BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI
HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO
CÂY SÙNG THẢO (STACHYS AFFINIS)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Hoàng Quân
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1311100026

: Nguyễn Thị Thanh Hằng
Lớp: 13DSH01

TP. Hồ Chí Minh, năm 2017


LƠI CẢM ƠN
Qua thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại Trung tâm, em xin gửi lời cám ơn đến
Trung Tâm Công nghệ Sinh Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và hỗ trợ
trang thiết bị giúp em hoàn thành đề tài.
Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học
Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là gửi lời cám ơn đến tất cả các thầy
cô khoa Công nghệ Sinh học – Môi trường – Thực phẩm đã tạo điều kiện tốt nhất

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................4
1.1. Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật ......................................................4
1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật................4
1.1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ......................................5
1.1.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro .................................8
1.1.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật ...............9
1.2. Giới thiệu về chi Stachys ...............................................................................17
1.3. Giới thiệu về cây sùng thảo (Stachys affinis) ................................................19
1.3.1. Phân loại ...............................................................................................19


1.3.2. Đặc điểm sinh học và công dụng .........................................................19
1.3.4. Thành phần hóa học .............................................................................21
1.3.5. Giá trị dinh dưỡng ................................................................................22
1.4. Một số nghiên cứu về chi Stachys .................................................................23
1.4.1. Kháng viêm và giảm đau......................................................................24
1.4.2. Chống oxy hóa .....................................................................................24
1.4.3. Chống lo âu ..........................................................................................25
1.4.4. Kháng khuẩn .......................................................................................26
1.5. Các nghiên cứu nhân giống in vitro chi Stachys............................................27
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................29
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................29
2.2. Vật liệu và phương pháp ................................................................................29
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu ..............................................................................29
2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất ......................................................29
2.2.3. Môi trường nghiên cứu.........................................................................30
2.2.4. Điều kiện phòng nuôi cấy ....................................................................30
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu....................................................................30
2.3. Nội dung nghiên cứu......................................................................................30
2.4. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................31

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây sùng thảo ............................................................................................19
Hình 1.2. Củ sùng thảo..............................................................................................20
Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân
cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy .............................................................................39
Hình 3.2. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi
cấy. ............................................................................................................................46
Hình 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn
vườn ươm sau 4 tuần trồng .......................................................................................51

i


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng của một số chất khử trùng ........................10
Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi .......33
Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ ...................................34
Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai
đoạn vườn ươm .........................................................................................................35
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân
cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy. ............................................................................38
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo sau 4
tuần nuôi cấy. ............................................................................................................43
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn
vườn ươm sau 4 tuần trồng .......................................................................................48

