HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA NÔNG HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI
“Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam
virus ”

Giảng viên hướng dẫn : TS.Hà Viết Cường
Họ và tên

: Hà Văn Dũng

Lớp

: BVTVB-K55

Chuyên ngành

: Bảo vệ thực vật

Hà Nội-2014

1


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình hoàn thành báo cáo này ngoài những nỗ lực của bản
thân, tôi đã nhận được những sự giúp đỡ hết sức tận tình và quý báu từ nhiều tập thể
và cá nhân.
Trước hết tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới thầy

CP
CTAB
ddNTP
DNA
Dntp
dsDNA
E.coli
EDTA
ICTV
IR
Kb
LB
ORF
PCR
RCA
RE
Rep
RNA
Rnase
SDS
SsDNA
TAE
Taq
Vir
β- ME

Từ viết tắt
Agrobacterium tumefaciens
Acetosyringone
Adenosine triphosphate

DANH MỤC BẢNG

4


DANH MỤC HÌNH

TÓM TẮT
Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu về
begomovirus đó là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây
bệnh xoăn vàng lá trên ớt và cà chua.
Đánh giá đặc trưng sinh học bằng cách đánh giá tính gây bệnh thông qua
Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation), đồng thời chúng tôi tiến hành lây
nhiễm PepYLCVNV thông qua môi giới truyền bệnh trung gian là bọ phấn..
Dựa trên mồi đặc hiệu và mồi chung, các phản ứng PCR đã được thực hiện
trên một loạt các mẫu ớt thu tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam nhằm phát
hiện PepYLCV và begomovirrus khác. Lần đầu tiên phát hiện sự có mặt của
begomovirrus trên ớt tại miền Bắc.
Chúng tôi đã tiến hành xây dựng thành công cấu trúc xâm nhiễm của
PepYLCVNV, phân tích đặc trưng phân tử của của PepYLCVNV.

5


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Giới thiệu
Chi Begomovirus là chi lớn nhất và quan trọng nhất trong họ

hiện được một begomovirus gây hại tự nhiên trên ớt ở Việt Nam có ý nghĩa quan
trọng cả về mặt khoa học và thực tiễn vì cây cây ớt cũng như cây cà chua là các
cây trồng quan trọng của Việt Nam.
Do PepYLCVNV là một virus mới nên phân bố cũng như đặc điểm sinh
học, đặc biệt là phổ ký chủ của virus vẫn chưa được nghiên cứu.
Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài: “Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt
Nam virus”
1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài
1.2.1 Mục tiêu
Xác định sự có mặt của PepLCVNV trên các mẫu ớt và cà chua thu thập tại
miền Bắc và đánh giá tính gây bệnh của virus.
1.2.2 Yêu cầu
- Điều tra bệnh cuốn lá ớt tại một số điểm trồng ớt chính thuộc Hà Nội,
Hưng Yên.
- Thu thập mẫu bệnh trên ớt với triệu chứng cuốn lá điển hình
- Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu trên các mẫu ớt và
cà chua thu thập trong nghiên cứu này và thu thập từ trước.
- Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng
kỹ thuật agroinoculation trên cà chua, ớt và một số cây chỉ thị
- Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng
vector bọ phấn.

7


2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU



2.2.1 Đặc điểm hình thái
Đặc điểm hình thái chung của các Begomovirus đều có cấu trúc phân tử
(virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1
tam giác đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗi mặt bằng 1, nối với nhau để tạo
ra phân tử hình cầu đa diện kép (gemini). Do nối với nhau nên 2 hình cầu này
không hoàn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (protein
vỏ) được xắp xếp thành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein
(pentameric capsomer). Kết quả là toàn bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 đơn vị
hình thái (Gafni and Yedidya, 2003), (Zhang, Cheng et al., 2001).

Hình 2.1 Hình thái của begomovirus (Nguồn ảnh:
www.ncbi.nlm.nih.gov)
2.2.2 Cấu trúc genome của Begomovirus
Begomovirus là virus thực vật có bộ gen DNA sợi vòng đơn có kích thước
khoảng 2,6- 2,8 kb. Chúng hoặc có bộ gen kép (bipartite) gồm 2 phân tử DNA gọi
là DNA-A và DNA-B hoặc có bộ gen đơn (monopartite) tương đương DNA-A
(Ha, 2007)

9


Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của begomovirus (Nguồn
ảnh: www.expasy.ch)
2.2.3 Cấu trúc của phân tử DNA-A
Cấu trúc của một DNA-A điển hình gồm 6 ORF (Open Reading Frame)
được sắp xếp theo hai chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) có
hai gen AV1 và AV2. Gen AV1(CP) mã hóa vỏ protein có chức năng chính là tạo
vỏ phân tử virus, lan truyền Begomovirus qua vector, vận chuyển bộ gen virus
vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gen giữa các tế bào. Gen AV2

CR
DNA-B
~2.7kb

BV1 (NSP)

BC1 (MPB)

Hình 2.4: Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus (Ha, Coombs et al.,
2008).

