BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP - ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN VÀ
ỨNG DỤNG SẢN XUẤT LÊN MEN ĐẬU NÀNH
NHẰM THU NHẬN ENZYME NATTOKINASE
GIẢM HIỆN TƯỢNG MÁU ĐÔNG
Giáo viên hướng dẫn:

TS. Hoàng Quốc Khánh
HVCH. Ngô Đức Duy

Sinh viên thực hiện:

Huỳnh Nguyễn Ngọc Ngân

MSSV: 1311100467

Lớp: 13DSH06

Tháng 08 năm 2017

1


MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Tác dụng

Phòng

các chủng
vi khuẩn từ
các mẫu
Natto Nhật
Bản

Ứng dụng lên men vi khuẩn
trên cơ chất đậu nành

Thu nhận enzyme thử hoạt
tính tan huyết

3


NỘI DUNG

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
4
PHẦN

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4


TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Đậu nành

Natto (OGMi)

Mizkan Kinno Tsubu
Toromame (MiKi)
7


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Quy trình thực hiện thí nghiệm
tổng quan

Nguồn mẫu

Cấy trãi trên môi trường MRS.
Nuôi ủ ở 370C trong 24 - 48 giờ.
Nhuộm Gram.
Nhuộm bào tử.

Quan sát, chọn lọc khuẩn lạc
riêng rẽ và làm thuần giống.

Thử nghiệm sinh hóa

Ly trích và thu nhận DNA. Nhân
bản đoạn gene bằng phương pháp
PCR.
Lên men đậu nành.

Định tính protease và thử khả
năng tan huyết khối của dịch

16s rRNA

Giải trình tự gene

So sánh trình tự trên
ngân hàng gene NCBI
Dựng cây phát sinh
loài

10


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Tách chiết và thu nhận DNA
Thu sinh
khối vi
khuẩn

Thêm 800 900μl
CTAB

Ly tâm 14000
rpm/5phút/40C.
Thu cặn.

Thêm 500μl
ethanol (lạnh)

Ủ ở -800C
trong 60


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Khuếch đại gene (Polymerase Chain Reaction – PCR)
Bước 1:
Khởi đầu

980C trong 30 giây

35 chu kỳ:
• 980C trong 30 giây.
• 550C trong 30 giây.
• 720C trong 90 giây.

Bước 2:
Lai

Bước 3:
Kéo dài

Thành phần phản ứng
Mater mix
12 µl
27F
1µl
1492 R
1µl
DNA
1µl
H 2O
10 µl

1210C trong 1 giờ

Để nguội

13


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp tách chiết thu dịch enzyme thô

Cho 40 ml nước cất
hấp khử trùng vào
mẫu đậu sau lên men

Lắc 200 rpm/1 giờ ở
điều kiện nhiệt độ
phòng

Ly tâm tốc độ 10000
rpm / 1 phút trong15
phút

Bảo quản lạnh

Chiết lấy dịch lỏng
chứa enzyme

14



Cân và ghi nhận
lại số liệu

Cho vào 2ml dịch
chiết enzyme (ở ba
độ pha loãng 100, 10-1
và 10-2)

Cân trọng lượng
khối huyết đông
còn lại sau ủ

Ủ ở 370C trong 4
giờ

16


KẾT QUẢ
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, Gram và bào tử
Hình thái khuẩn
lạc

Hình Gram

Hình bào tử

OGMi

OKChu

đơn

OD260

OD280

OGMi

0,816

0,448

1,821

408

326,4

OKChu

0,896

0,462

1,939

448

358,4



Kết quả nhân bản vùng gene các chủng vi khuẩn trên gel agarose 1%
20


KẾT QUẢ
Cây phát sinh loài
43

Bacterium UKR A11

59

Bacterium CulalenE36

65

Bacterium 128 16S

68

Staphylococcus hominis strain K23

97

Staphylococcus hominis strain BUR16B3
Staphylococcus hominis strain CKT-105
OGMi

OKChu

Staphylococcus hominis partial (99%)

MiKi

Staphylococcus hominis strain CAU6562 (99%)
Bacterium UKR A11 (89%)
Bacterium CulalenE36 (90%)

22


KẾT QUẢ
Kết quả thử nghiệm sinh hóa

Thử nghiệm Urease: dương tính.
Môi trường chuyển từ màu vàng
cam sang màu hồng cánh sen.

Thử nghiệm Catalase: dương tính.
Xuất hiện bọt khí.

23


KẾT QUẢ
Kết quả thử nghiệm sinh hóa

MiKi

OKChu

3,8

4

5,4

OKChu

0

0

0

Hình

25