BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ XUÂN DƢƠNG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÊN KHOA HỌC, QUY TRÌNH
NHÂN GỐNG IN VITRO VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA
TINH DẦU CÂY GỪNG BẢN ĐỊA Ở BẮC KẠN (GỪNG ĐÁ)
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Mã số
: 9.42.02.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI - 2019


Công trình đƣợc hoàn thành tại:
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. Đặng Trọng Lƣơng
2. TS. Đỗ Tuấn Khiêm

Phản biện 1:…………………………………………..

Phản biện 2: …………………………………………..


học trong Quyết định số 80/2005/QĐ-BNN là “Zingiber sp.”.
Nhằm tạo cơ sở dữ liệu về đặc điểm sinh học phục vụ cho công tác
định danh, bước đầu xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của
tinh dầu thu được từ cây gừng bản địa ở Bắc Kạn, đồng thời xây dựng quy
trình nhân nhanh từ lát cắt chồi, áp dụng vào việc tạo nguồn giống sạch
bệnh cung cấp cho người dân, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xác
định tên khoa học, quy trình nhân giống in vitro và hoạt tính sinh học
của tinh dầu cây gừng bản địa ở Bắc Kạn (Gừng đá)”.
2. Mục tiêu của luận án
Xác định loài, đặc điểm sinh học, thành phần hóa học, hoạt tính
sinh học tinh dầu và xây dựng quy trình kỹ thuật nhân giống bằng công
1


nghệ nuôi cấy mô từ lát cắt chồi góp phần bảo tồn và phát triển nguồn
gen gừng bản địa Bắc Kạn.
3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Cung cấp các dẫn liệu khoa học về đặc điểm sinh học và khả năng
nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô của loài gừng Bắc Kạn, là cơ sở
để bảo tồn và phát triển nguồn gen có giá trị;
Kết quả luận án là tà liệu tham khảo cho nghiên cứu và đào tạo.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài góp phần làm sáng tỏ vị trí phân loại của cây
gừng Bắc Kạn từ đó mở ra các hướng cho các nghiên cứu tiếp theo;
Quy trình nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào được áp
dụng vào thực tiễn tạo ra số lượng lớn cây giống đồng đều, sạch bệnh,
tạo điều kiện thuận lợi cho việc mở rộng quy mô phát triển loài gừng
Bắc Kạn, góp phần xóa đói giảm nghèo cho đồng bào miền núi.
4. Những đóng góp của luận án

của chúng trong họ Gừng dựa vào phân tích đặc điểm hình thái và ứng
dụng công nghệ sinh học giải trình tự

vùng ITS-rADN (Internal

transcribed spacer) và vùng gen matK (gen mã hóa cho maturaseK).
Trong đó các nghiên cứu của Kress et al., (2002, 2005) được phân tích
làm cơ sở cho nghiên cứu này.
Phân tích các kết quả đã đạt được trong việc ứng dụng công nghệ
nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống cây họ gừng trên Thế giới và ở Việt
Nam. Trong đó tập trung phân tích nghiên cứu của Trịnh Thị Thanh
Hương và cộng sự (2014) là cơ sở để thực hiện nghiên cứu này.
Phần tổng quan tài liệu cũng đề cập tới một số công trình nghiên
cứu về thành phần hóa học tinh dầu của các cây thuộc họ gừng, qua đó
cho thấy, các nghiên cứu về tinh dầu cây họ gừng còn chưa nhiều, đặc
biệt đối với các loài phân bố trong tự nhiên và gần như chưa có nghiên
cứu về thành phần hóa học tinh dầu cây nuôi cấy mô so với cây mọc tự
3


nhiên. Do đó cần có các nghiên cứu một cách có hệ thống để đánh giá
ảnh hưởng của việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy
mô đến thành phần hóa học trong tinh dầu, từ đó có các giải pháp nhằm
khai thác và sử dụng cây có tinh dầu hiệu quả.
CHƢƠNG 2
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Cây gừng bản địa Bắc Kạn (Gừng đá)
- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện đối với các mẫu
gừng thu thập tại tỉnh Bắc Kạn. Đề tài tập trung xác định vị trí phân loại