ii


DANH MỤC BIỂU ĐỒ


Benzyl Adenine

CNSH

Công Nghệ Sinh Học

ĐC

Đối chứng

GA

Gibberellin

IAA

3-Indole acetic acid IBA

3-Indole butyric acid MS
Murashige – Skoog NAA
Napthalene Acetic Acid
PhG

Phenylpropanoid Glycosides

TP.HCM

Thành phố Hồ Chí Minh



1


• Ý nghĩa khoa học
- Giúp sinh viên củng cố lại kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học.
- Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học nhằm bổ sung
thông tin về cây sùng thảo, kỹ thuật nhân giống in vitro cây sùng thảo.
- Kết quả nghiên cứu có thể là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu
tiếp theo của cùng đối tượng hoặc một số giống cây có giá trị khác.
- Biết được phương pháp nghiên cứu một số vấn đề khoa học, xử lý và phân
tích số liệu, biết cách trình bài một bài báo khoa học.
• Ý nghĩa thực tiễn
- Xây dựng quy trình nhân giống cây sùng thảo, tạo ra cây giống có chất
lượng cao đáp ứng nhu cầu sản xuất tại Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM.
3. Đôi tương va pham vi nghiên cưu
Đôi tương nghiên cưu đươc sư dung trong đê tai nay la cây sùng thảo vitro
đươc cung câp tư phong nuôi cây mô tai phong Thực nghiêm cây trồng thuộc Trung
tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM.
Pham vi nghiên cưu trong đê tai nay la tâp trung khao sat anh hương cua
chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA, IBA lên quá trình nhân chồi, tạo rễ của cây
sùng thảo và khảo sát ảnh hưởng của các loại giá thể: mụn xơ dừa, tro trấu,… đến sự
sinh trưởng của cây sùng thảo.
4. Mục đích nghiên cứu
- Đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng nhân chồi
và tạo rễ nhằm thiết lập môi trường thích hợp để nhân nhanh cây sùng thảo trong vi
nhân giống in vitro.
- Đánh giá sự ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo ở
giai đoạn vườn ươm.
5. Nội dung nghiên cứu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật
1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Nuôi cấy mô và tế bào đã trả qua một lịch sử phát triển lâu dài và được đánh
dấu bằng những sự kiện chính sau:
Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa
ra khái niệm tế bào.
Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế
bào.
Năm 1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ
quan sinh dục.
Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm
nhưng không thành công.
Năm 1904, Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài
họ Cải Crucifers.
Năm 1922, Knudson và Bot. Gaz. Cho hạt phong lan nảy mầm in vitro.
Năm 1924, Blumenthal và cộng sự tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy hình
thành callus tử rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic.
Năm 1925, Knudson L, Bot. Gaz làm hạt phong lan nảy mầm in vitro.
Năm 1929, Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hoà
hợp khi lai ở Linum spp.
Năm 1934, Kogl và cộng sự lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một
phytohormone thực vật đầu tiên thuộc có khả năng kích thích sự tăng trưởng và
phân chia tế bào.
Năm 1936, LaRue và Bull đã nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau.
Năm 1939, Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo
thành
công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá.

4

bên).


Sau khi vô trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Từ một đỉnh
sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định phát triển thành một chồi hay nhiều
chồi. Sau đó chồi tiếp tục vươn dài hình thành thân, lá, ra rễ để trở thành một cây
hoàn chỉnh. Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân
giống thông thường khác.
1.1.2.2. Nuôi cấy mô sẹo
Trong điều kiện môi trường nuôi cấy có chứa nhiều auxin, mô sẹo được hình
thành. Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có định hướng, thường có màu
trắng. Trong môi trường phù hợp, mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những loài thực vật không có khả năng
nhân giống đỉnh sinh trưởng, hoặc với các loại mẫu nuôi cấy không thể trực tiếp
hình thành
chồi.
Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và từ một cụm tế bào mô
sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy
nhiên mức độ biến dị tế bào soma rất cao trong quá trình nuôi cấy để tạo mô sẹo.
1.1.2.3. Nuôi cấy tế bào đơn
Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt tên máy lắc có
tốc độ điều chỉnh thích hợp. Khối mô sẹo dưới tác dụng của cơ học và các hóa chất
hỗ trợ tách ra nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi
cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối. Hệ thống nuôi cấy tế bào đơn giống
như hệ thống nuôi cấy vi sinh. Với các cơ chất phù hợp được bổ sung môi trường, tế
bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học (alkloid, steoid,…).
Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được
tách ra và trải trên môi trường thạch, tế bào đơn được phát triển thành từng cụm tế
bào mô sẹo khi môi trường có auxin hoặc có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên
môi trường có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp. Sử dụng các tế bào đơn để xử lý đột

trên nhiều đối tượng khác nhau. Năm 1971, Takebe đã nhận được cây Thuốc lá nhị
bội từ tế bào trần, sau đó Ohiama và Nitch nhận được cây thuốc lá đơn bội từ tế bào
trần đơn bội.


