BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

DƢƠNG THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH GÂY
ĐỘC TẾ BÀO VÀ KHÁNG VIÊM CỦA HAI LOÀI HẢI MIÊN
Rhabdastrella providentiae VÀ Xestospongia muta Ở VÙNG
BIỂN TRUNG BỘ VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ
Mã số

: 9.44.01.14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2019


Công trình được hoàn thành tại: Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS. TS. Phan Văn Kiệm
Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Bùi Hữu Tài


dào cả v trữ ượng và thành ph n loài. Các kết quả nghiên cứu cho
thấy số ượng loài hải miên ở vùng biển Việt Nam được phát hiện
khoảng 160 loài và phân bố tập trung ở vùng biển quanh các đảo ven
bờ và xa bờ Trong đ mới chỉ nghiên cứu v thành ph n hóa học và
hoạt tính sinh học c a khoảng 20 loài. Riêng loài hải miên
Rhabastrella providentiae chưa c nghi n cứu nào trên thế giới cũng
như ở Việt Nam. Loài hải miên Xestospongia muta cũng chưa c
nghiên cứu nào ở Việt Nam.
Việc nghiên cứu, khảo sát thành ph n hóa học và hoạt tính
sinh học c a các loài hải mi n đang à vấn đ thu hút s quan tâm c a
các nhà khoa học trên thế giới. Ở Việt Nam, bước đ u đ c những
công trình nghiên cứu v thành ph n hóa học và hoạt tính sinh học
c a các loài sinh vật biển đăng tr n các tạp chí quốc tế uy t n nhưng
chưa nhi u. Chính vì thế, nhiệm vụ nghiên cứu khảo sát v thành
ph n hóa học và hoạt tính sinh học c a hải miên nói riêng và sinh vật
biển nói chung ở nước ta là rất quan trọng. Xuất phát t điểm đ , đ
tài “Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính gây độc tế bào và
kháng viêm của hai loài hải miên Rhabdastrella providentiae và
Xestospongia muta ở vùng biển Trung bộ Việt Nam” đ được l a
chọn.
Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu để làm rõ thành ph n hóa
học c a hai loài hải miên Rhabdastrella providentiae và


2

Xestospongia muta thu ở vùng biển Trung bộ Việt Nam Đánh giá
hoạt t nh g y độc tế bào và hoạt tính kháng viêm c a các hợp chất
phân lập được để tìm kiếm các hoạt chất àm cơ sở khoa học cho
những nghiên cứu tiếp theo để tạo ra sản phẩm chăm s c sức khỏe


1.2.2.2. Đặc trưng phổ 13C-NMR của một số hợp chất
isomalabaricane phân lập từ hải miên giống Rhabdastrella
1.2.2.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của hải miên giống
Rhabdastrella
1.3. Tổng quan về hải miên thuộc giống Xestospongia
1.3.1. Giới thiệu chung về hải miên thuộc giống Xestospongia
Đến năm 2018 c hoảng 350 nghi n cứu v hải mi n thuộc
giống Xestospongia. T các nghi n cứu đ ph n ập và xác đ nh cáu
trúc c a hỏng 400 hợp chất
1.3.2. Tình hình nghiên cứu về hải miên thuộc giống Xestospongia
trên thế giới
1.3.2.1. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của hải miên giống
Xestospongia
1.3.2.2. Đặc trưng phổ 13C-NMR của một số hợp chất macrocyclic
bis-quinolizidine alkaloid phân lập từ hải miên giống Xestospongia
1.3.2.3. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các hợp chất
alkaloid phân lập từ hải miên thuộc giống Xestospongia.
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Mẫu hải miên Rhabdastrella providentiae (Dendy, 1916)
được thu ở rạn san hô thuộc vùng biển Cồn Cỏ, Quảng Tr . Mẫu hải
miên Xestospongia muta (Schmidt, 1870) được thu ở rạn san hô
thuộc vùng biển V nh Mốc, Quảng Tr . Tên khoa học c a hai mẫu
được xác đ nh bởi GS TS Đ Công Thung, Viện Tài nguyên và Môi
trường biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam
(VAST). Mẫu tiêu bản được ưu giữ tại Viện Hóa sinh biển, VAST.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Phương pháp phân lập các hợp chất
Phương pháp xác định cấu trúc

