VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ
Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN TỰ KỶ VIỆT NAM
BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ
VÙNG MÃ HÓA (EXOME)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2019


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN THU HIỀN

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC BIẾN THỂ
Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN TỰ KỶ VIỆT NAM
BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ TOÀN BỘ
VÙNG MÃ HÓA (EXOME)

Chuyên ngành:
Mã số:

Hóa sinh học

quý báu của Viện Hàn lâm KHCNVN.

Tác giả luận án

Nguyễn Thu Hiền

i


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác
với các cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Tác giả luận án

Nguyễn Thu Hiền

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................. vi

Rối loạn tan rã thời thơ ấu ................................................................................ 12

1.2.4.

Rối loạn phát triển lan toả không xác định ...................................................... 12

1.2.5.

Phương pháp chẩn đoán và điều trị .................................................................. 12

1.3.

Các yếu tố di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ ........................................... 15

1.3.1.

Các hội chứng di truyền liên quan đến bệnh tự kỷ .......................................... 15

1.3.2.

Những yếu tố gây bệnh ở cấp độ di truyền học ............................................... 17

1.4.

Các tiến bộ nghiên cứu về di truyền của rối lo n phổ tự kỷ bằng giải
tr nh tự gen thế hệ mới .................................................................................. 23

1.4.1.

Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới ........................................................ 23

2.3.2.

Tạo thư viện DNA ............................................................................................ 36

2.3.3.

Giải trình tự gen bằng máy Illumina ................................................................ 38

2.3.4.

Tiền xử lý số liệu và phân tích dữ liệu ............................................................. 38

2.3.5.

Nhân gen bằng kĩ thuật PCR ............................................................................ 43

2.3.6.

Giải trình tự gen tự động trên máy Sanger....................................................... 43

2.3.7.

Phân tích các gen trong mối tương tác ............................................................. 44

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................................. 46
3.1.

Tách chiết DNA tổng số ................................................................................. 46

3.2.

3.3.4.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T03 ................................................................. 62

3.3.5.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T06 ................................................................. 65

3.3.6.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T07 ................................................................. 73

3.3.7.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T08 ................................................................. 79

3.3.8.

Biến thể di truyền ở bệnh nhân T09 ................................................................. 83

3.4.

Các gen nh y cảm với ASD có liên quan đến kênh ion .............................. 86

3.5.

SNP RS7725785 trên gen HTR4.................................................................... 88

CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ ....................................................................... 89
4.1.



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết
tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ADI-R:

The Autism Diagnostic Interview - Bảng phỏng vấn chẩn đoán
Revised
tự kỷ có điều chỉnh

ADOS

The Autism Diagnostic Observation Bảng quan sát chẩn đoán tự
Schedule
kỷ

ASD

Autism Spectrum Disorders

Rối loạn phổ tự kỷ

BWA


Copy number variants

Biến thể đa hình số lượng
bản sao

Cowden syndrome

Hội chứng Cowden

CS

hàng

DBC-P

Developmental Behavior Checklist for Bảng câu hỏi phát triển hành
Parent
vi cho bố mẹ

dbSNP

The Single Nucleotide Polymorphism Ngân hàng dữ liệu đa hình
Database
đơn nucleotide

DSM

Cẩm nang chẩn đoán và
Diagnostic and Statistical Manual of
thống kê về chứng rối loạn


HDAC1

Histone deacetylase 1.

Dữ liệu đột biến gen người

ICD

International Classification of Diseases

Phân loại quốc tế về bệnh tật

IGV

Integrated Genomics Viewer

Công cụ xem hệ gen hợp
nhất

Intellectual disability

Khuyết tật trí tuệ

ID

M-CHAT Modifier Check-list Autism in Toddlers
MECP2
NCBI
NHGRI

PDD

Pervasive developmental disorders

Rối loạn phát triển lan tỏa

PLADOS

The Pre - linguistic Autism Diagnostic Bảng quan sát chẩn đoán tự
Observation Schedule
kỷ dành cho trẻ chưa biết nói

SAM

Sequence Alignment / Map

Sắp xếp/gióng hàng trình tự

SBL

sequencing by ligation

Giải trình tự bằng ghép nối

SBS

sequencing by synthesis

Giải trình tự bằng tổng hợp



Trình tự đoạn oligonuleotide....................................................

