BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN MINH TRANG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ
TRÊN CHUỘT BỊ THIẾU MÁU NÃO CỤC BỘ VÀ
KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ACETYLCHOLINESTERASE
CỦA RAU ĐẮNG BIỂN
(BACOPA MONNIERI(LINN.) WETTST)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ


viên, giúp đỡ tôi hoàn thành nhiệm vụ của mình.
Hà Nội, tháng 10 năm 2014
Nguyễn Minh Trang


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 3
1. Bệnh Alzheimer ...................................................................................... 3
1.1. Dịch tễ .............................................................................................. 3
1.2. Yếu tố nguy cơ ................................................................................. 3
1.3. Triệu chứng ...................................................................................... 4
1.4. Cơ chế bệnh sinh .............................................................................. 5
1.5. Acetylcholinesterase và thuốc kháng enzym acetylcholinesterase 10
1.6. Một số nhóm thuốc khác điều trị bệnh Alzheimer ........................ 11
1.7. Đích tác dụng của các thuốc điều trị Alzheimer trong tương lai ... 11
2. Rau đắng biển .................................................................................... 13
2.1. Vị trí phân loại ............................................................................... 13
2.2. Đặc điểm thực vật .......................................................................... 14

các mẫu M1, M2 ................................................................................... 38
3.2.2. Nghiên cứu tác dụng ức chế hoạt tính enzym AChE ex vivo của
các mẫu M1, M2 ................................................................................... 41
Chƣơng 4: Bàn luận ...................................................................................... 43
4.1. Về tác dụng cải thiện trí nhớ của rau đắng biển ............................... 43
4.2. Về tác dụng ức chế hoạt tính enzyme AChE in vitro và ex vivo của
rau đắng biển ......................................................................................... 50
KẾT LUẬN .................................................................................................... 55
KIẾN NGHỊ VÀ ĐỀ XUẤT ......................................................................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACh

Acetylcholine

AChE

Enzym Acetylcholinesterase


Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)

NFT

Đám rối thần kinh (Neurofibrillary tangle)

NMDA

N-methyl D-aspartate

MAPT

Một gen mã hóa protein Tau (Microtubule-Associated
Protein Tau)

SOD

Superoxide dismutase

SSRIs

Các chất ức chế tái hấp thu serotonin chọn lọc (Selective
serotonin reuptake inhibitors)

SSTT

Sa sút trí tuệ



lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình
1.1. Mối liên quan giữa protein Tau, β amyloid và ApoE4
với bệnh Alzheimer

Trang
8

1.2. Hình ảnh rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn.) Wettst)

14

2.1. Sơ đồ chiết xuất mẫu M1

25

2.2 . Sơ đồ chiết xuất mẫu M2

26

2.3. Mô hình mê lộ nước Morris

29

3.1. Đồ thị biểu diễn thời gian tiềm tàng của các lô chuột thử


gian và thời gian, ngôn ngữ, tư duy nhận thức, hành động... ảnh hưởng nặng nề
đến chức năng và chất lượng cuộc sống, gây nhiều khó khăn cho người bệnh,
cho gia đình và cả cộng đồng xã hội.
Các thuốc điều trị Alzheimer chủ yếu gồm các thuốc ức chế
cholinesterase, thuốc kháng thụ thể N-methyl – D- Aspartat, thuốc tăng cường
hoạt tính serotonin. Ba nhóm này đa số là thuốc tân dược nhưng giá thành thuốc
tương đối cao và có những tác dụng không mong muốn. Do đó nhu cầu nghiên
cứu phát triển các thuốc mới có nguồn gốc từ dược liệu để hỗ trợ và điều trị
Alzheimer là rất cần thiết.
Theo Y học cổ truyền Ấn Độ, rau đắng biển (Bacopa monnieri (Linn)
Wettst. được sử dụng để điều trị rối loạn tâm thần kinh như lo lắng, sa sút trí tuệ,
trí nhớ kém. Trên thế giới cũng đã có những nghiên cứu chứng minh hiệu quả
của rau đắng biển trên hệ thần kinh của chuột và người. Rau đắng biển (Bacopa
monnieri (Linn) Wettst) nhiều năm nay đã là món ăn phổ biến với người dân

