BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

HOÀNG QUỲNH HƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH NHIỄM VIRUS
VIÊM GAN C (HCV) Ở BỆNH NHÂN ĐẾN KHÁM
VÀ ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN BNĐTƯ
TỪ 6/2012 ĐẾN 6/2016

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

HÀ NỘI – 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

HOÀNG QUỲNH HƯƠNG

NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH NHIỄM VIRUS
VIÊM GAN C (HCV) Ở BỆNH NHÂN ĐẾN KHÁM
VÀ ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN BNĐTƯ
TỪ 6/2012 ĐẾN 6/2016
Chuyên ngành : Vi sinh

Complementary deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxynucleoside triphosphate

ELISA

Enzyme -Linked Immunosorbent Assay
(Xét nghiệm miễn dịch gắn enzyme)

HBV

Hepatitis B virus (Virus viêm gan B)

HCV

Hepatitis C virus (Virus viêm gan C)

HIV

Human Immunodeficiency Virus
(Virus gây suy giảm miễn dịch ở người)

LiPA

Line Probe Assay (Thử nghiệm line đầu dò)

PCR


triệu người trên thế giới đang sống với căn bệnh này [1]. Bệnh viêm gan virus
do năm loại virus viêm gan gây nên gồm A, B, C, D, E. Nhiễm virus viêm gan
A và E chỉ gây ra bệnh lý cấp tính và thường tự giới hạn, ít để lại hậu quả
nghiêm trọng. Ngược lại, viêm gan virus B, C và D có thể dẫn đến những
nhiễm trùng mãn tính với nguy cơ tiến triển thành xơ gan, ung thư gan và tử
vong. Bệnh viêm gan C gây ra bởi HCV (Hepatitis C virus), được xác định
lần đầu tiên vào năm 1989. Viêm gan do virus viêm gan C là một trong những
bệnh nguy hiểm và là một vấn đề đang được quan tâm đối với sức khỏe cộng
đồng bởi số lượng người nhiễm bệnh, cũng như các biến chứng nguy hiểm
đến sức khỏe (50% - 80% chuyển qua mạn tính, 20%- 25% bệnh nhân mạn
tính diễn tiến qua xơ gan và ung thư gan [2], [3], [4]. Theo Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO) năm 2014, trên thế giới có hơn 185 triệu người nhiễm HCV với
350.000 người chết mỗi năm [5]. Ở Việt Nam, khoảng 5 - 10% dân số nhiễm
HCV [6]. Ðể xác định nhiễm HCV, ngoài xét nghiệm phát hiện kháng thể
(anti HCV) người ta còn sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện
RNA của HCV trong máu của bệnh nhân. Mặc dù việc điều trị HCV rất tốn
kém nhưng với tiến bộ của y học, hiện nay có một số thuốc điều trị khá hiệu
quả. Tuy nhiên, để có thể chỉ định điều trị cũng như theo dõi quá trình điều
trị, người ta phải xác định số lượng virus trong máu (tải lượng virus) cũng
như xác định kiểu gen (genotype) của HCV.
Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương là cơ sở đầu ngành về chẩn
đoán, điều trị các bệnh truyền nhiễm nói chung, đặc biệt là các bệnh viêm
gan, trong đó có viêm gan C. Hàng năm, tại bệnh viện có khoảng 10.000 lượt


8

người đến khám và điều trị đến từ các tỉnh miền Bắc, miền Trung và Tây
nguyên. Trong số đó, có những bệnh nhân bị nhiễm HCV. Nhưng chưa có một
nghiên cứu nào đánh giá tỷ lệ nhiễm HCV trong số các bệnh nhân đến khám

thành viêm gan mãn tính và ung thư gan.
Tỷ lệ nhiễm HCV ở các khu vực trên thế giới có khác nhau. Trong đó
các nước châu Phi và châu Á có tỷ lệ nhiễm cao nhất, có khu vực lên tới
>10% dân số (hình1.1). Theo kết quả điều tra về y tế và dinh dưỡng quốc gia
của Mỹ, từ năm 1988 đến năm 1994 cho thấy số lượng nhiễm HCV là 3,9
triệu người. Trong đó, 2,7 triệu người Mỹ mắc HCV mạn tính. Tuy nhiên đa
số người bệnh có HCV dương tính có độ tuổi dưới 50 [9]. Virus viêm gan C
được chia thành 6 kiểu gen (genotype) ký hiệu bằng số từ 1 đến 6 và chia tiếp
ra các kiểu gen phụ ký hiệu bằng chữ a,b,c,…[10]. Trong các genotype của
HCV, genotype 1 chiếm tỷ lệ cao nhất trên thế giới. Trong đó, 1a phân bố toàn
thế giới, 1b phân bố nhiều ở Châu Âu và Bắc Mỹ , genotype 2 phân bố ở Địa
Trung Hải và Trung Đông. Genotype 3 thường thấy ở Pakistan, Úc, Scotland.
Genotype 4 ở Trung Đông và Châu Phi cũng như South Africa. Genotype 5 ở
Nam Phi và genotype 6 tại Hồng Kông và Việt Nam [11], [12], [13]. Tổng chi
phí y tế dành cho chẩn đoán và điều trị cũng như phòng viêm gan c dự đoán


