BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH
TRÍCH LY TINH DẦU TỪ CÂY NGẢI CỨU (ARTEMISIA
VULGARIS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT LÔI CUỐN
HƠI NƯỚC, XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO
SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

Ngành:

Công nghệ sinh học

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn : TS. Trịnh Thị Lan Anh
Sinh viên thực hiện

: Phan Phú Thắng

MSSV: 1411100415

Lớp: 14DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2018


CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của riêng

đề tài em không tránh khỏi những sai sót, kính mong nhận được những ý kiến
đóng góp từ cô cũng như quý thầy, cô, anh, chị.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Công Nghệ
TP.HCM, đã tạo điều kiện giúp em có cơ hội học tập nâng cao kĩ năng của bản
thân. Chúc Trường Đại học Công Nghệ TP.HCM phát triển và ngày càng trở
thành nơi tin cậy của nhiều sinh viên.
TP.HCM, ngày 31 tháng 07 năm 2018
Sinh viên thực hiện
Phan Phú Thắng
ii


MỤC LỤC
CAM ĐOAN ................................................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. ii
MỤC LỤC .................................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................................ viii
DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... x
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................... 7
1.1. Giới thiệu về Ngải cứu ......................................................................................... 7
1.1.1 Vị trí phân loại ..................................................................................................... 7
1.1.2. Giới thiệu về họ Cúc (Asteraceae) và chi ngải (Artemisia) ................................ 7
1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố .............................................................................. 8
1.1.4. Công dụng và dược lý của Ngải cứu ................................................................... 10
1.2. Giới thiệu về tinh dầu .......................................................................................... 11
1.2.1. Khái niệm về tinh dầu ......................................................................................... 11
1.2.2. Phân bố tinh dầu trong thiên nhiên ..................................................................... 12
1.2.3. Quá trình tích luỹ tinh dầu .................................................................................. 12

1.6.2. Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu tần dày lá .............................. 41
1.7. Sắc ký khí ghép khối phổ và một số ứng dụng (GC-MS/Gas
Chromatography Mass Spectometry) ............................................................... 42
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ....................................................... 48
2.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài ................................................................ 48
2.1.1. Địa điểm tiến hành đề tài ..................................................................................... 48
2.1.2. Thời gian thực hiện .............................................................................................. 48
2.2. Vật liệu ................................................................................................................... 48
2.2.1 Nguyên liệu ........................................................................................................... 48
2.2.2 Dụng cụ, thiết bị .................................................................................................... 49
2.2.3. Hóa chất .............................................................................................................. 50
2.3. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................... 51
2.3.1. Tiến hành trích ly tinh dầu và khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ............................. 52
2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu
thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .................................... 53
iv


2.3.3. Xác định chỉ số vật lý, hóa học của tinh dầu Ngải cứu ........................................ 58
2.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt lực kháng khuẩn ...................................................... 62
2.4. Thống kê và xử lý số liệu ...................................................................................... 64
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 65
3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu
được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .................................... 65
3.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (để nguyên, cắt
nhỏ, xay nhuyễn) đến hàm lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp
chưng cất lôi cuốn hơi nước .................................................................................. 65
3.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của tuổi nguyên liệu (lá non, lá già) đến hàm
lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ........... 67
3.1.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl bổ sung vào

phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ............................................................ 89
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................. 92
4.1. Kết luận .................................................................................................................. 92
4.2. Kiến nghị ................................................................................................................ 93
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 94
PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DMSO:

Dimethyl sulfoxyde

DNA :

Deoxyribonucleic Acid

E.Coli :

Escherichia coli

GC

:

Gas chromatography


TCVN :

Tiêu chuẩn Việt Nam

TCVS :

Tiêu chuẩn vi sinh

TSA :

Trypticase Soy Agar

TSB :