1


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

Việt Nam. Tuy nguồn nguyên liệu dồi dào như vậy nhưng rau đắng biển vẫn
chưa được chú trọng nghiên cứu làm thuốc điều trị Alzheimer, trong khi nhu cầu
sử dụng là khá phổ biến và bệnh nhân phải mua thuốc nhập từ nước ngoài với
giá thành khá cao. Điều này gây tổn thất về giá trị kinh tế cũng như ý nghĩa xã

lại các thông tin mới học được chậm hơn người bình thường, tuy nhiên nếu họ
được cho thêm thời gian để thực hiện những hoạt động này thì họ vẫn đạt được
các thành tích trí tuệ ở mức chuẩn của người bình thường. Các hoạt động thường
ngày của họ cũng không bị ảnh hưởng.
Bệnh Alzheimer là nguyên nhân hay gặp nhất của các loại sa sút trí tuệ,
chiếm tỷ lệ khoảng hai phần ba tổng số các trường hợp sa sút trí tuệ. Bệnh
Alzheimer thường xuất hiện trễ nhưng một số trường hợp lại xuất hiện sớm,
trước 60 tuổi. Giữa các thể bệnh Alzheimer xuất hiện sớm và xuất hiện trễ có
những điểm khác nhau rõ rệt, trong đó rõ nhất là sự hiện diện của các đột biến di
truyền vốn hay gặp nhất trong thể bệnh Alzheimer xuất hiện sớm
1.1.

Dịch tễ bệnh Alzheimer
Tỷ lệ mắc sa sút trí tuệ ở những nước phát triển, mà thể nặng nhất là

Alzheimer, lên tới 8% đối với người từ 65 tuổi trở lên. Với tuổi cao hơn (85 trở
lên), tỷ lệ ở nhiều nước có thể lên đến 50%, có nghĩa là cứ hai người thì có một
người mắc. Có một nửa số trường hợp mất trí mới phát hiện mỗi năm là mắc

3


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi


hàng ngày. Đáng chú ý nhất là giảm trí nhớ, khó khăn trong việc nhớ các sự kiện
gần đây đã học được và không có khả năng để tiếp thu các thông tin mới. Một số
triệu chứng ban đầu của bệnh Alzheimer có thể không được chú ý đến, đó là
người bệnh có những vấn đề với các chức năng điều hành não bộ về sự chú tâm,

4


tính quy hoạch, tính linh hoạt, và tư duy trừu tượng, hoặc suy yếu trong phần
não bộ lưu trữ ngữ nghĩa (bộ nhớ của ý nghĩa, và các mối quan hệ, khái niệm).
Những đặc điểm này thường là triệu chứng tiền lâm sàng của bệnh
Một số rối loạn về năng lực nhận thức [6], [7],[18], [21]:
Rối loạn về trí nhớ
Rối loạn về trí nhớ gần như bao giờ cũng là biểu hiện sớm nhất của bệnh.
Những dấu hiệu ban đầu thường kín đáo, diễn biến âm thầm và dễ bị nhầm lẫn
chỉ là những biểu hiện thông thường của tuổi già. Bệnh nhân hay nhắc đi nhắc
lại nhiều lần những câu hỏi mà họ nghĩ là mới nêu lần đầu tiên, hay quên những
chuyện vừa mới xảy ra.
Những rối loạn trí nhớ này nhanh chóng kéo theo những rối loạn khác về
hoạt động thần kinh cao cấp, dần dẫn đến hình thành sa sút trí tuệ. Rối loạn trí
nhớ ảnh hưởng ngày càng nhiều đến mọi hoạt động hàng ngày, và là nguyên
nhân quan trọng trong việc hạn chế tính tự quản. Các công trình nghiên cứu thần
kinh tâm lý học cho thấy các rối loạn về trí nhớ gặp trong bệnh Alzheimer có cơ
chế rất phức tạp. Một số cơ chế liên quan đến các tổn thương của cấu trúc não
đặc biệt, nhất là về lưu giữ thông tin. Một số khác liên quan đến các trung tâm
của chú ý, tri giác, ngôn ngữ, các trung tâm xử lý thông tin.
Rối loạn về ngôn ngữ
Rối loạn ngôn ngữ được coi là những rối loạn về nhận thức hay gặp nhất
sau các rối loạn về trí nhớ. Gặp trong khoảng 40% các trường hợp sa sút trí tuệ
nhẹ và 100% trong các trường hợp nặng. Trong quá trình nói chuyện, các dấu