RP11
RP12
RP13
RP14
RP15
RP16

IC50 (µM)
7,4 ± 0,4
75,3 ± 3,8
17,5 ± 0,9
46,8 ± 2,3
22,9 ±1,1
39,2 ± 2,0
26,3 ± 1,3
19,4 ± 1,0
29,4 ± 1,5
17,1 ± 0,9
19,5 ± 1,0
43,8 ± 2,2
4,5 ± 0.5

Butein
2.5.2. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập
được từ loài X. muta
Bảng 2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh ra NO
trong tế bào BV2 của các hợp chất XM1-XM11
Hợp chất
XM1
XM6

14,75±1,30
63,38±2,45
62,20±3,41
1,96 ± 0,2

MCF-7
77,92±4,54
16,04±2,04
63,76±3,91
55,85±2,96
1,71 ± 0,2

HL-60
56,14± 4,08
14,76± 1,31
46,33± 2,58
48,30± 3,73
2,16 ± 0,1

ĐC: Sử dụng Ellipticine làm đối chứng dương

SK-Mel 2
75,39± 4,83
11,16± 1,40
75,52± 6,69
37,96± 0,07
2,12 ± 0,3


6

0,76±0,09
0,96±0,09
9,20±1,21
5,63±0,19
5,84±0,45
9,88±0,98
32,59±2,56
22,25±1,26
34,83±0,54
1,38 ± 0,16

IC50 (µM)
MCF-7
0,44±0,05
0,79±0,05
7,36±1,16
5,32±0,67
5,68±0,89
7,82±0,53
24,85±1,21
24,85±0,91
37,96±1,01
1,18 ± 0,12

HL-60
0,62±0,08
0,88±0,17
7,84±0,85
5,65±0,42
6,58±0,94


Hình 3.30. Cấu trúc hóa học của hợp chất RP12 và hợp chất RP10


7

Hợp chất RP12 thu được ưới dạng chất bột vô đ nh hình
màu vàng nhạt. Trên phổ khối ượng phân giải cao HR-ESI-MS c a
RP12 xuất hiện các pic ion giả phân tử tại m/z 471.3461 [M+H]+
(tính toán lí thuyết cho công thức phân tử C30H47O4, 471,3474), m/z
493,3289 [M+Na]+ (tính toán lí thuyết cho công thức phân tử
C30H46O4Na, 493,3294), m/z 515,3390 [M+HCOO]- (tính toán lí
thuyết cho công thức phân tử C31H47O6, 515,3373); kết hợp với phổ
13
C-NM cho phép xác đ nh công thức phân tử c a RP12 là
C30H46O4. T công thức phân tử tr n t nh toán được độ bất bão hòa
c a RP12 là 8. Trên phổ 1H-NMR c a hợp chất RP12 xuất hiện tín
hiệu c a 7 nhóm methyl singlet cộng hưởng tại δH 0,95, 1,05, 1,09,
1,50, 1,60, 1,68, 1,71 (3H, s); tín hiệu c a 2 proton olefin tại δH 5,81
(d, J = 8,5 Hz), 5,10 (d, J = 6,5 Hz); tín hiệu c a 3 proton oxymethine
tại δH 4,15 (d, J = �c phân lập
t một số loài hải mi n như X. exigua, Haloclona exigua và có tên


14

thường gọi là araguspongine C. Các dữ liệu 13C-NMR c a XM1 được
phân tích lại trong CDCl3 và nhận thấy hoàn toàn trùng khớp với số
liệu 13C-NMR đ công ố c a hợp chất araguspongine C trong cùng
ung môi đo NM .