10

tăng từ 30 tỷ USD vào năm 2009 lên đến hơn 85 tỷ USD vào năm 2024 [14].
Nếu không điều trị, viêm gan C diễn biến thành biến chứng xơ gan, ung thư
gan và có thể dẫn đến tử vong. Khoảng 60-70% số trường hợp sẽ tiếp tục tiến
triển thành bệnh gan mạn tính. Tỉ lệ nhiễm HCV dẫn đến xơ gan là 5-20% sau
20-30 năm. Trong đó có khoảng 1- 5 % sẽ tử vong vì hậu quả của những
nhiễm trùng mạn tính như xơ gan hoặc ung thư gan [15].

Hình 1.1. Phân bố tỷ lệ nhiễm HCV trên thế giới
(Nguồn: www: WHO, 2008)
1.1.2.Tình hình nhiễm viêm gan C ở Việt Nam
Ở Việt Nam hiện nay, theo số liệu của WHO có khoảng 5 - 10% dân số


truyền (acid nhân) trong huyết tương người bị nhiễm HCV RNA). Đây chính là
một trong những trở ngại lớn trong việc tìm hiểu cặn kẽ về virus này.
Mật độ HCV trong huyết thanh rất thay đổi, từ 1,03đến 1,72g/ml. Sở dĩ
có sự thay đổi này là do các virion lưu hành trong máu dưới nhiều dạng khác
nhau: hoặc là ở dạng tự do có tính lây nhiễm rất cao nhưng chỉ hiện diên ở
mật độ tương đối thấp (khoảng 1,03 g/ml), hoặc là ở dạng kết hợp với các đại
phân tử đặc biệt là các lipoprotein hoặc hiện diện trong các phức hợp miễn
dịch nhưng mật độ lại cao (khoảng 1,10 g/ml). Một điểm quan trọng nữa là
virus này có khả năng biến thể nhanh và tạo thành rất nhiều type và sub-type
kháng thuốc. Chính vì khả năng biến thể quá nhanh mà cho đến nay vẫn chưa
có một loại vaccine nào có hiệu quả đối với HCV.
1.2.2. Cấu trúc bộ gen của HCV
Bộ gen của HCV có một lõi chứa vật liệu di truyền là ARN sợi đơn
dương, kích thước là 9,6 kb mã hóa cho quá trình tổng hợp một polyprotein
tiền chất khoảng 3011 - 3033 acid amin. Sau đó polyprotein này sẽ được cắt
thành các protein cấu trúc và không cấu trúc [22], [23]. Bộ gen của HCV
được chia làm 2 vùng.
•

Vùng cấu trúc ở đầu 5’không mã hoá (5’UTR-untranslated region hay
5’NC=noncodingregion) gồm 341 - 344 nucleotid [2], [24], [25]. Đây là vùng
tương đối ít bị biến đổi nhất giữa các phân týp (subtype) khác nhau. Do đó,
người ta sử dụng vùng này để phát hiện RNA của virus HCV bằng kỹ thuật
PCR. Vùng này gồm các gen C, E1,E2, P7 là các gen mã hóa cho các protein
cấu trúc của virus. Gen C mã hóa cho P19, chúng được gắn với ARN hình thành
nên nucleocapsid (lõi). Gen E1 và E2 mã hóa cho glycoprotein gp 33 và gp 72

•


14

tiền thể tạo ra sẽ được phân cắt bởi enzyme tín hiệu (signalase) để tạo ra các
protein cấu trúc (C, E1, E2) và các protein không cấu trúc (NS1- NS5).
Sau khi HCV tạo ra reverse transcriptase của nó thì enzyme này bắt đầu
phiên mã ngược để tạo ra mạch RNA sợi (-) bổ sung với sợi (+) đã có. Chính
sợi RNA (-) này là khuôn để tạo ra RNA genome của HCV ((+) ssRNA).
(Hình1.3 ) Sau đó, capsomer được tạo ra từ các protein thành phần như C, E1,
E2 sẽ kết hợp với RNA genome của HCV ((+)ssRNA) để tạo thành dạng
nucleocapsid. Nucleocapsid này tiến đến tương tác với màng tế bào để thoát
ra ngoài, trở thànhdạng virus hoàn chỉnh và đi xâm nhiễm tế bào khác.