bệnh giống nhau gồm có sự hiện diện của các mảng amyloid (amyloid plaques),
các búi sợi tơ thần kinh (neurofibrillary tangles), và sự mất tế bào thần kinh. Bản
chất của mảng amyloid là sự kết tập ngoài tế bào của protein β amyloid . Sự kết
tập của protein tau và của các tiểu sợi thần kinh (neurofilament) trong thân tế
bào thần kinh tạo ra các búi sợi tơ thần kinh. Chính các mảng amyloid và các búi
sợi tơ thần kinh là nguyên nhân dẫn đến chết tế bào thần kinh. Hiện nay có một
cách phân loại dựa trên sự hiện diện ít hay nhiều của các các búi sợi tơ thần kinh
để xếp hạng mức độ nặng nhẹ của bệnh Alzheimer. Theo cách phân loại này,
bệnh Alzheimer được phân ra thành sáu mức độ từ I đến VI. Ở độ I và độ II, các
búi sợi tơ thần kinh chỉ hiện diện khu trú tại vỏ hải mã (hippocampal cortex) và
vỏ trong rãnh mũi (entorhinal cortex), trong khi đó các búi sợi tơ thần kinh lại
hiện diện lan tràn tại tất cả các vùng vỏ não mới trong bệnh Alzheimer độ V và
VI. [1]
1.5.

Di truyền học bệnh Alzheimer
Bệnh Alzheimer có thể do tương tác bởi nhiều yếu tố như di truyền, di

truyền ngoài ADN và các nhân tố thuộc về môi trường. Đột biến ở amyloid
protein, presenilin (PS-1 và PS-2) – nguyên nhân gây khởi phát bệnh Alzheimer

6


sớm (
mien phi
phi

bằng cách tăng sản xuất β amyloid. Điều này làm cho bệnh Alzheimer trầm
trọng hơn.
1.5.2. Protein Tau
Bệnh Alzheimer có tác nhân là nhiều loại protein gây bệnh, tích lũy riêng
rẽ hoặc kết hợp cùng nhau ở trong não. Bệnh Alzheimer có liên quan không chỉ
với sự tích tụ bất thường các mảng amyloid mà còn của các đám rối thần kinh
(NFT). Các đám rối thần kinh hình thành trong tế bào và chủ yếu được tạo thành
do sự bất thường của quá trình biến đổi sau dịch mã sau khi tổng hợp protein
Tau, bao gồm sự tăng phosphoryl hóa và acetyl hóa [14]. Một vài nghiên cứu
gần đây đã đưa ra các quan điểm khác với truyền thống rằng chức năng chính
của protein Tau là để ổn định các vi ống và sự kết tập các protein Tau gây khiếm
khuyết thông qua cơ chế làm mất chức năng các vi ống này. Các nghiên cứu
nuôi cấy tế bào và trên chuột biến đổi gen cho thấy protein Tau có thể tạo điều
kiện hoặc kích thích việc dẫn truyền thần kinh thông qua việc điều hòa sự phân
bố các phân tử dẫn truyền tín hiệu có liên quan đến hoạt động của synap [32].
Tuy nhiên, khi có những biến đổi bất thường, protein Tau xuất hiện nhiều hơn ở
đuôi gai, tại đó gây ảnh hưởng đến việc dẫn truyền thần kinh. Các oligome β
amyloid thúc đẩy quá trình này tại hậu synap làm tăng cường lượng protein Tau
thông qua quá trình có liên quan đến thành phần của nhóm enzym MARK (là
nhóm enzym điều tiết ái lực của các vi ống). Một số nghiên cứu trên hệ gen cho
thấy đột biến ở APP hoặc presenilin là nguyên nhân tích tụ β amyloid trong não,
từ đó gây nên các mảng amyloid và các đám rối thần kinh (NFTs), trong khi đó
đột biến protein Tau tạo nên các đám rối thần kinh nhưng không tạo mảng
amyloid và cũng không gây nên bệnh Alzheimer.