Đến nay, kỹ thuật nuôi cấy và tái sinh protoplast đã hoàn thiện đối với cây hai lá
mầm cũng như nhiều loại cây một lá mầm và trở thành một trong những công cụ
quan trọng trong nghiên cứu di truyền nói chung và di truyền tế bào chất nói riêng
cũng như trong công tác giống cây trồng .
1.1.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro
Cho tới nay việc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro đã được áp dụng
cho nhiều loại cây trồng (trên 400 loài). Giáo sư Murashige (1974) đã chia quy
trình nhân giống in vitro làm ba giai đoạn và một giai đoạn tiếp sau in vitro:
1.1.3.1. Tạo vật liệu nuôi cấy khởi đầu in vitro
Giai đoạn này là bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy. Các mẫu đã được khử
trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để tạo ra các chồi mới. Giảm tỷ
lệ mẫu nhiễm bệnh, tăng khả năng tái sinh có vai trò quan trọng ở giai đoạn này.
Theo Yildiz (2012), mô lấy từ cây non có khả năng tái sinh cao hơn từ cây trưởng
thành. Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 – 6 tuần.
1.1.3.2. Nhân nhanh chồi, cụm chồi in vitro
Là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhằm tạo ra hệ số nhân cao nhất.
Ở giai đoạn này các chồi được kích thích phát sinh thành nhiều chồi, mầm nhằm
cung cấp cho các lần cấy chuyển tiếp theo. Hệ số nhân phụ thuộc nhiều vào vai trò
của các loại phytohoocmon (thường là cytokynin).
1.1.3.3. Tạo cây hoàn chỉnh, huấn luyện cây con
Tạo cây hoàn chỉnh: Các chồi in vitro đủ tiêu chuẩn được chuyển sang môi
trường tạo rễ để tạo ra cây giống in vitro hoàn chỉnh với đầy đủ thân, lá, rễ. Trong
giai đoạn này, nồng độ cytokynin được giảm xuống và tăng nồng đô auxin nhằm
kích thích sự hình thành rễ.
Huấn luyện cây con: Là giai đoạn chuấn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ

bằng nhiệt độ cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó. Do đó mẫu cấy thực
vật phải được khử trùng bằng dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường
dùng là hypochlorite calcium, hypochlorite sodium, oxy già,… Các mẫu cấy sau
khi chọn phải rửa phải ngâm rửa mẫu bằng xà phòng dưới dòng chảy rồi mới cho
vào ngâm trong dung dịch khử trùng. Hiệu quả xử lý các chất phụ thuộc vào thời
gian, nồng độ


và khả năng xâm nhập vào các khe của tế bào và khả năng đẩy hết bọt khí trên bề
mặt các mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng hoạt động của các chất khử
trùng trước tiên người ta thường ngâm tế bào mô thực vật trong cồn 70 o trong 30
giây, sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn.
Việc xử lý thành công nguồn gây nhiễm phần lớn phụ thuộc vào kỹ thuật xử
lý trong nuôi cấy vô trùng. Các nguồn gây nhiễm phần lớn là bụi tóc, tay, quần áo vì
vậy trong khi cấy phải rửa tay bằng xà phòng, lau cồn 70 o tới khuỷa tay,…
Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng của một số chất khử trùng
Chất khử trùng

Nồng độ (%)

Thời gian xử lý (phút)

Hiệu quả

Hypochorite calcium

9 – 10

5 – 30


2 – 10

Trung bình

Chất kháng sinh

4 – 50 mg/l

30 – 60

Khá tốt

1.1.4.3. Carbon và nguồn năng lượng
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị
dưỡng, vì vậy cần phải bổ sung nguồn carbon vào môi trường nuôi cấy để cung cấp
năng lượng (Nguyễn Quang Thạch, 2001). Hai loại đường thường được sử dụng là
sucrose và glucose nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn. Nồng độ
sucrose thay đổi từ 2 – 3 % hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống, tuổi mẫu cấy, giai
đoạn sinh trưởng và yêu cầu thí nghiệm (Laneri; Franconi; Altavista, 1990).