Hình 1.4. Chu kỳ sống của HCV

1.3.Triệu chứng lâm sàng


15

1.3.1. Giai đoạn cấp tính
Bệnh nhân nhiễm HCV ở giai đoạn cấp tính thường không có biểu hiện
bệnh lý hoặc chỉ có những biểu hiện nhẹ (rất khó nhận biết trên lâm sàng).
Khoảng 60-70% bệnh nhân nhiễm không biểu hiện triệu chứng, 20-30% có
thể có biểu hiện vàng da, 10% các bệnh nhân thể hiện một số triệu chứng
không đặc hiệu như: mệt mỏi, đau bụng…
Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân ở giai đoạn nhiễm HCV cấp tính
tương tự như các bệnh nhân nhiễm virus gây bệnh khác ở gan. Do vậy, việc
xét nghiệm các bệnh nhân này bằng các kỹ thuật miễn dịch là điều cần thiết
để xác định bệnh nhân nhiễm loại virus viêm gan nào. Tuy nhiên, các kỹ thuật
miễn dịch này chỉ có kết quả tốt (80%) sau 15 tuần kể từ khi có những biểu

trị.)....thì các xét nghiệm phát hiện HCV hoặc kháng thể đặc hiệu giữ một vai
trò rất quan trọng [13], [36].
1.4.1. Phương pháp gián tiếp tìm kháng thể anti-HCV
Anti-HCV: Có thể tìm thấy ở 70% trường hợp khi bắt đầu có triệu
chứng và khoảng 90% trong vòng 3 tháng sau. Tuy nhiên, nhiều người bị
viêm gan C nhưng không có triệu chứng. Anti - HCV không cho biết bệnh
nhân đang nhiễm HCV cấp tính, đã lành bệnh (đào thải hết virus) hay chuyển


17

sang giai đoạn mãn tính. Tìm kháng thể anti - HCV có thể sử dụng các kỹ
thuật như miễn dịch điện hoá phát quang hoặc kỹ thuật miễn dịch ELISA.
1.4.2. Phương pháp trực tiếp tìm HCV RNA bằng kỹ thuật RT- PCR
HCV RNA: phát hiện trực tiếp virus trong máu, một bằng chứng của
nhiễm HCV và chứng tỏ virus đang tăng sinh. Để phát hiện HCV bằng kỹ
thuật PCR thì cần chuyển RNA thành cDNA nhờ các enzyme phiên mã ngược
RT (Reverse Transcriptase). Sau đó dùng một đoạn DNA đặc hiệu làm mồi để
xác định DNA đích và khuyếch đại đoạn DNA đích lên nhiều lần. Có thể phát
hiện HCV-RNA trong vòng 2 đến 3 tuần sau khi nhiễm virus [15]. Ưu điểm
của phương pháp RT- PCR có độ nhạy cao, trong điều kiện tối ưu chỉ cần có
100 bản sao/1ml huyết thanh có thể phát hiện được bằng phương pháp này.
Kỹ thuật này tương đối phức tạp, đắt tiền, chỉ thực hiện được trong phòng thí
nghiệm tiêu chuẩn [37], [38], [39].
1.4.3. Phương pháp định lượng RNA-HCV trong huyết thanh
1.4.3.1. Kỹ thuật Real-Time PCR
Real-time PCR cũng dựa trên PCR thường, nhưng phương pháp này có
thể định lượng được hàm lượng DNA/RNA có trong mẫu nhờ các chất nhuộm
phát huỳnh quang được gắn vào DNA mạch kép hoặc dùng mẫu dò DNA
oligonucleotid được biến đổi để phát huỳnh quang khi lai với DNA bổ trợ sau

hợp kháng thể kháng digoxigenin-alkaline phosphatase được cho vào và ủ
trong một thời gian thích hợp, phần dư thừa sẽ được loại bỏ. Phản ứng màu sẽ
xuất hiện khi cơ chất hiện màu của alkaline phosphatase được cho vào. Cường
độ màu tương ứng với hàm lượng sản phẩm PCR có trong mẫu.
Việc định lượng HCV RNA có trong mẫu được thực hiện bằng cách
quy giá trị cường độ màu ở mỗi vi giếng vào một đường chuẩn xây dựng từ
những mẫu có nồng độ HCV RNA biết trước. Phương pháp này có khả năng
phát hiện HCV với nồng độ là 600 IU/ml. Độ tuyến tính của phương pháp
nằm trong khoảng 600 IU/ml đến 850.000 IU/ml.