Trypticase Soy Broth

vii


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hình ảnh cây Ngải cứu (Artemisia Vulgaris) ......................................... 7
Hình 1.2. Một số cây thuộc chi Ngải ..................................................................... 8
Hình 1.3. Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.) ................................................... 9
Hình 1.4. Cấu trúc 3D phân tử camphor ............................................................. 14
Hình 1.5. Cấu trúc 3D phân tử eucalyptol ........................................................... 15
Hình 1.7. Cấu trúc 3D phân tử α-pinene ............................................................. 15
Hình 1.6. Cấu trúc phân tử β-eudesmol............................................................... 16
Hình 1.8. Cấu trúc 3D phân tử Terpene-4-ol ...................................................... 16
Hình 1.9. Máy ép tinh dầu ................................................................................... 19
Hình 1.10. Hệ thống chưng cất lôi cuốn hơi nước .............................................. 20

Hình 3.5. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng tinh
dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước ............ 71
Hình 3.6. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian để héo nguyên liệu đến hàm
lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .......... 72
Hình 3.7. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng nước chưng cất đến hàm
lượng tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước .......... 73
Hình 3.8. Tinh dầu Ngải cứu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi
nước ...................................................................................................................... 73
Hình 3.9. Kết quả kháng E.coli ........................................................................... 78
Hình 3.10. Kết quả kháng Staphylococcus aureus .............................................. 79
Hình 3.11. Kết quả kháng Salmonella ................................................................. 80
Hình 3.12. Kết quả kháng Shigella boydii........................................................... 81

ix


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm
lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. ...................................................................... 65
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu
Ngải cứu thu được ................................................................................................ 66
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch NaCl đến hàm
lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. ...................................................................... 67
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm nguyên liệu trong
dung dịch NaCl đến hàm lượng tinh dầu Ngải cứu thu được. ............................. 68
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chưng cất đến hàm lượng
tinh dầu Ngải cứu thu được. ................................................................................. 70
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của độ héo nguyên liệu đến hàm lượng
tinh dầu Ngải cứu thu được. ................................................................................. 71
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lượng nước chưng đến hàm lượng

hậu và thổ nhưỡng của Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới ẩm gió mùa nên hệ
thực vật phong phú và đa dạng, đó là nguyên nhân tạo nên nguồn tài nguyên sinh
học quý giá, thuộc loại tài nguyên tái tạo được với nhiều cây thuốc quý đầy đủ
chủng loại và số lượng. Nhưng nhiều năm trở lại đây, có một số nhận định từ một
số nhà khoa học, bác sĩ: “Người Việt ra ngõ gặp cây thuốc, nhưng lại chết trên
đống thuốc”, phải chăng nhận định này đang ám chỉ cho chúng ta: “Tại sao
không chịu tìm hiểu và học cách sử dụng những cây thảo dược để chữa bệnh?”
Trong quá trình nghiên cứu kháng sinh thực vật, người ta đặc biệt quan
tâm đến tinh dầu. Tinh dầu có nhiều đặc tính sinh học và dược học cao, có khả
năng kháng khuẩn, kháng nấm và được sử dụng trong việc tạo ra một số loại chế
phẩm để làm thuốc.
Trong rất nhiều loài thực vật có thể chiết xuất tinh dầu như chanh, sả, quế,
bạc hà,… thì Ngải cứu cũng là một nguyên liệu rất được quan tâm và cần phải đề
cập đến.
1


1.2. Tầm quan trọng của đề tài
Ngải cứu còn có tên thuốc cứu, ngải diệp, nhả ngải, quá sú, cỏ linh li, tên
khoa học Artemisia vulgaris, là một loài thực vật thuộc họ Cúc có sẵn, dễ tìm,
thu hoạch quanh năm và có tiềm năng to lớn để sản xuất tinh dầu và kháng sinh
tự nhiên.
Từ lâu, Ngải cứu được biết đến qua nhiều bài thuốc trong dân gian với
các công dụng đặc trưng như bổ huyết, điều kinh hay trong cuộc sống thường
ngày Ngải cứu được dùng để nấu canh, làm rau sống ăn kèm để tăng thêm khẩu
vị.
Đặc biệt việc nghiên cứu tách chiết các hợp chất có dược tính từ tinh dầu
Ngải cứu và thử hoạt tính sinh học là vấn đề mới mẻ, chưa được quan tâm và
nghiên cứu nhiều. Tinh dầu được sản xuất từ thân, lá cây bằng nhiều phương
pháp: phương pháp cơ học, phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi và