34

Bảng 3.1.

Chất lượng DNA tổng số..........................................................

46

Bảng 3.2.

Bảng thông tin chất lượng đọc của các mẫu giải trình tự.........

49

Bảng 3.3.

Kết quả gióng hàng của các mẫu giải trình tự với hệ gen
tham chiếu................................................................................

50

Bảng 3. 4.

Kết quả xác định và chú giải biến thể......................................

51



Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh
nhân T03...................................................................................

62

Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân
T03...........................................................................................

64

Bảng 3.10.
Bảng 3.11.

56

Bảng 3.12.

Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh
nhân T06..................................................................................

67

Bảng 3.13.

Bảng thống kê biến thể của bệnh nhân T06.............................

68

Bảng 3.14.


83

Bảng thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân
T09...........................................................................................

85

Tổng kết các gen liên quan đến bệnh tự kỷ ở 07 bệnh
nhân..........................................................................................

91

Một số đa hình liên quan đến ASD được công bố trên thế
giới

109

Bảng 3.18.
Bảng 3.19.
Bảng 4.1.
Bảng 4.2.

ix

80


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.


Hình 2.2.

Quy trình tạo thư viện DNA...................................................

37

Hình 2.3.

Sơ đồ phân tích dữ liệu giải trình bằng các phần mềm tin
sinh chuyên sâu......................................................................

39

Hình 3.1.

Kết quả tách DNA tổng số từ mẫu máu toàn phần................

46

Hình 3.2.

Kết quả kiểm tra chất lượng thư viện DNA...........................

47

Hình 3.3.

Hình ảnh minh họa file kiểm định chất lượng.......................


thể
p.Trp13569Cys
ở
bệnh
nhân
T02..........................................................................................

61

Hình 3.9.

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T03............................

63

Hình 3.10.

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Val2430Ala trên gen MUC16 ở bệnh nhân
T03...........................................................................................

65

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T06............................

67

Hình 3.8.

Hình 3.11.


72

Hình 3.17.

Trình tự amino acid của RYR3 ở các loài khác nhau.............

73

Hình 3.18.

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T07............................

75

Hình 3.19.

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Val13167Met trên gen MUC16 ở bệnh nhân
T07..........................................................................................

76

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Arg801Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân
T07..........................................................................................

77

Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện

Sự tương tác của các gen ở bệnh nhân T09...........................

84

Hình 3.12.

Hình 3.13.

Hình 3.14

Hình 3.15.

Hình 3.20.

Hình 3.21.

Hình 3.22.

Hình 3.26.

xi


Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger phát hiện
biến thể p.Ala2224Ser trên gen MUC16 ở bệnh nhân
T09...........................................................................................

85

Hình 3.28.

thường gây kích thích cảm giác. Ước tính mới nhất cho thấy rằng ASD ảnh hưởng
đến khoảng 1 trong 59 trẻ em dưới 8 tuổi và tỷ lệ mắc bệnh ở bé trai chiếm ưu thế
so với bé gái.
Bệnh được cho là có nguy cơ di truyền do ảnh hưởng đồng thời bởi nhiều biến
thể gen khác nhau. Trong những nghiên cứu ở các cặp song sinh, sự đồng nhất kiểu
hình của ASD ở những cặp song sinh cùng trứng chiếm 70-90%, trong khi tỉ lệ này
ở những cặp song sinh khác trứng chỉ 0-30%. Các nghiên cứu cho thấy rằng, anh
chị em trong cùng một gia đình có một bệnh nhân mắc bệnh thì nguy cơ mắc bệnh
trong gia đình lên tới 25%, cao hơn nhiều so với nguy cơ mắc bệnh của dân số nói
chung. Trong số những rối loạn tâm thần và thần kinh có tính di truyền, tự kỷ chiếm
tỷ lệ cao lên tới 40-80%. Sự tương tác yếu tố môi trường với yếu tố di truyền gây ra
những thay đổi bất thường trong sự phát triển tế bào thần kinh, phát triển trí não.
Trong nghiên cứu di truyền bệnh tự kỷ, đã có nhiều phương pháp được áp
dụng như FISH, Microarrya, aCGH. Tuy nhiên, đối với con người, trí tuệ là một
tính trạng cực kỳ phức tạp do nhiều gen quy định. Vì vậy, nghiên cứu ảnh hưởng
của thay đổi các gen liên quan đến trí tuệ, dẫn đến thiểu năng trí tuệ cũng như tự kỷ
cần được tiến hành ở toàn bộ hệ gen, nhất là vùng mã hóa (exome). Đây là hai
phương pháp nghiên cứu đã và đang đạt được nhiều bước tiến nhảy vọt trong
nghiên cứu di truyền bệnh này. Giải trình tự vùng mã hóa - Whole exome
sequencing (WES) là một ứng dụng của công nghệ giải trình tự thế hệ mới để xác
định các biến thể trên tất cả các vùng mã hóa trong hệ gen. Hàng chục nghìn biến
thể gen có thể được xác định trên exome trong nhiều bệnh phức tạp như: tim mạch,


