máu
(Kenethe Todar, 2008).

(http://www.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccImages/Articleimages/Atlas_LB/Staphylococcus%20aure
us%20TopView.jpg)

Hình 2.2: Khuẩn lạc Staphylococcus aureus

24


2.2.2. Đặc điểm nuôi cấy
S. aureus có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ từ 15 đến 45oC và ở những nồng độ
NaCl khá cao đến 15% (Kenethe Todar, 2008).
S. aureus nhân lên dễ dàng trong môi trường hiếu khí hơn kị khí. Nó đòi hỏi các
acid amin và vitamin cho sự sinh trưởng. Nó là loài vi khuẩn chịu nhiệt trung bình và
nó bị ức chế khi có sự hiện diện của hệ vi sinh vật cạnh tranh quan trọng. Loài vi
khuẩn này nhạy cảm với sự acid hóa. Nó có thể tồn tại lâu dài trong những thực phẩm
khô hay đông lạnh (B. Peiffer, 1999).
Các nhiệt độ tối thiểu và tối đa cho sự phát triển lần lượt là 6-8oC và 45oC. Vi
khuẩn có thể nhân lên dễ dàng trong các pH khác nhau từ 4-9,8 (B. Peiffer, 1999).
2.2.3. Các yếu tố độ lực của Staphylococcus aureus và cơ chế tác động của chúng
Người ta đã tìm ra ít nhất 7 enterotoxin tiết ra bởi Staphylococcus aureus là A, B,
C1, C2, C3, D, E1 et TSST-1.
™ Enterotoxin B
Có khả năng gây ra ngộ độc thực phẩm.