đa dạng tập trung ở các bộ phận khác nhau của cây như cụm hoa, lá và cây chứa
tinh dầu, flavonoid, phenolic,… Bên cạnh đó, Ngải cứu có tác dụng chống oxy
hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, gây độc tế bào ung thư, dùng trong bệnh lý về
huyết áp, hen suyễn và có tác dụng bảo vệ gan.
Trong y học hiện đại, Ngải cứu được sử dụng trong hỗ trợ cân bằng hệ
probiotic trong đường ruột, giúp làm giảm táo bón, loại bỏ giun và ký sinh trùng
đường ruột.
Ngoài ra một số hoạt chất trong Ngải cứu còn giúp kháng viêm và đặc biệt
qua nhiều nghiên cứu đã chỉ ra trong Ngải cứu có chứa hoạt chất artemisinin có
tác dụng chữa sốt rét
Đối với Đông Y
Trong Đông y Ngải cứu có tính hơi hàn, vị cay, dùng làm thuốc ôn khí
huyết, trục hàn thấp, điều kinh, an thai, dùng chữa đau bụng do hàn, kinh nguyệt
không đều, thai động không yên, thổ huyết, máu cam.
Ý nghĩa trong thực phẩm - mỹ phẩm
Xay nhuyễn thành bột để làm bột gia vị như ngũ vị hương, hồi, quế…
Làm se da, sáng da, tẩy tế bào chết và kháng khuẩn, kháng nấm, giảm
thâm nám.
Được sử dụng như nguyên liệu của một số món ăn phổ biến ở miền Bắc
Việt Nam như: Trứng rán Ngải cứu, bánh ngải,…
3


2. Tình hình nghiên cứu
Hiện nay, các nghiên cứu về tinh dầu Ngải cứu còn ít, chủ yếu tập trung
vào phân tích thành phần hóa học, dược tính, hoạt tính trong dịch chiết Ngải cứu
hoặc phối chế với các loại dược liệu, thực vật khác.
Theo Đỗ Tất Lợi (2004), trong ngải cứu có tinh dầu, ít tannin, thành phần
chủ yếu trong tinh dầu ngải cứu là cineole và α-thujone. Tinh dầu Ngải cứu có
tính chất làm kích thích cho say do α-thujone có tác dụng hưng phấn, nhưng lại

 Xác định được thành phần hóa học của tinh dầu Ngải cứu ở TP HCM.
 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu đối với các chủng
vi sinh vật (Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureaus, E.coli,
Shigella boydii).
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
 Nghiên cứu cơ sở lý luận và thực tiễn của đề tài.
 Tiến hành thực nghiệm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thu
nhận tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.
 Định danh và định lượng các thành phần hóa học của tinh dầu Ngải cứu
bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS).
 Kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu Ngải cứu bằng phương
pháp khuyết tán trên đĩa thạch.
5. Phương pháp nghiên cứu
 Nghiên cứu lý thuyết: thu thập, phân tích, tổng hợp tài liệu.
 Phương pháp tách chiết tinh dầu: phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi
nước trực tiếp sử dụng bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clevenger.
 Phương pháp sinh hóa: thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu
trên các chủng vi khuẩn : Salmonella typhimurium, Staphylococcus
aureus, E.coli, Shigella boydii.
 Xử lý số liệu bằng phần mềm SAS 9.1 và Excel 2016 ®.
6. Các kết quả đạt được của đề tài
 Tối ưu hóa quy trình trích ly tinh dầu Ngải cứu bằng phương pháp chưng
cất lôi cuốn hơi nước.
 Định danh và định lượng thành phần hóa học có trong tinh dầu Ngải cứu
thu được bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS.
5


 Thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Ngải cứu trên các chủng vi
khuẩn: Salmonella typhimuirium, Staphylococcus aureus, E.coli, Shigella


:

Angiospermae

Lớp (class)

:

Eudicot

Phân lớp (subclass) :

Asterids

Bộ (ordo)

:

Asterales

Họ (familia)

:

Asteraceae

Chi (genus)

:

có bốn loài thuộc chi ngải là ngải thanh cao (A. carvifolia), ngải hoa vàng (A.
annua), ngải đắng (A. absinthium) và Ngải cứu (A. vulgaris).