19

Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt
cũng như lượng KN trong mẫu nghiên cứu. Nhưng phương pháp này rất hạn
chế do KN không đặc hiệu sẽ ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.
1.4.3.3. Phương pháp khuyếch đại tín hiệu
Là phương pháp phát hiện và định lượng RNA bằng kỹ thuật lai và
khuếch đại tín hiệu. Bộ gen virus lúc đầu được lai vào một giá, thì các bộ dò
oligonucleotide liên kết/bắt cặp đặc hiệu, sau đó tín hiệu phát ra bởi các phân
tử lai được khuếch đại và đo lường. Có hai kỹ thuật hay sử dụng:
+ Kỹ thuật DNA nhánh (Branched DNA technology).
+ Phương pháp bắt giữ lai (hybrid capture).
•

Kỹ thuật DNA nhánh-bDNA (Branched DNA technology)
Phản ứng bDNA dựa trên khuyếch đại tín hiệu. Đây cũng là kỹ thuật lựa
chọn để đo lường hàm lượng virus ở bệnh nhân viêm gan mạn tính. Trong kỹ
thuật này HCV RNA được bắt giữ trong một cái giếng, lai tạo bằng chất dò
tổng hợp nucleotide bổ sung cho chuỗi hoạt động ở phút thứ 5 trong vùng

trong mẫu ban đầu.
1.4.4. Các phương pháp xác định kiểu gen
a. RT-PCR:
Kỹ thuật PCR phiên mã ngược được phát triển và ứng dụng đối với các
virus có vật liệu di truyền là RNA từ những năm 1990. Đây là kỹ thuật xác
định nhanh, nhạy, đặc hiệu cho từng type huyết thanh. Tuy nhiên do độ nhạy
cao nên rất dễ xảy ra dương tính giả nếu không kiểm soát được tạp nhiễm của
các tác nhân ngoại lai.
b. Realtime RT-PCR:
Đây là kỹ thuật sử dụng cặp mồi và đầu dò đặc hiệu cho từng kiểu gen,
sử dụng tín hiệu huỳnh quang để phát hiện các sản phẩm phản ứng theo thời
gian thực mà không cần điện di. Nhiều thử nghiệm realtime RT-PCR đã được
phát triển sử dụng kỹ thuật TaqMan và SYBR Green [24].
c. Kỹ thuật LiPA:
Là kỹ thuật lai trên vạch dò đặc hiệu, sản phẩm PCR được khuếch đại
với cặp mồi trong đó có một mồi gắn biotin. Lai sản phẩm PCR gắn biotin trên
các vạch đoạn dò kiểu gen đặc hiệu, sau đó tiến hành lai sản phẩm PCR đã có


21

với các que (strip) của bộ thuốc thử LiPA. Trên mỗi strip có gắn sẵn các vạch
dò (probe) chuyên biệt cho từng kiểu gen của HCV. Tuy nhiên, vì LiPA phải
thực hiện trên sản phẩm PCR là kết quả của phản ứng nested PCR nên khả
năng bị ngoại nhiễm là khá cao và đây chính là lí do giải thích được tại sao có
khá nhiều trường hợp LiPA có kết quả không thể xác định được kiểu gen [2].
d. Kỹ thuật giải trình tự gen (sequencing): Đây là kỹ thuật chuẩn xác
nhất, kiểm soát được các sai sót, đảm bảo độ chính xác cao, khắc phục được
các nhược điểm của các kỹ thuật trên trong xác định kiểu gen.
Có nhiều phương pháp giải trình tự gen như : giải trình tự bằng phương