2.2.5 Đặc điểm của vùng IR
Vùng IR (Intergenic region) là vùng liên gen không mã hóa, nằm giữa 2
vùng gen mã hóa ngược chiều nhau, có cả trên DNA-A và DNA-B. Vùng này có
chứa nguồn gốc tái sinh (ori- origin of replication) gồm các chuỗi lặp đảo (iteron)
cần thiết cho sự nhận biết và gắn kết protein Rep và 1 cấu trúc thân- thòng lọng
(stem-loop) có chứa chuỗi TAATATTAC giống nhau ở tất cả các begomovirus. Vị
trí T7 – C8 của chuỗi này là nơi protein Rep cắt và nối bộ gen Begomovirus trong
quá trình tái sinh.

11


Đối với begomovirus có bộ gen kép có chứa 1 chuỗi bảo thủ cao (khoảng
150 nucleotide) giữa 2 phân tử gọi là vùng chung CR (Common Region). Vùng
CR có vai trò quan trọng trong quá trình tái sinh của DNA-B bởi chuỗi ori- nguồn
gốc tái sinh nằm trên vùng này. Tuy nhiên, với số gen ít ỏi của mình, DNA-B
không thể tự tái sinh trong tế bào ký chủ mà cần có sự nhận biết và cắt- nối của
protein Rep được mã hóa trên DNA-A (Ha, 2008)
2.2.6 Phân loại các Begomovirus

lại tiếp tục cắt sợi virus mới được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới
được tổng hơp) thành một sợi virus hoàn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng.
Protein Rep sau đó sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gen virus sợi đơn
mạch vòng hoàn chỉnh.
2.2.8 Triệu chứng bệnh do Begomovirus
Do virus phải dựa hoàn toàn vào vật chất của tế bào ký chủ để sinh sản, nên
ở cây non và phần non của cây là nơi virus sinh sản rất mạnh. Ở các cây, tế bào
già cỗi, quá trình này sẽ chậ m lại hay hầu như ngừng hẳn. Vì vậy điều kiện ngoại
cảnh như: nhiệt độ quá cao, quá thấp, độ pH của môi trường, ánh sáng, chế độ
dinh dưỡng, chăm sóc cũng có ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện triệu chứng của
bệnh do các begomovirus. Tuy nhiên, thông thường triệu chứng xuất hiện sau 2-4
tuần nhiễm bệnh và phát triển đầy đủ trong vòng 2 tháng (Pico et al., 1996). Một
chất được nhiều nhà khoa học xác nhận có bản chất protein tan là interferon có
thể đã được sản sinh ra ở tế bào ký chủ khi virus xâm nhập. Với nồng độ thấp
khoảng một phần triệu gram đã có khả năng ức chế sinh sản của virus. Chính vì
những lý do trên bệnh virus không gây được tác hại huỷ diệt ngay mà thường gây
thoái hoá. Sự huỷ diệt chỉ xảy ra khi điều kiện môi trường và cây bệnh thuận lợi
cho virus sinh sản và lây nhiễm, như trong các trận dịch của bệnh lúa vàng lụi ở
nước ta những năm 1960. (Nguyễn Thị Hà Uyên, 2012)
Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới vào phía bên trong. Về sau, lá
không có hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chót lá lan vào giữa gân; lá
cuốn cong lên phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giòn và
nhỏ hẹp. Cuống lá có thể xoắn vặn. Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ,
đốt thân ngắn. Cây nhiễm sớm thường không ra quả do hoa bị rụng (Picó, Díez et
al., 1996). Bệnh thường xuất hiện vào các vụ có thời tiết nóng như hè thu và xuân
hè.
13


Hình 2.5. Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua

phấn từ giai đoạn trứng (Ghanim and Czosnek, 2000). Triệu chứng xuất hiện trên
cây con khi bị xâm nhiễm từ 2 – 5 tuần. Virus không truyền qua chứng bọ phấn.

Hình 2.6. Bọ phấn Bemisia tabaci
2.2.10 Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra
Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng đã được xác định là do
begomovirus gây ra như bệnh bệnh xoăn vàng lá (ngọn) cà chua, một bệnh được
xem là bệnh virus nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thế giới (Moriones and
Navas-Castillo, 2000).Các bệnh nguy hiểm tương tự là bệnh khảm lá sắn, bệnh
cuốn lá bông (Briddon, 2003). Trong đó gây thiệt hại lớn nhất là bệnh xoăn vàng
lá ngọn cà chua.
Bệnh xoăn vàng lá cà chua gây thiệt hại lớn cả về năng suất và chất lượng.
Bệnh đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp Thế Giới, đặc
biệt vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Picó, Díez et al., 1996).