2.4.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
2.4.2.2. Điện di kiểm tra kết quả tách chiết DNA tổng số
2.4.2.3. Kiểm tra chất lượng DNA trên gel agarose
2.4.2.4. Kiểm tra chất lượng DNA bằng máy đo quang phổ
2.4.2.5. Khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR
2.4.2.6. Giải trình tự sản phẩm PCR
2.4.2.7. Hiệu chỉnh trình tự
2.4.2.8. Xây dựng cây phát sinh loài
2.4.3. Phương pháp nuôi cấy mô
2.4.3.1. Nghiên cứu tạo mẫu sạch in vitro
2.4.3.2. Nghiên cứu tạo callus
2.4.3.3. Nghiên cứu tái sinh chồi từ callus
2.4.3.4. Nghiên cứu nhân nhanh chồi
2.4.3.5. Nghiên cứu tạo cây con hoàn chỉnh
2.4.3.6. Nghiên cứu chế độ luyện cây và giá thể ra ngôi
2.4.3.7. Nghiên cứu biến đổi sinh lý, hóa sinh cây in vitro giai đoạn ra ngôi
2.4.4. Đặc điểm sinh trưởng phát triển cây có nguồn gốc in vitro
2.4.5. Phương pháp phân tích sinh hóa

5


Chưng cất thu tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước. Việc
phân tích định tính được thực hiện trên hệ thống thiết bị sắc ký khí và
phổ ký liên hợp GC/MS của hãng Agilent Technologies HP 6890N.
2.4.6. Phương pháp phân tích hoạt tính kháng vi sinh vật
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá
khả năng kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên phiến vi
lượng 96 giếng theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck
(1991) và McKane & Kandel (1996).

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27

Tính trạng
Chiều cao cây

Tròn
Có
Ngắn (3-6 mm)
Hình mác - elip
Từ 13 - 16 cm
Từ 2,5 – 3,3 cm
Từ 3 – 5
Xanh đậm
Có
Có lông mi
Xanh đậm
Có
Mỗi năm 1 lần
Có 2 - 4 hoa
Dạng bông cụm
Nâu đỏ, vàng
Phân nhánh
Nhỏ (200g)
Đỏ nâu
Xám
Có màu vàng
150 – 300g
4 – 6 củ.
5 – 10cm
2 – 3cm
Dài >10 tháng


3.1.2. Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái.
3.1.2.1. Phân loại đến bậc chi

nghiệm sau này.
3.1.3.2. Phân tích các sản phẩm khuếch đại
Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR của cặp mồi matK có kích
thước khoảng 900bp, sản phẩm PCR của cặp mồi ITS có kích thước
khoảng 800bp phù hợp với kích thước lý thuyết.
3.1.3.3. Phân loại gừng Bắc Kạn dựa trên trình tự gen ITS
3.1.3.3.1. Kết quả giải trình tự gen ITS
Đã giải trình tự thành công 06 trình tự ITS mới và đăng ký trên
Genbank với các mã số: MN227653, MN227654, MN227655,
MN227656, MN227657 và MN227658 (Phụ lục 3).
Sau khi chỉnh sửa và loại bỏ tất cả các vị trí trống vùng gen ITS, các
mẫu gừng thu được có trình tự nucleotit vùng gen ITS tương đồng từ 99 100% và có chiều dài 698bp. Xuất hiện 02 vị trí nucleotit có sự sai khác
giữa các mẫu, vị trí nu số 597 trong khi các mẫu GD01LT, GD02LT và
GD01XD là nu loại T thì các mẫu còn lại GD03LT, GD02XD, GD03XD
lại là nu loại C; vị trí nu số 605 trong mẫu GD03LT là nu loại T thì các
mẫu còn lại là nu loại C. Sự sai khác giữa các nu ở các vị trí trên có thể cho
thấy có sự đa dạng về mặt di truyền giữa các cá thể gừng Bắc Kạn, đây là
cơ sở rất quan trọng để phục vụ cho nghiên cứu chọn dòng trội, lai tạo,
chọn giống có năng suất chất lượng cao.
Sáu trình tự gen ITS của các mẫu nghiên cứu được so sánh với các
trình tự ITS của chi Alpinia (taxid:94326) công bố trên NCBI bằng công cụ
Blast nucleotit. Kết quả cho thấy, các loài có trình tự ITS ở mức độ tương
đồng cao nhất với trình tự ITS của mẫu gừng Bắc Kạn bao gồm: Alpinia
chinensis (EU909426.1), Alpinia japonica (EU909427.1), Alpinia
officinarum (EU909422.1), Alpinia pumila , Alpinia nieuwenhuizii.
9