đã giảm đi đáng kể [42]. Dùng kim chích xăm mình hoặc xỏ lỗ tai không đảm
bảo vô trùng cũng có khả năng lây truyền HCV [43]. Dùng chung các vật
dụng cá nhân như dao cạo, bàn cải đánh răng, đồ cắt móng tay, tuy ít nguy cơ
nhưng vẫn có thể làm lây nhiễm bệnh. Tỷ lệ HCV lây truyền qua đường tình
dục ít khoảng 5 %, thấp hơn HBV (10 - 15%) và HIV (30%) [44]. Các nhân
viên y tế cũng có nguy cơ nhiễm bệnh vì những tai nạn nghề nghiệp như bị
kim đâm hoặc trong những trường hợp không thể tránh được có thể tiếp xúc
trực tiếp với máu của người mang bệnh.
Có 1- 5 % các bà mẹ bị nhiễm HCV có thể truyền bệnh cho con vào lúc
trước hoặc sau khi sinh. Sự lây truyền này tùy thuộc vào mức độ HCV có
trong máu của người mẹ. Phụ nữ có thai đồng nhiễm HCV và HIV thì khả
năng lây truyền từ mẹ sang con sẽ cao hơn 2 đến 3 lần [15]. Tuy nhiên, 3040% các trường hợp bị nhiễm là không rõ nguyên nhân.
1.5.2. Các biện pháp phòng bệnh
Khác với HAV và HBV hiện nay HCV vẫn chưa có thuốc chủng ngừa
[45], [46]. Ngay cả những hy vọng về một loại vắc xin phòng bệnh này trong
tương lai cũng chưa có nhiều hi vọng. Vì 3 lý do sau:


23

+ Thứ nhất: Virus viêm gan C có khả năng thay đổi. Điều này chẳng
những gây khó khăn cho hệ thống miễn dịch trong việc phát hiện và đối phó
với chúng, mà còn là nguyên nhân khiến cho việc tìm ra vắc xin phòng bệnh
trở nên khó khăn.
+ Thứ hai: do HCV không gây nhiễm và gây bệnh với bất cứ loài động
vật nào khác ngoài người và một loài tinh tinh (chimpanzee). Vì thế, việc
nghiên cứu thử nghiệm rất khó khăn.
+ Cuối cùng: Khả năng sao chép của HCV trong điều kiện phòng thí
nghiệm rất yếu ớt.
Do vậy, việc phòng ngừa bệnh viêm gan c hiện nay chủ yếu là tập trung

thành phố Hồ Chí Minh nghiên cứu và xác định kiểu gen HCV của 327 bệnh
nhân viêm gan C cho thấy kiểu gen 1 chiếm 58,4%, kiểu gen 6 chiếm 23,9%
và kiểu gen 2 chiếm 13,1% [49].
Năm 2010, Tomoaki Tanimoto cùng cộng sự đã nghiên cứu 486 trường
hợp nhiễm HCV trên nhóm tiêm chích ma tuý tại Hải Phòng. Kết quả cho
thấy tại vị trí 5’UTR-core kiểu gen 6e chiếm ưu thế 32,5%, tại vị trí NS5B
kiểu gen 1a chiếm ưu thế 42,6% [50].
Trong nghiên cứu của mình vào năm 2011, nhóm tác giả Phan Quốc
Việt và cộng sự đã nghiên cứu và xác định kiểu gen của 50 trường hợp viêm
gan C tại bệnh viện Bạch mai và Trung tâm chẩn đoán y khoa Medic cho kết
quả tại vùng 5’NC có 56% là kiểu gen 1;1,14% có kiểu gen 2 và 30% kiểu
gen 6 [51].
Nghiên cứu của tác giả Đông Thị Hoài An và các cộng sự (2013) đã sử
dụng vùng 5’-UTR- core để xác định kiểu gen của virus viêm gan C ở 710
bệnh nhân Việt Nam và Campuchia cho thấy ở người Việt Nam và Campuchia
thì tỷ lệ kiểu gen 6 cao nhất (48,81% và 44,79%) sau đó đến kiểu gen 1
(30,56% và 41,66%) cuối cùng là kiểu gen 2 với tỷ lệ tương ứng là 14,45% và
9,02% [52].


25

Gần đây nhất vào năm 2014 trong nghiên cứu của tác giả Phạm Thị Thu
Thủy và cộng sự tại trung tâm y khoa Medic trên 3 nhóm bệnh nhân xác định
kiểu gen bằng 2 vùng giải trình tự khác nhau là 5’NC và NS5B cho thấy rằng
khi xác định kiểu gen trên đoạn 5’NC thì tỷ lệ lẫn kiểu gen 6 vào kiểu gen 1
khi xác định trên đoạn gen NS5B là 19,8% [53].
Tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, chưa có một nghiên cứu
nào đánh giá tổng thể tỷ lệ nhiễm, tải lượng virus và các genotype của
HCV ở các bệnh nhân đến khám và điều trị tại bệnh viện kể từ khi bệnh