15


2.2.11 Phòng chống
Cho đến nay vẫn chưa có loài thuốc hóa học nào phòng trừ được trực tiếp
bệnh do virus gây ra. Phòng trừ begomovirus chủ yếu dựa vào 2 chiến lược chính
là phòng chống vector và tạo cây kháng bệnh.
- Phòng chống vector: (Kheyr-Pour, Bendahmane et al., 1991) cho biết, trên thế
giới có khoảng 500 loài cây là ký chủ của bọ phấn, chúng có mặt quanh năm
trên đồng ruộng. Đây là nguyên nhân khiến cho việc phòng trừ bọ phấn gặp
nhiều khó khăn. (Murugan and Uthamasamy, 2001) nghiên cứu đặt bẫy dính
bọ phấn theo dõi mặt độ bọ phấn trên cánh đồng bông ở Coimbatace (Ấn Độ)
cho thấy: từ tháng 9 đến tháng 3 năm sau lượng mưa thấp, nhiệt độ cao, cường
độ ánh sáng lớn với ẩm độ trung bình tạo điều kiện cho bọ phấn sinh sôi nảy
nở nhanh chóng nên mật độ bọ phấn cao, từ tháng 5 đến tháng 8 mưa nhiều

trên cà chua với tỉ lệ nhiễm bệnh trên các ruộng trồng cà chua thường rất cao, có
khi tới 100%. Bệnh đã được phát hiện thấy trên cà chua từ những năm 80. Một số
nghiên cứu về tạo huyết thanh chuẩn đoán, lây nhiễm nhân tạo đã được thực hiện
trong thời gian này nhưng bản chất thực sự của virus vẫn chưa rõ. Gần đây dựa
vào các phân tích phân tử, có ít nhất 3 loài begomovirus được phát hiện gây ra
bệnh xoăn vàng lá cà chua ở Việt Nam. Loài thứ nhất là Tomato leaf curl Việt
Nam virus (ToLCVNV) được phân phập từ cây cà chua bị bệnh xoăn vàng ngọn ở
miền Bắc vào năm 2001 (Green et al., 2001), Loài thứ hai là Tomato yellow leaf
curl Kanchanaburi virus (TYLCKaV), được phân lập đầu tiên ở tỉnh
Kanchanaburi (Thái Lan) vào năm 2002 (Green et al., 2002) và được phát hiện
trên cây cà chua ở Việt Nam vào năm 2005 (mã số Genbank của mẫu Việt Nam là
DQ169054, -55). Năm 2007, từ một mẫu cà chua bị bênh xoăn vàng ngọn thu
thập tại Hà Nội, cùng với ToLCVV, một loài begomovirus thứ ba cũng đã được
phân lập. Loài này được đặt tên là Tomato yellow leaf curl Việt Nam virus
(ToYLCKaV) (Hà et al., 2008). Trong số 3 virus trên có 2 virus được phân lập
trên mẫu cà chua gây bệnh xoăn vàng lá ở miền Bắc là ToLCVNV và TYLCVNV.
2.4 Một số begomovirus hại ớt
Theo (Green and Kim, 1991) có khoảng 35 loài virus khác nhau gây hại
trên ớt ở các vùng trồng trên thế giới đã được phát hiện thì có 12 loài gây hại trên
ớt ở Châu Á Thái Bình Dương. Cho đến năm 2001 thì có đến 65 loài virus khác
17


nhau đã được phát hiện trong đó có những loài thuộc chi Begomovirus (AVRDC,
2001).
Theo kết quả nghiên cứu của (Green and Kim, 1991), triệu chứng cuốn lá
ớt trồng ở Banthra lan truyền qua bọ phấn Bemissia tabaci là do Chilli Leaf Curl
Virus (ChiLCV) gây ra.
Số lượng các loài virus mới gây hại trên ớt ngọt và ớt cay ngày càng được
phát hiện. Đã có hơn 9 loài virus thuộc chi begomovirus gây hại trên các cây

hiệu.
- Tổng hợp sản phẩm PCR: hỗn hợp phản ứng được tăng tới nhiệt độ tối ưu cho
phản ứng tổng hợp chuỗi, tùy thuộc DNA polymerase chịu nhiệt.
2.6 Kỹ thuật RCA (Rolling circle amplication)
Gần đây, một phương pháp nhân bản DNA mới dùng kỹ thuật RCA
(Rolling Circle Amplification) đã được sử dụng để nhân các bộ gen DNA dạng
mạch vòng. Kỹ thuật RCA dùng enzyme DNA polymerase của thực khuẩn thể
Φ29, một enzyme có hoạt tính chuyển mạch (strand-displacement) rất cao, và mồi
hexamer để nhân các phân tử DNA mạch vòng thành các multimer mạch thẳng
(gồm nhiều bộ gen virus liên tiếp) (Hình 2.10) Sản phẩm RCA sẽ được cắt bằng
enzyme cắt giới hạn thích hợp và được dòng hóa trong các vector dòng hóa thông
thường. Đây là kỹ thuật hiện đang rất thông dụng trong nghiên cứu các virus có
bộ gen DNA mạch vòng kể cả các begomovirus và vệ tinh ((Inoue-Nagata,
Albuquerque et al., 2004), (Haible, Kober et al., 2006), (Knierim and Maiss,
2007)).