3.1.3.3.2. Xây dựng cây phân loại bằng trình tự gen ITS
Cây phân loại mẫu gừng Bắc Kạn bằng chỉ thị gen ITS (Hình 3.7)

giữa loài A. coriandriodora và các loài trong chi Alpinia dựa trên khối dữ
liệu kết hợp của vùng gen matK bằng phương pháp Maximum Likelihood
(hình 3.9). Sơ đồ hình cây cho thấy, các mẫu gừng Bắc Kạn cùng nhóm
với các loài: A. guinaensis, A. zerumbet, A. mutica, A. polyantha, A.
mutan, A. blepharocalyx, A. rugosa, A.calcarata, A. macrlure, A.
guangdongensis và A.japonica.
3.1.3.5. Phân loại gừng Bắc Kạn dựa trên trình tự kết hợp gen ITS và matK
Kết quả phát sinh loài từ cây phát sinh được xây dựng bằng khối
dữ liệu đơn như matK và ITS là tương đồng nhau, tuy nhiên chúng thể
hiện rằng kết quả từ khối dữ liệu đơn là không rõ ràng và mức ủng hộ
thấp. Do đó chúng tôi sử dụng cây phát sinh loài từ khối dữ liệu kết hợp
matK và ITS để xác định mối quan hệ phát sinh loài của chi Alpinia và
vị trí của loài Alpinia coriandriodora (Hình 3.10).
Kết quả phân tích dữ liệu phân tử kết hợp bằng phương pháp
maximum likelihood (ML) and Bayesian Inference (BI) đều ủng hộ
mạnh mẽ rằng Alpinia không phải là nhóm đơn phát sinh
(nonmonophyletic group) với chỉ số ủng hộ rất cao (BS: 100%, PP: 1.0)
(Hình 3.10). Cây phân loại đã phân biệt 06 nhánh riêng biệt của Alpinia,
kết quả này hoàn toàn tương đồng với nghiên cứu của Kress et al.,
(2005) [77]. Trong đó loài gừng Bắc Kạn (Alpinia coriandriodora) được
ghi nhận là một thành viên của chi Alpinia với vị trí phát sinh loài thuộc
nhánh thứ VI (Hình 3.10).
Kết quả phân tích cũng thể hiện rằng loài gừng Bắc Kạn (Alpinia
coriandriodora) có mối quan hệ rất gần gũi với một số thành viên
Alpinia ở nam Trung Quốc (Quảng Tây, Vân Nam, Quảng Đồng, Hải
Nam) như A. japonica, A. coriacea và A. guangdongensis… Kết quả
này thể hiện rằng A. coriandriodora có sự tương đồng về di truyền với
11



2,4D

Tỉ lệ tạo
callus (%)

Hình thái callus

0

0

32,22

Một số mẫu không tạo
được callus và bị hóa đen

CT8
CT9
CT10

0,5
0,5
0,5

1,0
2,0
3,0

34,44
44,44

Kết quả nghiên cứu cho thấy, môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/l
Vitamin B1 và 3,0 mg/l BAP là phù hợp để tái sinh chồi từ callus, tỷ lệ
bật chồi đạt 78,89%, hệ số tái sinh chồi đạt 9,71 chồi/callus.
13


3.2.4. Nhân chồi in vitro
3.2.4.1. Ảnh hưởng của BAP và Kin đến khả năng tái sinh và nhân
nhanh chồi in vitro
Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc sử dụng phối hợp 2,0 mg/l
BAP; 1,0 mg/l Kin và 0,2 mg/l α-NAA đã làm tăng hệ số nhân chồi (đạt
5,98 lần) và chiều cao trung bình chồi (đạt 6,07 cm) so với việc sử dụng
riêng rẽ 3,5mg/l BAP (hệ số nhân chồi đạt 5,03 lần, chiều cao trung bình
chồi đạt 4,18cm) theo nghiên cứu của Trịnh Thị Thanh Hương và cộng
sự (2014).
3.2.4.2. Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tái sinh và nhân nhanh
chồi in vitro
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến hiệu quả nhân chồi
(sau 4 tuần nuôi cấy)
Nƣớc
dừa
(ml/l)

CT

Hệ số
nhân
(lần)

Chiều

150

5,69

5,77

4,33

CT25

200

4,71

5,27

3,67

CT26

250

3,71

4,67

3,33

0,14

nhân chồi, tăng từ 5,03 lần lên 6,32 lần, đồng thời chất lượng chồi thu
được tốt, chồi mập, lá to, thân lá xanh đậm, sinh trưởng phát triển tốt.
Như vậy, hàm lượng nước dừa phù hợp để bổ sung vào môi trường
là 100ml/l và môi trường phù hợp để nhân chồi gừng Bắc Kạn in vitro
là: MS + 30g/l Succrose + 6 g/l agar + 2,0mg/l BAP + 1,0mg/l Kin +
0,2mg/l α-NAA + 100ml/l nước dừa.
3.2.5. Tái sinh rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro
Kết quả nghiên cứu cho thấy công thức sử dụng môi trường MS
có bổ sung 0,6mg/l NAA có hiệu quả tái sinh rễ và tạo cây hoàn chỉnh
tốt nhất với thời gian ra rễ từ 19 – 21 ngày, chiều cao TB/cây là
9,63cm, số lá TB/cây là 5,33 lá, số rễ TB là 5,51 rễ/chồi và chiều dài
TB rễ là 4,43cm. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với công bố trước đó
của các tác giả khi nghiên cứu nhân giống cây họ gừng, đặc biệt khẳng
định kết quả nghiên cứu của Trịnh Thị Thanh Hương và cộng sự (2014)
khi nghiên cứu trên đối tượng gừng đá Bắc Kạn [19,51,112].