26,4

25,9

26,9

4, 4′

52,9

52,4

53,2

6, 6′

44,6

44,2

45,5

7, 7′

21,3

20,8

21,8


90,7

90,3

91,0

4,10 (s)

11, 11′

39,0

38,5

41,3

1,70 (ddd, 4,0, 13,0, 13,0)/1,23 (m)

12, 12′

23,0

22,5

23,7

1,47 (m)/ 1,35 (m)

13, 13′

- Hợp chất mới XM2 được xác đ nh hóa lập thể d a trên việc phân
tích chi tiết hằng số tương tác J c a các proton, phân tích cấu dạng và
tương tác hông gian tr n phổ NOESY.
- Các hợp chất XM3-XM4 là những hợp chất cũ nhưng đ y à n
đ u tiên các hợp chất này được biện giải cấu trúc và phân tích hóa
học lập thể.
- Các hợp chất hung macrocyc ic is-1-oxa-quino izi ine mới chỉ
được tìm thấy hơn 20 hợp chất và cũng chỉ được thông báo có trong


16

các oài hải mi n giống Xestospongia. Vì thế, các hợp chất XM1XM11 cũng c thể được sử ụng như những hợp chất mar er trong
đ nh anh các oài hải mi n giống Xestospongia.

Hình 3.78. Cấu trúc hóa học của các hợp chất XM1-XM11
3.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được
3.3.1. Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được từ loài R.
providentiae

Sau hi đánh giá sơ ộ tác dụng ức chế s sản sinh ra NO
trong tế bào BV2 được kích thích bởi LPS c a 18 hợp chất (RP1RP18) ở nồng độ 80 µM, các hợp chất RP2, RP5, RP7-RP16 không
g y độc tế bào và có khả năng ức chế >50% s sản sinh ra NO trong


17

tế ào BV2 Do đ , các chất này được tiếp tục thí nghiệm ở các nồng
độ khác nhau để xác đ nh giá tr IC50. Kết quả (Bảng 2.1) cho thấy:
Hợp chất RP2 thể hiện tác dụng ức chế sản sinh NO trong tế bào


18

có thể được sử dụng làm ti n đ cho những nghiên cứu s u hơn v
hoạt tính kháng viêm c a các hợp chất XM1, XM6, XM8.
3.3.3. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập
được từ loài R. providentiae
Kết quả đánh giá hoạt t nh g y độc tế bào in vitro c a 18 hợp
chất phân lập được t loài hải miên R. providentiae (RP1-RP18) trên
5 dòng tế ào ung thư ở người Hep-G2, LU-1, MCF-7, HL-6, SKMel-2 (Bảng 2.3) cho thấy: Hợp chất RP2 thể hiện hoạt t nh g y độc
tế bào mạnh nhất đối với cả 5 dòng tế ào ung thư thử nghiệm với giá
tr IC50 trong khoảng 11,16-16,04 (µM). Các hợp chất RP1, RP3,
RP7 thể hiện hoạt g y độc trên tất cả các dòng tế ào ung thư thử
nghiệm với giá IC50 trong khoảng 37,96-84,82 (µM). Các hợp chất
còn lại không thể hiện hoạt t nh g y độc tế bào (IC50> 100 µM) đối
với 5 dòng tế bào trên.
T kết quả trên, nhận thấy các hợp chất RP1-RP3 với cấu
trúc isomalabaricane analog 29C thể hiện hoạt t nh g y độc tế bào
trên các dòng tế ào ung thư thử nghiệm, trong khi các hợp chất còn
lại có cấu trúc isomalabaricane ana og 19C đến 25C không thể hiện
hoạt tính. Hợp chất RP7 với đồng phân 13E thể hiện hoạt tính trong
hi đồng phân 13Z (RP6) không thể hiện hoạt t nh Đi u này cũng
hoàn toàn phù hợp so với nghiên cứu trước đ y rằng: các hợp chất
isomalabaricane analog với ph n mạch nhánh ài hơn thể hiện hoạt
t nh g y độc tế bào mạch hơn các hợp chất có mạch nhánh ngắn, các
đồng phân 13E thể hiện hoạt tính mạnh hơn các đồng phân 13Z. M t
khác, hợp chất RP2 với có cấu hình liên kết đôi 20(22)Z có hoạt tính
g y độc tế ào tăng đáng ể so với đồng phân 20(22)E (RP1), cho
thấy cấu hình c a liên kết đôi C-20/C-22 có thể cũng quyết đ nh tới
hoạt t nh g y độc tế bào c a các hợp chất isomalabaricane analog.