2
thần kinh,... WES đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu lâm sàng vài năm
gần đây. Do đó, WES đang được coi là hướng đi đúng đắn để nghiên cứu di truyền
bệnh tự kỷ.
Tại Việt Nam, bệnh tự kỷ cũng có xu hướng tăng nhanh và cũng chưa có
phương pháp chữa trị triệt để, mà chỉ có các phương pháp hỗ trợ, cải thiện tình hình

p.Val13167Met; p.L13171F; p.E12869K; p.D13229E) ở 06 bệnh nhân.

5. Xác định đa hình rs7725785c.507+53G>T trên gen HTR4 ở 04 bệnh nhân.


4
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. BỆNH TỰ KỶ

1.1.1. Giới thiệu bệnh tự kỷ
Tự kỷ là một dạng rối loạn trong Rối Loạn Phát Triển Lan Toả (Rối Loạn Phổ
Tự Kỷ). Bệnh khởi phát sớm trong 3 năm đầu tiên của cuộc đời. Tự kỷ tác động đến
sự phát triển của trẻ trong 3 lĩnh vực chính đó là: tương tác xã hội, ngôn ngữ và
hành vi. Tự kỷ hay rối loạn phổ tự kỷ là một nhóm các hội chứng không đồng nhất
về mặt di truyền.
Bệnh nhân tự kỷ biểu hiện ra ngoài bằng những khiếm khuyết về tương tác xã
hội, khó khăn về giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, hành vi, sở thích và hoạt động
mang tính hạn hẹp, lặp đi lặp lại. Hiện tượng này bao gồm nhiều biểu hiện khác
nhau, ví dụ như người bệnh hay có hành động quay cổ tay, quay đầu hay có những
hành động có tính bắt buộc như xếp đồ chơi, búp bê, ô tô thành một hàng ngang
hoặc dọc. Nguy hiểm nhất chính là bệnh nhân hay tự làm mình bị thương như: lấy
tay chọc lên mắt, cấu lên da, tự đánh vào tay và đầu. Một dấu hiệu nữa là trẻ mắc
bệnh thường có khả năng đi lại chậm hơn nhiều so với trẻ khác, phải mất 2-3 năm
tuổi mới đi lại bình thường được. Khả năng giao tiếp bằng mắt của trẻ không tốt và
bệnh nhân thường có thái độ hờ hững với mọi thứ xung quanh.
Ngoài những triệu chứng lâm sàng cổ điển cụ thể, khoảng 31% bệnh nhân bị
khuyết tật trí tuệ, 20-25% có triệu chứng co giật (Canitano, 2007; Liu and Takumi ,
2014; Srivastava and Schwartz, 2014). Một số bệnh thường thấy đi kèm với ASD
bao gồm rối loạn lo âu (White et al, 2009), rối loạn giấc ngủ, rối loạn tiêu hóa

tư nhiều hơn vào lĩnh vực y tế đặc biệt là những bệnh liên quan đến thần kinh
(Blumberg, 2007).
Các đánh giá thống kê cho thấy tỉ lệ mắc ASD trên thế giới ở các nước khác
nhau là khác nhau. Năm 2006, theo thống kê của Williams và cộng sự, tỷ lệ ASD
trên toàn cầu là 20/10.000 (Williams et al, 2006). Đến năm 2012, Elsabbagh và
nhóm nghiên cứu của mình đã báo cáo tỷ lệ mắc ASD trên thế giới là 62/10.000, tức
là cứ 160 trẻ thì có 1 trẻ mắc bệnh (Elsabbagh et al, 2012).