0,2

0,4

1,0

0,8

0,6

0,2

A


mỏng
3.2.7.1. Sơ đồ quy trình
3.2.7.2. Mô tả quy trình
* Bước 1: Chuẩn bị vật liệu
* Bước 2: Tạo callus
* Bước 3: Tái sinh chồi từ callus
* Bước 4: Nhân chồi in vitro
* Bước 5: Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro
* Bước 6: Chuyển cây ra vườn ươm
3.3. Đặc điểm nông sinh học cây gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô
Gừng Bắc Kạn nguồn gốc nuôi cấy in vitro được trồng tại Thành phố
Việt trì – Tỉnh Phú Thọ trong điều kiện đồng ruộng để đánh giá các đặc
điểm nông sinh học: Động thái tăng trưởng chiều cao cây; Động thái ra lá;
Động thái đẻ nhánh; Một số yếu tố cấu thành năng suất.
Thời gian trồng: Tháng 4/2016

16


3.3.1. Động thái tăng trưởng chiều cao cây
Kết quả nghiên cứu cho thấy tốc độ tăng trưởng chiều cao cây của
giống gừng Bắc Kạn trong suốt quá trình theo dõi là tương đối chậm. Ở 20
ngày sau trồng chiều cao cây trung bình đạt 4,39cm. Đến 50 ngày sau
trồng, chiều cao cây trung bình đạt 8,88cm (tăng 4,49cm/30 ngày); 80 ngày
sau trồng chiều cao cây trung bình đạt 13,60 cm (tăng 4,72 cm/30 ngày).
Tốc độ tăng trưởng chiều cao cây đạt cao nhất đạt 5,41 cm/30 ngày
(170-200 ngày sau trồng) và 4,73 cm/30 ngày (140 – 170 ngày sau trồng).
Đến 290 ngày sau trồng, chiều cao cây trung bình đạt 41,85cm; 320 ngày
sau trồng, chiều cao cây trung bình đạt 44,26 cm.
3.3.2. Động thái ra lá

3.4.1. Kết quả tách chiết tinh dầu
Tinh dầu thu được từ các mẫu thân lá có màu vàng nhạt, mùi thơm
dễ chịu. Ở mẫu gừng Bắc Kạn tự nhiên, từ 400g mẫu lá tươi thu được
0,440g tinh dầu, đạt hàm lượng 0,110 % (tính theo nguyên liệu mẫu tươi).
Ở mẫu gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô, hàm lượng tinh dầu mẫu lá trồng tại
Bắc Kạn và trồng tại Phú Thọ có tỉ lệ hàm lượng tinh dầu tương đương
nhau, lần lượt là 0,131% và 0,133%, và đều cao hơn so với mẫu gừng Bắc
Kạn tự nhiên. Điều này chứng tỏ việc trồng mẫu nuôi cấy mô ở hai địa
điểm khác nhau (Bắc Kạn và Phú Thọ) không làm ảnh hưởng đến hàm
lượng tinh dầu (Bảng 3.17).
Tinh dầu thu được từ các mẫu củ rễ có màu vàng đậm, cũng có
mùi thơm dễ chịu giống như tinh dầu thu được từ phần lá. Khi so sánh
với mẫu gừng Bắc Kạn tự nhiên, các mẫu gừng nuôi cấy mô cho hàm
lượng tinh dầu phần thân lá cao hơn phần củ rễ. Ở mẫu gừng Bắc Kạn tự
nhiên, từ 500g mẫu rễ tươi thu được 0,412g tinh dầu, đạt hàm lượng
0,082 % (tính theo nguyên liệu mẫu tươi). Ở các mẫu gừng Bắc Kạn
nuôi cấy mô, tinh dầu thu được từ bộ phận rễ có hàm lượng thấp hơn hẳn

18


so với tinh dầu thu được từ bộ phận lá (0,075% ở mẫu củ rễ so với
0,131% ở mẫu thân lá) (Bảng 3.17).
3.4.2. Thành phần hóa học tinh dầu
Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS)
đã xác định được thành phần tinh dầu thân lá mẫu TNBK gồm 14 cấu tử
(chiếm 94,38%), mẫu CMBK gồm 13 cấu tử (chiếm 85,16%), mẫu CMPT
gồm 18 cấu tử (chiếm 84,33%). Thành phần tinh dầu thân rễ mẫu TNBK
gồm 15 cấu tử (chiếm 94,24%), mẫu CMBK gồm 14 cấu tử (chiếm
85,27%), mẫu CMPT gồm 18 cấu tử (chiếm 88,65%) (bảng 3.18).