8


bào chống lại sự tấn công của các mảnh vỡ ApoE độc hại [12].
Một số nghiên cứu gần đây đã giả định rằng những gốc tự do được sinh ra
do quá trình stress oxy hóa và viêm cũng là nguyên nhân quan trọng trong sinh
bệnh học của bệnh Alzheimer.
1.6. Acetylcholinesterase và thuốc kháng enzym acetylcholinesterase
Acetylcholin là chất trung gian hoá học có mặt trong phần lớn các synap
thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thần kinh - cơ. Acetylcholin tìm thấy ở
hành não, cầu não, tiểu não, thân não, não trung gian,thể vân và vỏ não mới
(nhiều nhất ở vùng vận động). Acetylcholin còn tìm thấy trong tuỷ sống, các
hạch thần kinh thực vật, các tận cùng thần kinh tiếp xúc với cơ quan ngoại vi.
AChE là một hydrolase thủy phân acetylcholin, được tìm thấy chủ yếu ở
các nút thần kinh-cơ và các khe synap, nhằm chấm dứt quá trình truyền tín hiệu
ở các khớp thần kinh. AChE có hoạt tính xúc tác cao, mỗi phân tử AChE phân
giải 25000 phân tử ACh mỗi giây. Có bốn vị trí hoạt động chính của AChE
trong quá trình thủy phân ACh là vị trí ester hóa, vị trí anion, túi acyl và vị trí
oxy-anion [38].
Nhóm thuốc ức chế enzym acetylcholinesterase được dùng để cải thiện tình
trạng suy giảm acetylcholin trong hệ thần kinh trung ương ở các bệnh nhân sa
sút trí tuệ do bệnh Alzheimer và những khiếm khuyết này gây suy giảm trí nhớ.
Các thuốc thuộc nhóm này bao gồm: tacrin, donepezil, rivastigmin, galantamin.
Donepezil (Aricept): điều trị bệnh Alzheimer trong tất cả các giai đoạn.
Donepezil là thuốc rất chọn lọc acetylcholinesterase. Sự chọn lọc này được
khẳng định là làm giảm tác dụng phụ của thuốc.
Rivastigmin (Exelon): điều trị bệnh Alzheimer's trong giai đoạn nhẹ và vừa.
Rivastigmin chủ yếu ức chế một trong bốn phân nhóm của enzym
acetylcholinesterase–G1, được tìm thấy ở vùng dưới đồi và vỏ não.

10



trừ chúng khỏi não.