1.1.4.4. Các khoáng đa lượng
Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây
trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng gồm N, P, K, S, Ca và Mg
được bổ sung vào môi trường nhằm cung cấp chất khoáng để cấu tạo tế bào, mô
thực vật được sử dung với nồng độ trên 30 ppm (Torres, 1989).
- Nguồn Nitơ (N): mô tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng các dạng
nitơ khoáng như amon và nitrat, đồng thời có thể sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ
như amino acid. Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3,
NaNO3 hoặc NH4NO3. Amonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc

Ion Mg+ là một ion linh động, có thể khuyếch tán vào trong tế bào như K+ vì vậy có
vai trò như một cation trung hòa các cation và các acid hữu cơ. Magie được cung
cấp dưới dạng magie sulphat MgSO4.7H2O (Dương Tấn Nhựt, 2011).
1.1.4.5. Các khoáng vi lượng
Các nguyên tố vô cơ cần một lượng nhỏ nhưng không thể thiếu cho sinh
trưởng của mô và tế bào thực vật còn được gọi là các nguyên tố vi lượng. Các
nguyên tố vi lượng cần cung cấp là: Fe,Zn, B, Mn, Cu, I, Mo, Ni,… (Torres, 1989).
1.1.4.6. Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Thông
thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của
chúng (White, 1943).
Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1),
acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol. Thiamin là một vitamin căn
bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào. Thiamin thường được sử dụng
với nồng độ biến thiên từ 0,1 – 10 mg/l. Acid nicotinic thường được bổ sung vào
môi trường nuôi cấy với nồng độ 0,1 – 5 mg/l, pyridoxine được sử dụng với nồng
độ 0,1
– 10 mg/l. Myo-inositol có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp tế bào,
thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ở nồng độ cao
50 - 100 mg/l (Dương Công Kiên, 2003).
1.1.4.7. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một
hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần
thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống
tốt cho mô và các tổ chức (Torres, 1989). Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này


thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội
sinh của chúng. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm
chính sau đây.

chồi hay tạo phôi vô tính. Cytokinin cũng có ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất
như quá trình sinh tổng hợp nucleic acid, protein, chlorophyll và ảnh hưởng đến các
hoạt động sinh lý của cây. Có ba loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy
mô là BA, kinetin và zeatin (Trần Văn Minh, 1997).
Kinetin đươc Skoog (1957) phat hiên ngẫu nhiên trong khi chiêt xuât acid
nucleic, kinetin hình thành và phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao từ chế phẩm
DNA có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi. Zeatin thực chất là một dẫn xuất của
adenine có tác dụng kích thích sự tạo chồi nhưng giá thành cao nên ít sử dụng. BA
tuy la cytokinin tông hơp nhân tao nhưng co hoat tinh manh hơn kinetin và bền nhiệt
với độ cao hơn zeatin.
c. Gibberellin (GA)
Gibberellin được phát hiện vào những năm 1930. Lịch sử phát hiện nhóm
hormone này bắt đầu từ 1895 khi người Nhật nói về bệnh lúa von. Năm 1926, xác
định được bệnh đó là do loài nấm Gibberella fujikuroi gây ra. Đến những năm 30,
mới phân lập và tinh chế được hoạt chất, được gọi là gibberellin. Mãi sau chiến
tranh thế giới thứ II năm 1950, người Anh và người Mỹ mới biết đến công trình này
của người Nhật. Tới nay, người ta đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm
gibberellic acid. Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô thực vật là
GA3.
Hiệu quả sinh lý rỏ rệt nhất của gibberellin là kích thích mạnh mẽ sự sinh
trưởng kéo dài của thân bằng cách kích thích sự phân cắt tế bào và sự tăng dài của tế
bào. Gebberellin cũng kích thích sự nảy mầm của hạt và củ, do đó nó có tác dụng
đặc trưng trong việc phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của chúng. Trong nhiều trường hợp
gibberellin kích thích sự ra hoa rõ rệt. Ảnh hưởng đặc trưng của gibberellin lên sự ra
hoa là kích thích sự sinh trường kéo dài và nhanh chóng của cụm hoa. Đối với sự
sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt thì gibberellin có vai trò gần giống với
auxin, nó làm tăng kích thước quả và tạo nên quả không hạt (Hoàng Minh Tấn;
Nguyễn Quang Thạch, 1993).