19


Hình 2.7. Cơ chế tái bản các phân tử DNA mạch vòng bằng kỹ thuật RCA (Rolling Circle
Amplification) dùng hexamer và Φ29 polymerase DNA

(Fujii, Kitaoka et al., 2006)
Kỹ thuật RCA đã được ứng dụng để thiết kế các cấu trúc xâm nhiễm của
begomovirus.Sản phẩm RCA dạng multimers được cắt đơn bằng enzyme cắt giới
hạn thích hợp trong điều kiện không triệt để để tạo ra nhiều sản phẩm monomer
(1 bộ gen), dimer (2 bộ gen) và multimer (nhiều bộ gen). Chỉ các sản phẩm dimer
được tinh chiết khỏi gel agarose và nối vào vector nhị nguyễn.Bằng cách đơn giản
này, các cấu trúc xâm nhiễm của begomovirus có thể được tạo ra khá nhanh
chóng. (Inoue-Nagata, Albuquerque et al., 2004), (Knierim and Maiss, 2007),

21


Hình 2.8. Khối u do A.tumerfaciens gây ra

Hình 2.9. Quá trình lây nhiễm của Ti
Plasmid trong A.tumerfaciens vào cây

A: Agrobacterium tumefaciens. B: Agrobacterium genome. C: Ti
Plasmid : a: T-DNA , b: Vir genes , c: Replication origin , d: Opines
catabolism genes. D: Plant cell. E: Mitochondria. F: Chloroplast. G: Nucleus
Có 3 kỹ thuật agroinoculation chính là: (i) thấm chân không (lá cây được
nhúng trong dung dịch vi khuẩn, được xử lý chân không để hút khí trong gian
bào; vi khuẩn sẽ dễ dàng xâm nhập vào trong mô qua khí khổng khi áp suất trở lại
bình thường); (ii) tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mô; và (iii) tưới trực tiếp dịch vi
khuẩn vào đất

22


3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu
Virus: Pepper yellow leaf curl virus (PepYLCV)
Cây: ớt, cà chua
3.2 Địa điểm nghiên cứu và thời gian thực hiện
3.2.1 Địa điểm nghiên cứu
- Điều tra, thu mẫu đồng ruộng đồng ruộng được thực hiện tại Khu trồng rau

BM DTGiống

2

Cà chua

HT7

3

Ớt

Hiểm Lai
F1

Thuốc lá cảnh
(Nicotiana
benthamiana)

4

Chuẩn nhiễm

Địa phương Chuẩn nhiễm

AVRDC

Cây mô hình
cho virus thực
vật

Thuốc lào (N.
glutinosa)

AVRDC

Cây chỉ thị

9

Hoa ngũ sắc
(Ageratum
conyzoides)

Cây dại

Cây chỉ thị

10

Cà bát

Địa phương Chuẩn nhiễm

11

Cà pháo

Địa phương Chuẩn nhiễm

Viện NCTL Cây chỉ thị


Túy Loan- Đà Nẵng

Ớt

Cuốn lá, khảm

VNP 120

Thái Bình

Ớt

Khảm

VNP 179

Cam lộ- Quảng Trị

Ớt

Cuốn lá, khảm

VNP 192

Cam Đường- Lào Cai

Ớt

Khảm


Ớt

Cuốn lá, khảm

VNP 291

Vĩnh Tường- Vĩnh Phúc

Ớt

Khảm vàng, lá nhỏ

VNP 300

Sóc Sơn- Hà Nội

Ớt

Xoăn vàng lá

VNP 306

Yên Thế- Bắc Giang

Ớt

Khảm vàng

VNP 313


VNP 535

Hòa An- Cao Bằng

Ớt

Khảm

VNP 558

Chợ Mới- Bắc Kạn

Ớt

Khảm nhăn

VNP 626

Túy Loan- Đà Nẵng

Ớt

Khảm

VNP 632

Túy Loan- Đà Nẵng

Ớt


Ớt

Khảm vàng

VNP 716

Yên Thế- Bắc Giang

Ớt

Khảm

VNP 785

Bình Thủy- Cần Thơ

Ớt

Khảm

VNP 961

An Dương- Hải Phòng

Ớt

Khảm, biến vàng

VNP