11


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

Butyrylcholinesterase
Sự dẫn truyền thần kinh xảy ra khi acetylcholin được giải phóng từ màng
trước synap rồi liên kết với các thụ thể nicotinic hoặc muscarinic ở màng sau
synap. Bộ não của động vật có vú thường có hai dạng chính của enzym
cholinesterase: acetylcholinesterase và butyrylcholinesterase. Cả hai dạng này
đề có khả năng thủy phân acetylcholin, Hai enzym này khác nhau về mặt di
truyền, cấu trúc và động học. AChE nằm ở khe synap (dạng hòa tan) và màng
synap (dạng liên kết với màng), còn butyrylcholinesterase (BuChE) chủ yếu có
liên quan đến tế bào thần kinh đệm. Một tính chất quan trọng vê sự khác biệt
giữa các chất ức chế cholinesterase là tính đặc hiệu với mỗi loại enzym bị ức
chế. Có ba tác nhân ức chế AChE là ba enzym chính đóng vai trò điều hòa bằng
cách làm giảm nồng độ acetylcholin trong não. Mặc dù chỉ chiếm 10% tổng hoạt
độ cholinesterase trong vỏ thái dương của não khỏe mạnh, 27 nghiên cứu gần
đây đã chỉ ra rằng enzym này có khả năng thủy phân acetylcholin và đóng vai
trò quan trọng trong việc dẫn truyền thần kinh hơn so với nó từng được đánh giá
trước đây. Tầm quan trọng của BuChE trong dẫn truyền thần kinh càng tăng khi
bệnh Alzheimer tiến triển. Bởi vì khi đó hoạt động của enzym AChE giảm tới


động học. Những bằng chứng gần đây cho thấy BuChE có thể cũng có thể là
nguyên nhân và tiến triển của bệnh Alzheimer. Thử nghiệm lâm sàng được thực
hiện bằng cách sử dụng tác nhân có tác dụng chọn lọc với BuChE và một chất
ức chế AChE như rivastigmine, ngoài ra một nhóm bệnh nhân được sử dụng cả
thuốc ức chế AChE và ức chế BuChE, cho kết quả khả quan trên nhóm sử dụng
đồng thời cả thuốc ức chế AChE và BuChE trong điều trị Alzheimer và chứng
suy giảm trí nhớ [20].
Protein Tau
Protein Tau là một protein liên kết vi ống, bị phosphoryl hóa quá mức do
mất cân bằng hoạt động của hai enzym kinase và phosphatase là các enzym điều
hòa hoạt động phosphoryl hóa. Ngoài ra, protein Tau tách ra từ các vi ống và tự
tập hợp với nhau tạo thành oligome không hòa tan rồi nhập vào đám rối. Do đó
độc tính được gây ra bởi các oligomer hoặc do các vi ống đã bị biến đổi. Để
nghiên cứu thuốc điều trị bệnh này, đã có rất nhiều nghiên cứu được triển khai
nhằm xác định và ngăn chặn các enzym kinase chịu trách nhiệm trong điều hòa
quá trình phosphoryl hóa và nhiều kinase đã được đưa vào nghiên cứu, bao gồm
glycogen synthase kinase (GSK-3), cyclin phụ thuộc kinase-5 (CDK-5), các
kinase thuộc nhóm MAPK (microtubule affinity regulating kinase), JNKs (c-Jun
N-terminal Kinase), casein kinase, CaMK-II (calcium calmodulin-dependant
kinase II), PKA (protein kinase)…[16], [20].
2.

Rau đắng biển

2.1. Vị trí phân loại
Rau đắng biển có tên khoa học là Bacopa monnieri (Linn) Wettst., thuộc
họ hoa mõm chó (Scrophulariaceae). Các tên gọi khác là Bacopa monniera (L.)
Pennell yes, Lysimachia monnieri L. Cent., Graticola monnieri L., Monniera
cunefolia Michaux, Herpestis monniera L. Kunth.

Ấn Độ, Sri Lanka, Nam Trung Quốc, Đài Loan sang Đông Nam Á, trong đó có
Việt Nam. Cây mọc tại tại ruộng, trên đất có pha cát, ven ruộng, vùng bãi cỏ ẩm
nơi thấp đến độ cao khoảng 1000m. Tại Việt Nam, cây được gặp hầu như trên
toàn quốc, tại các vùng đồng bằng và trung du Bắc và Nam Việt Nam.
2.3.