TNB
K

CMB
K

CMP
T1

CMP
T2

Công
thức
phân tử

-

-

-

-

0,43

-

0,31


0,68

1,18

0,25

0,15

0,38

0,87

C10H14

4 Limonene

-

-

-

0,14

0,12

-

-


3,42

3,01

0,32

1,36

4,47

C8H14O

7 Borneol

-

-

0,34

-

0,36

-

1,02

0,98


-

2,25

2,11

3,35

5,25

C12H20O2

10 Decenal <2E->

80,78

39,60

47,11

53,48

80,48

22,21

42,52

61,59


0,84

1,16

2,35

2,51

C12H20O2

1,03

21,94

8,60

2,67

1,69

36,29

21,22

2,19

C10H18O2

0,46


0,94

0,99

C12H22O

16 Decanol <n->

0,58

-

0,78

-

-

-

-

-

C10H22O

0,20

0,17


-

0,45

0,25

-

-

0,64

0,25

-

C9H18O

19 Nonanoic acid

-

1,70

-

-

-


85,16

84,33

98,21

94,24

85,27

88,65

98,05

Tổng

Ghi chú:

TNBK: Mẫu mọc tự nhiên tại Bắc Kạn
CMBK: Mẫu nuôi cấy mô trồng tại Bắc Kạn
CMPT1: Mẫu nuôi cấy mô trồng tại Phú Thọ 01 năm tuổi
CMPT2: Mẫu nuôi cấy mô trồng tại Phú Thọ 02 năm tuổi
( - ): Không phát hiện

Khi so sánh với tinh dầu của một số loài thuộc chi Alpinia khác thì
thấy rằng, tinh dầu gừng Bắc Kạn tự nhiên có sự khác biệt lớn với tinh dầu
của các loài này: trong khi tinh dầu gừng Bắc Kạn tự nhiên chứa các thành
phần chính là decenal, octenal, 2-decenoic acid, decen-1-ol và dodecanal
thì tinh dầu Riềng nếp (A. galanga) chứa thành phần chính là 1,8-cineol,
camphor, alpha-fenchyl acetate; tinh dầu A. conchigera chứa 1,8-cineol,


22

4. NCM BK-CR1: Mẫu củ rễ cây NCM Bắc Kạn 01 năm tuổi 5. NCM PT-TL1: Mẫu thân lá cây NCM Phú Thọ 01 năm tuổi

3. NCM BK-TL1: Mẫu thân lá cây NCM Bắc Kạn 01 năm tuổi

2. Bản địa-CR1: Mẫu củ rễ cây bản địa Bắc Kạn 01 năm tuổi

1. Bản địa-TL1: Mẫu thân lá cây bản địa Bắc Kạn 01 năm tuổi

Ghi chú:

Bảng 3.20: Khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của tinh dầu gừng Bắc Kạn nguồn gốc nuôi cấy mô


KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN:
1. Đã xác định được cây Gừng đá ở tỉnh Bắc Kạn thuộc chi Riềng
(Alpinia) có tên khoa học là Alpinia coriandriodora D.Fang. Đây là một
loài bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam, nâng tổng số loài hiện biết của chi
Alpinia Roxb. ở Việt Nam lên 34 loài.
2. Kết quả phân loại từ cây phát sinh loài được xây dựng bằng khối
dữ liệu đơn matK và ITS là tương đồng nhau, tuy nhiên chúng thể hiện
rằng kết quả từ khối dữ liệu đơn là không rõ ràng và mức ủng hộ thấp.
Cây phát sinh loài từ khối dữ liệu kết hợp matK và ITS cho thấy loài
gừng Bắc Kạn (Alpinia coriandriodora) có sự tương đồng về di truyền
với các loài trong cùng vùng phân bố và có mối quan hệ rất gần gũi với
một số thành viên chi Alpinia ở phía nam Trung Quốc (Quảng Tây, Vân
Nam, Quảng Đồng, Hải Nam) như A. japonica, A. coriacea và A.