a. Đánh giá tác động của hợp chất XM1 đến chu kì tế bào ung thư vú
người MCF-7 sau 48 giờ xử lí với hợp chất XM1 ở nồng độ 2 và
10µM:

Hình 3.79. Tác động của hợp chất XM1 đến chu kì tế bào MCF-7


20

Bảng 3.30. Tỉ lệ (%) tế bào MCF-7 trong pha G0/G1, S, G2/M và apoptosis
(sub-G1) sau 48 giờ xử lí với hợp chất XM1 ở nồng độ 2 và 10µM
% Tế bào ở các pha của chu trình phân bào
Mẫu
% sub-G1
%G0/G1
%S
%G2/M
Control
0,01
54,92
38,39
5,93
XM1_2µM
0,05
53,10
34,79
9,19
XM1_10µM
0,03
40,00

bào MCF-7
Kết quả (Hình 3.81) cho thấy hợp chất XM1 gây ra quá trình t chết
(apoptosis) trên tế bào MCF-7. Tỉ lệ apoptotic cells tăng t 2.79% ở
mẫu control lên 50.74% ở mẫu xử lí với hợp chất XM1 ở nồng độ
10µM.
d. Đánh giá tác động của hợp chất XM1 đến biểu hiện của các
protein trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 1, 3 và 10µM.

Hình 3.82. Ảnh hưởng của hợp chất XM1 đến các biểu hiện của
Caspase 3, Bcl-2, Bax protein trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 1,
3 và 10µM
Ảnh hưởng c a hợp chất XM1 đến các biểu hiện c a Caspase
3, Bcl-2, Bax protein trên dòng tế bào MCF-7 ở nồng độ 1, 3 và
10µM được đánh giá ằng phương pháp Western blot. Kết quả cho
thấy, ở nồng độ 3-10µM, hợp chất XM1 làm giảm biểu hiện c a Bcl2 protein và tăng iểu hiện c a Bax và Caspase -3 (Hình 3.82).
KẾT LUẬN
Đ y à công trình nghi n cứu đ u tiên v thành ph n hóa học
và hoạt tính sinh học c a hai loài hải miên Rhabdastrella


22

providentiae và Xestospongia muta thu thập ở vùng biển mi n Trung
Việt Nam.
1. Nghiên cứu về thành phần hóa học
Sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ý và các phương
pháp phổ hiện đại đ ph n ập và xác đ nh cấu trúc 29 hợp chất t hai
loài hải miên R. providentiae và X. muta. Trong đ , c 13 hợp chất
mới. Cụ thể:
- Từ loài R. providentiae đã phân lập và xác định cấu trúc 18 hợp