Thành phần hóa học

14


Một số thành phần hóa học có tác dụng dược lý trong rau đắng biển gồm
alkaloid, saponin và sterol. Mặc dù alkaloid brahmin là thành phần đầu tiên
được xác định trong rau đắng biển nhưng Saponin mới là chất có hoạt tính
chính. Các saponin là glycosid, một đơn vị đường gắn với 1 aglycon
(sapogenin). Phần sapogenin quyết định loại saponin là steroid hoặc triterpenoid.
Thành phần đem lại hiệu quả cải thiện trí nhớ trong rau đắng biển là saponin
triterpenoid có tên là bacosid [33].
Bacosid A và bacosid B:
Bacosid A được phát hiện trong rau đắng biển năm 1965 bởi Chatterji,
trong đó bacosid A chiếm khoảng 2,5-3%, khi bị thủy phân trong môi trường
acid cho bacogenin A1, A2, A3, A4. Bacosid A, được xác định có tên khoa học
là 3-( α Larabinopyranosyl)-O-β-D-glucopyranosid-10,20- dihydroxy-16-ketodammar-24-en. Bacosid A được coi là hoạt chất có tác dụng chính trong việc cải
thiện bệnh suy giảm trí nhớ trong rau đắng biển [25],[26.]
Bằng phương pháp HPLC, các nhà khoa học đã phát hiện bacosid A là
hỗn hợp của 4 saponin được đặt tên là bacosid A3, bacosid II, một jujubogenin
là đồng phân của bacopasaponin C là 3-O-[ -L-arabinofuranosyl-(1→2)-{β-Dglucopyranosyl-(1→3)-}- -L-arabinopyranosyl]

jujubogenin


hoặc pseudojujubogenin như: bacopasid N1, bacopasid N2, bacopasid-IV và
bacopasid-V [18].
Bacopasaponin A, bacopasaponin B và bacopasaponin C:
- Ba saponin triterpenoid được phân lập tiếp theo là bacopasaponin A, B
và C, được xác định tên khoa học:
- Bacopasaponin

A:

3-O-α-L-arabinopyranosyl-20-O-α-L-

arabinopyrasonyl –jujubogenin
- Bacopasaponin

B:

3-O-[α-L

arabinofuranosyl-

(1→2)-α-L-

arabinopyranosyl] pseudojujubogenin
- BacopasaponinC:

3-O-β-Dglucopyranosyl(1→3)-{α-L-

arabinofuranosyl-(1→2)}-α-L arabinopyrasonyl] pseudojujubogenin
[21]
Bacopasaponin D, bacopasaponin E, bacopasaponin F, bacopasaponin G

stigmastarol, β-sitosterol, một số amino acid như alpha alanin, aspartic acid,
glutamic acid, serin và các ester, heptacosan, octacosan, nonacosan, triacontan,
hentriacontan, dotriacontan, nicotin, 3-formyl-4-hydroxy-2H-pyran (C6H6O3).
brahamosid, brahminosid, brahmic acid, isobrahmic acid, vallerin, pectic acid,
các acid béo, tanin, volatile oil, ascorbic acid, thanakunic acid và asiatic acid.
2.4.

Tác dụng dƣợc lý

2.4.1. Tác dụng trong việc cải thiện trí nhớ và nhận thức
Nghiên cứu trên động vật
Một nghiên cứu thử nghiệm hiệu quả của cao chiết rau đắng biển trên việc
thay đổi hành vi của chuột Wistar khi uống cao chiết ở các khoảng thời gian
khác nhau và liều dùng khác nhau. Sau một khoảng thời gian, chuột được thử
nghiệm học tập qua thị giác (mê lộ chữ T) và thử nghiệm tránh né thụ động. Dữ
liệu được so sánh với những con chuột cùng lứa tuổi. Kết quả cho thấy có sự cải
thiện rõ rệt về khả năng học tập qua thị giác và cải thiện trí nhớ ở chuột khi điều

17