Hình 1.2. Một số cây thuộc chi Ngải
a. Ngải Thanh Cao (A. carvifolia)
b. Ngải Hoa Vàng (A. annua)
c. Ngải Đắng (A. absinthium)
d. Ngải cứu (A. vulgaris)
1.1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố
Ngải cứu còn gọi là cây thuốc cứu, cây thuốc cao, ngải điệp. Tên khoa
học: Artemisia vulgaris L., thuộc họ Cúc (Asteraceae).
8


Hình 1.3 Cây Ngải cứu (Artemisia vulgaris L.)
Thân: là cây thân cỏ, sống lâu năm, cao khoảng 1 m. Thân thẳng có rãnh
dọc màu tía nhạt, cành non có lông.
Lá: lá xẻ nhiều kiểu từ xẻ lông chim đến xẻ thùy theo đường gân lá, mặt
trên nhẵn màu nâu đậm, mặt dưới trắng xanh do có nhiều lông màu trắng, lá mọc
so le, không có cuống (nhưng phía dưới thường có cuống), vò nát có mùi hắc, vị
đắng.
Hoa: thường có vào tháng 7 – 9, hoa có màu vàng lục nhạt hoặc màu đỏ
nhạt, mọc thành chùy kép, dài từ 2 – 10 cm, đứng ở nách lá, mỗi hoa hình đầu
rộng từ 3 – 4 mm bao gồm 2 loại hoa hình ống: hoa cái và hoa lưỡng tính.
Quả bế không có mào lông. Ngải cứu là cây của miền Âu, Á ôn đới. Cây
phát triển trên vùng có nhiều cỏ dại, ở những vùng đất giàu nitơ như vùng bỏ
hoang nơi có nhiều ánh nắng, vùng đất không canh tác, ven đường và trên các bờ
dậu. Mọc hoang ở nhiều nơi trong nước ta và cũng mọc ở nhiều nước khác. Cây
cũng được trồng nhiều nơi trên qui mô nhỏ ở các vườn thuốc vườn gia đình từ
vùng thấp đến vùng cao.

nói nổi tiếng "Mùa hè chữa bệnh mùa Đông", với ý rằng, mùa nóng không chỉ
cần chăm sóc sức khỏe tốt để vượt qua thời tiết, mà còn phải chăm chỉ dưỡng
sinh để chuẩn bị sức khỏe cho mùa đông lạnh giá, khắc nghiệt hơn
10


Một trong những giải pháp phòng chữa bệnh nổi tiếng của Đông y đó
chính là ngâm chân. Có lẽ không cần nhấn mạnh thì hầu như chúng ta đều biết
tác dụng của việc ngâm chân đối với sức khỏe.
Quan trọng hơn, việc ngâm chân với lá Ngải cứu – thứ lá quen thuộc, phổ
biến và dễ dàng mua được còn mang lại nhiều tác dụng hơn những gì xưa nay
chúng ta vẫn nghĩ.
Lá Ngải cứu còn được Đông y gọi là Ngải khao, vốn chỉ là một loài rau
dại nhưng sau đó được nghiên cứu và sử dụng như một loại dược liệu quý, được
gọi là "rau của bậc Danh y". Ngải cứu được người dân Châu Á sử dụng phổ biến
trong đời sống hàng ngày.
Theo Đông y, Ngải cứu có vị đắng, cay, ấm, khi ăn sẽ tác động chính vào
3 kinh mạch là tỳ, gan và thận. Nghiên cứu cho thấy lá Ngải cứu có thể làm giảm
hàn trừ ẩm, ấm kinh và cầm máu. Rất phù hợp dùng cho những người hay bị mất
máu, đau bụng, đau bụng kinh, tử cung chảy máu, các bệnh phụ khoa khác.
1.2. Giới thiệu về tinh dầu
1.2.1. Khái niệm về tinh dầu
Tinh dầu là hỗn hợp các chất hữu cơ tan lẫn vào nhau, có mùi đặc trưng
tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu cung cấp tinh dầu. Cần phân biệt rõ tinh
dầu với dầu béo (hỗn hợp các triglicerid) và dầu mỏ (hỗn hợp các hydrocarbon).
Rất khó khăn khi có một định nghĩa tuyệt đối chính xác cho tinh dầu. Về mặt
thực hành, tinh dầu có thể như “một hỗn hợp thiên nhiên có mùi, phần lớn có
nguồn gốc từ thực vật”. Tinh dầu thường là thể lỏng ở nhiệt độ phòng, bay hơi
hoàn toàn mà không bị phân hủy.
Trong thiên nhiên, rất nhiều tinh dầu ở trạng thái tự do, chỉ có một số ít