6

Hình 1.1 Tỷ lệ bệnh tự kỷ ở một số nƣớc phát triển trên thế giới
(Nguồn: Trung tâm kiểm soát và Phòng chống bệnh - CDC, 2015)

Tỷ lệ bệnh năm 2015 theo thống kê của Baxter và cộng sự đã có sự gia tăng
đáng kể, ước tính khoảng 7,6/1000, tức là trong 132 người thí có 1 người mắc ASD
(Baxter et al, 2015). Trung tâm Kiểm soát và Phòng chống bệnh (CDC) ở Mỹ đã
đưa ra tỷ lệ trẻ mắc những rối loạn thần kinh trên toàn cầu năm 2014 là 1% (CDC,
2014). Hiện nay, có hơn 3,5 triệu người Mỹ mắc bệnh tự kỷ, ước tính 1/68 trẻ em
được chẩn đoán mắc bệnh (CDC, 2014). Như vậy, tỷ lệ tự kỷ ở trẻ em ở Hoa Kỳ
tăng 119,4% so với năm 2000 (1/150) đến năm 2010 (1/68) (CDC, 2014) (Hình
1.1). Vì thế, tự kỷ được đánh giá là chứng khuyết tật có tỷ lệ phát triển nhanh nhất
(CDC, 2008). Điều này dễ dàng được giải thích bởi lối sống ngày càng thực dụng
tại Mỹ. Bên cạnh Mỹ, Anh cũng là một nước có tỷ lệ tự kỷ ở mức cao (xấp xỉ 1%)
(Brugha et al, 2011). Ngoài Anh và Mỹ có tỷ lệ mắc tự kỷ cao, bệnh cũng có mặt ở
nhiều quốc gia trên thế giới. Do tỷ lệ trẻ tự kỷ gia tăng nhanh chóng đang đặt ra
những vấn đề lớn đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Tại Mỹ, tự kỷ được xếp vào
danh mục 13 dạng khuyết tật bẩm sinh và vấn đề trẻ tự kỷ đã được khẳng định là
một trong những ưu tiên hàng đầu trong chính sách y tế của nước này.
Tại một số nước ở châu Á hiện nay như Hàn Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Trung

2010, 2011 lần lượt là 450, 1792, 1968 (Quách Thúy Minh, 2011; Khoa tâm thần,
2012; Vu SH et al, 2014; Vu SH et al, 2017)


8
Theo thống kê của một số tổ chức nước ngoài, tỷ lệ bệnh tự kỷ ở Việt Nam là
75,1 tính trên 100.000 người () (Hình
1.2). Tuy nhiên con số này còn chưa phản ánh chính xác thực tế vì số liệu bệnh
nhân tự kỷ tại Việt Nam chưa được cập nhật đầy đủ và thường xuyên. Và điều đáng
nói là sự nhận thức về bệnh của người dân Việt Nam còn chưa cao, đặc biệt là ở
những vùng nông thôn. Do đó, số cha mẹ đưa con đến bệnh viện chẩn đoán bệnh
còn chưa đầy đủ.
Tại thành phố Hồ Chí Minh, năm 2000 chỉ có 2 trẻ đến Bệnh viện Nhi đồng 1
khám và điều trị chứng tự kỷ, thì năm 2008 số trẻ đến khám là 324, tăng hơn 160
lần. Song những năm gần đây, số lượt trẻ đến khám tại Khoa Tâm thần (Bệnh viện
Nhi Trung ương) được chẩn đoán rối loạn phổ tự kỷ hay có dấu hiệu tự kỷ ngày
càng gia tăng (Đậu Tuấn Nam and Vũ Hải Vân, 2015).