Các mẫu XM7, XM8, XM11 có khả năng g y độc tế bào với giá tr
IC50 trong khoảng 16,79-37,96 µM. Nghiên cứu cơ chế gây chết tế
ào ung thư MCF-7 c a hợp chất XM1 theo hình thái tế bào ở cấp độ
phân tử đ chỉ ra hợp chất XM1 tác động đến chu kì tế ào ung thư
vú người MCF-7 ở pha G2/M Đồng thời hợp chất này cũng g y n n
quá trình apoptosis c a tế ào thông qua àm thay đổi mức độ biểu
hiện c a các protein i n quan (tăng iểu hiện c a Bax, Caspase-3 và
giảm biểu hiện Bcl-2) trong tế ào ung thư vú người MCF-7.
- Đ nghi n cứu hoạt tính kháng viêm thông qua ức chế s sản sinh
NO trong tế bào BV2 c a 18 hợp chất (RP1- RP18) phân lập được t
loài R. providentiae và 11 hợp chất (XM1-XM11) phân lập được t
loài hải miên X. muta. Kết quả cho thấy:
+ Trong số các hợp chất RP1-RP18, hợp chất RP2 thể hiện khả
năng ức chế sản sinh NO mạnh nhất với giá tr IC50 7,4 ± 0,4 µM,
tiếp theo là các hợp chất RP7, RP9, RP11-RP15 ức chế sản sinh NO
với giá tr IC50 rất đáng chú ý 17,1-29,4 µM, các hợp chất RP8,
RP10, RP16 thể hiện hoạt tính kháng viêm với giá tr IC50 39,2-46,8
µM.
+ Các hợp chất XM1, XM6, XM8 thể hiện hoạt tính kháng viêm
đáng chú ý với giá tr IC50 trong khoảng 4,98-11,58 µM, đ c biệt là
hợp chất XM1 có khả năng ức chế s sản sinh NO trong tế bào BV2
với giá tr IC50 4,9 µM g n tương đương với đối chứng ương utein
(IC50 4,4 µM).
KIẾN NGHỊ
T các kết quả nghiên cứu v thành ph n hóa học và hoạt tính
sinh học c a các loài hải miên R. providentiae và X. muta nhận thấy:
1. Hợp chất XM1 tác động đến chu kì tế ào ung thư vú người MCF-7
ở pha G2/M đồng thời cũng g y n n quá trình apoptosis c a tế bào
thông qua àm thay đổi mức độ biểu hiện c a các protein liên quan




25

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1. Phan Van Kiem, Duong Thi Dung, Pham Hai Yen, Nguyen Xuan

Nhiem, Tran Hong Quang, Bui Huu Tai, and Chau Van Minh. New
isomalabaricane analogues from the sponge Rhabdastrella
providentiae and their cytotoxic activity. Phytochemistry letters, 2018
(26), 199-204.
2. Duong Thi Dung, Pham Hai Yen, Nguyen Xuan Nhiem, Tran Hong
Quang, Bui Huu Tai, Chau Van Minh, Dong Cheol Kim, Hyuncheol
Oh, Youn Chul Kim, and Phan Van Kiem. New acetylated terpenoids
from sponge Rhabdastrella providentiae inhibit NO production in LPS
stimulated BV2 cells. Natural Product Communications, 2018, 13 (6),
661-664.
3. Duong Thi Dung, Dan Thi Thuy Hang, Nguyen Xuan Nhiem, Tran
Hong Quang, Bui Huu Tai, Pham Hai Yen, Nguyen Thi Hoai, Do
Cong Thung, and Chau Van Minh, Phan Van Kiem. Rhabdaprovidines
D-G, four new 6,6,5-tricyclic terpenoids from the Vietnamese sponge
Rhabdastrella providentiae. Natural Product Communications, 2018,
13(10), 1251-1254.
4. Duong Thi Dung, Dan Thi Thuy Hang, Pham Hai Yen, Tran Hong
Quang, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Chau Van Minh, YounChul Kim, Dong Cheol Kim, Hyuncheol Oh, and Phan Van Kiem.
Macrocyclic bis-quinolizidine alkaloids from Xestospongia muta.
Natural Products Research, />2018.1455043.
5 Dương Th Dung, Đan Th Thúy Hằng, Phạm Hải Yến, Nguyễn Xuân
Nhiệm, Tr n Hồng Quang, Bùi Hữu Tài, Phan Văn Kiệm. Nghiên cứu
thành ph n hóa học loài hải miên Rhabdastrella providentiae. Tạp chí