thường năm bên dưới biểu bì. Thường có ở vỏ quả các giống Citrus,
Eucalyptus,...
Ống tiết: cách tạo ra tinh dầu cũng như túi tiết nhưng nằm sâu bên trong
phần gỗ và chạy dài theo sớ gỗ, bắt gặp trong các giống Dipterocarpi,
Artemisia,...
Về phần phân bố lượng tinh dầu, đặc biệt có nhiều trong họ Long não, họ
Hoa môi, Họ Cam, Họ Sim, họ Hoa tán.

12


Tinh dầu có trong các bộ phận khác nhau của cây: như ở hoa (hoa hồng,
hoa nhài, cam, chanh,...); ở lá (Bạch đàn, Bạc hà, Hương nhu, Tần dầy lá,...); ở
vỏ cây (Quế); ở thân cây (Hương đàn, Peru, Sả,...); ở rễ (Hương bài, Gừng,
Nghệ, Xuyên khung,...) (Nguyễn Thị Hồng Liên, 2014).
1.2.4. Tính chất vật lý của tinh dầu
Ở nhiệt độ thường, tinh dầu ở thể lỏng, trừ một số trường hợp như
menthol, camphor,... là ở thể rắn.
Tinh dầu gần như không tan trong nước và dễ bay hơi, do vậy có thể tách
thu tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. Tinh dầu rất ít tan
trong nước, tan tốt trong cồn và các dung môi hữu cơ, các loại dầu mỡ, có thể tan
một phần trong dung dịch kiềm,...
Đa số tinh dầu không có màu hoặc màu vàng nhạt, một số tinh dầu có màu
như: tinh dầu Quế có màu nâu sẫm, tinh dầu Xạ hương màu đỏ, tinh dầu Ngải
cứu màu vàng lục. Tinh dầu thường có vị cay và hắc.
Tỷ trọng của tinh dầu thường vào khoảng 0,85 – 0,95; có một số tinh dầu
nặng hơn nước như tinh dầu Đinh hương, tinh dầu Quế. Tỷ trọng thay đổi theo
thành phần hóa học. Nếu tinh dầu có thành phần chủ yếu là hydrocarbon terpenic
thì tỷ trọng thấp, tinh dầu có hợp chất chứa oxy hoặc nhân thơm thì tỷ trọng cao
hơn.

Hình 1.4. Cấu trúc 3D phân tử camphor
1,8-cineole
1,8-cineole hay còn được biết đến dưới tên gọi eucalyptol là một hợp chất
hữu cơ tự nhiên, trong điều kiện nhiệt độ phòng là một chất lỏng không màu.
Đây là thành phần chủ đạo của tinh dầu bạch đàn Eucalyptus globulus, chiếm tới
90% trong dầu bạch đàn. Ngoài ra Eucalyptol còn được tìm thấy trong Long não,
Ngải cứu, Húng quế, Hương thảo và một số loài thực vật lá có hương thơm khác.
Eucalyptol được ứng dụng trong nhiều loại nước súc miệng và thuốc ho, ngoài ra
còn được sử dụng như là thuốc trừ sâu và thuốc xua đuổi côn trùng. Ở liều lượng
14