Hình 1.2 Tỷ lệ tự kỷ ở Việt Nam so với các nƣớc trong khu vực Châu Á
(Nguồn: />
Theo báo cáo của bệnh viện Nhi Trung ương, số trẻ đến khám muộn và được
chẩn đoán mắc bệnh tự kỷ vẫn còn tỷ lệ rất cao (43,86% trên 36 tháng tuổi). Số liệu
thống kê của Khoa Tâm bệnh (Bệnh viện Nhi Trung ương) cũng cho thấy, có sự
chênh lệch đáng kể giữa tỷ lệ mắc bệnh ở bé trai và bé gái (bé trai nhiều hơn 4-6 lần


9
so với bé gái), ở thành thị mắc bệnh nhiều hơn ở nông thôn. Thông tin này phần nào
cho thấy, vấn đề nhận thức của người dân về bệnh rất quan trọng trong việc phát
hiện, chẩn đoán và điều trị bệnh sớm.

về tương tác xã hội, khiếm khuyết trong quá trình phát triển ngôn ngữ, có những
hành vi kỳ lạ lặp đi lặp lại nhiều lần, khởi phát sớm trước 3 tuổi và khái niệm ―tự
kỷ‖ được ra đời từ đó.
Ngày nay, người ta dùng thuật ngữ ―Rối loạn phát triển lan tỏa‖ hoặc ―Rối
loạn phổ tự kỷ‖ để mô tả các trẻ em có các rối loạn phát triển trên 3 lĩnh vực chính
là: tương tác xã hội, rối loạn ngôn ngữ và hành vi. Rối loạn phát triển lan tỏa gồm
có 5 rối loạn chính: hội chứng Asperger, hội chứng rối loạn tan rã tuổi ấu thơ, hội
chứng Rett, hội chứng rối loạn lan tỏa không xác định và hội chứng tự kỷ.
1.2.1. Hội chứng Asperger
Hội chứng Asperger được đặt theo tên của bác sĩ nhi khoa người Áo Hans
Asperger vào năm 1944 khi ông mô tả nhóm trẻ em trong nghiên cứu của mình với
những biểu hiện: thiếu giao tiếp, kém hiểu biết về những cảm xúc của người khác
và thể chất yếu. Ngày nay, hội chứng Asperger được đặc trưng bởi sự tách biệt về
mặt xã hội và các hành vi kỳ cục khi trẻ khi còn nhỏ. Có những khiếm khuyết trong
tương tác xã hội và giao tiếp không lời. Thể hiện một số hành vi đơn điệu, định
hình, lặp lại; Khó khăn trong tiếp thu và lĩnh hội hành vi phi ngôn ngữ như vẻ mặt,
tư thế, tiếp xúc mắt, điệu bộ; Yếu kém trong việc hiểu và thể hiện cảm xúc
(Hamilton, 2000). Mặc dù tuân theo các qui tắc ngữ pháp, nhưng cách nói của trẻ
nghe có vẻ lập dị do sự bất thường ở âm điệu và các khuôn mẫu lặp đi lặp lại. Sự


11
vụng về có thể dễ nhận thấy ở cách phát âm rõ ràng và các hành vi vận động thô.
Mặc dù các dấu hiệu bất thường xuất hiện sớm từ trước năm 2 tuổi, nhưng lại kéo
dài đến hết cuộc đời (Baskin et al, 2006; McPartland, 2006). Trẻ bị Asperger
thường có trí nhớ rất tốt, có trí tuệ trung bình hoặc trên trung bình. Trẻ có khả năng,
sở thích về kĩ thuật và toán học. Hội chứng Asperger khác tự kỷ là không chậm
hoặc trì trệ trong phát triển trí tuệ, ngôn ngữ và nhận thức. Ước tính hiện năm 2015
số lượng bệnh nhân mắc Asperger lên đến 37,2 triệu người trên toàn cầu
(Collaborators, 2016) và con số này vẫn đang ngày càng tăng lên.