ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Đặng Thị Kiều Oanh
NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HOÀN THIỆN
QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP
Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƯỜI
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – 2013
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Đặng Thị Kiều Oanh
NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN VÀ HOÀN THIỆN
QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP
Streptococcus suis TỪ DỊCH NÃO TỦY NGƯỜI
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. PHAN LÊ THANH
HƯƠNG
Đặng Thị Kiều Oanh
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
MỤC LỤC
Capsular polysaccharide .................................................................................
10
Deoxyribonucleic acid ....................................................................................
10
Polymerase chain reaction ..............................................................................
10
ĐẶT VẤN ĐỀ
..................................................................................................
20
1.3.2. Triệu chứng .........................................................................................
21
1.3.3. Biện pháp phòng bệnh ........................................................................
22
1.3.4. Biện pháp chống dịch ..........................................................................
23
1.3.5. Nguyên tắc điều trị ..............................................................................
23
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM
............................
24
1.4.1. Nuôi cấy phân lập ..............................................................................
24
1.4.2. Nhuộm Gram ........................................................................................
24
1.4.3. Phản ứng catalase ................................................................................
24
1.4.4. Xét nghiệm định danh, định typ: .........................................................
37
2.1.1. Chủng vi khu ẩn s ử dụng trong nghiên cứu ......................................
37
2.1.2. Dịch não tủy nền ................................................................................
38
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
2.1.3. Dịch não tủy của bệnh nhân đượ c chẩn đoán lâm sàng viêm màng
não cấp tính do S. suis (để đánh giá hiệu quả của quy trình PCR đa mồi
được xây dựng trong đề tài): ......................................................................
38
2.1.4. Sinh phẩm nghiên cứu: ........................................................................
38
2.1.5. Trang thi ết bị, dụng c ụ .......................................................................
41
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
2.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP
.............................
54
2.3.1. Tiêu chuẩn xác định chẩn đoán dương tính và âm tính ....................
54
2.3.2. Các chỉ số tính toán độ tin cậy và giá trị của phương pháp [3, 4] ...
55
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
..............................................
57
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP
Streptococcus suis VÀ MỘT SỐ ĐỘC LỰC PHỔ BIẾN CỦA VI KHUẨN
................
57
3.1.1. Tạo bệnh ph ẩm mô phỏng .................................................................
57
3.1.2. Lựa chọn các cặp mồi và tổ hợp mồi phù hợp: .............................
.........................................................................................................................................
65
3.1.5. Độ nhạy và tính ổn định của quy trình PCR đượ c xây dựng (khả
năng lặp lại kết quả) .....................................................................................
67
Độ lặp lại của kỹ thuật
.............................................................................
68
(10 lần thử nghiệm)
.................................................................................
68
1
............................................................................................................................
68
0/10
....................................................................................................................
68
3.1.6. Đánh giá khả năng bắt cặp chéo của các cặp mồi (tính đặc hiệu)
80
TÀI LIỆU THAM KHẢO
............................................................................
83
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Vi khuẩn liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn qua kính hiển vi
điện tử 3
(http://genome.jgipsf.org/strsu/strsu.home.html) 3
Hình 1.2: Khuẩn lạc S. suis trên môi trường thạch máu cừu và
thạch máu ngựa 4
Hình 1.3. Bệnh nhân bị nhiễm S. suis
(http://www.pig333.com/what_the_experts_say/streptococcussuis
zoonoticepidemicinasia_4091/) 22
Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng PCR 27
(http://fmel.ifas.ufl.edu/buzz/csPCR.shtml) 28
Hình 3.1. Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 1 đến tổ
hợp 8) 58
Hình 3.2.Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 9 đến tổ
hợp 16) 59
Hình 3.3. PCR đa mồi với các điều kiện phản ứng tối ưu phát hiện
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hệ gen của một số chủng Sreptococcus suis
............................
4
Bảng 2.1. Một số trình tự mồi chủ yếu (primer) được sử dụng trong
nghiên cứu [11,25,39,41]
...............................................................................
40
Bảng 2.2. Các tổ hợp mồi được sử dụng trong thử nghiệm
................
48
Bảng 2..3. Các chu trình PCR đa mồi được thử nghiệm
........................
50
Bảng 2.3. Bảng số liệu cơ bản để tính toán các chỉ số
61
Bảng 3.5. Thành phần tham gia phản ứng PCR đa mồi được khảo sát
62
.........................................................................................................................
Bảng 3.6. Tính ổn định của Quy trình PCR khi thực hiện trên mẫu
bệnh phẩm
....................................................................................................
68
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý bệnh phẩm
dùng/không dùng kit
.....................................................................................
70
Bảng 3.8. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR đa mồi so
với phương pháp nuôi cấy phân lập (chuẩn vàng) với n = 144
.............
76
Đặng Thị Kiều Oanh Cao học
K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
Chứng âm
C (+)
Chứng dương
Cps
Capsular polysaccharide
DNA
Deoxyribonucleic acid
DNT
Dịch não tủy
Eef
Extracellular factorr
Mrp
Muramidasereleased protein
NCPL
Nuôi cấy phân lập
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm 1960s trên thế giới và vài năm gần đây tại khu vực châu Á
trong đó có Trung Quốc và Việt Nam, luôn có sự cảnh báo về tầm nghiêm trọng
của vi khuẩn Streptococcus suis (S. suis) như một tác nhân gây bệnh nguy hiểm
cho người và có tiềm năng gây các vụ bùng phát dịch.
Tại Việt Nam, nhiễm trùng cấp tính ở người do S. suis đã và đang được coi
là một bệnh nhiễm trùng mới nổi, có khả năng gây tỷ lệ tử vong và di chứng cao.
Rất nhiều trường hợp mắc bệnh có các biểu hiện lâm sàng rất nặng như: nhiễm
khuẩn huyết, viêm màng não có ban xuất huyết và hoại tử, hội chứng sốc nhiễm
trùng nhiễm độc liên cầu. Số liệu lâm sàng sơ bộ của một số viện và bệnh viện
lớn như Viện Các Bệnh truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia, Bệnh viện Chợ
Rẫy, Bệnh viện Trung ương Huế đã cho thấy S. suis là một trong những nguyên
nhân chủ yếu gây bệnh nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não mủ ở người lớn
tại Việt Nam.
Ở các nước có nền kinh tế phát triển, việc chẩn đoán S. suis bởi các kỹ
thuật nuôi cấy phân lập kinh điển hoặc phát hiện kháng nguyên đặc hiệu bằng
các kỹ thuật miễn dịch học, thậm chí các kỹ thuật sinh học phân tử rất phổ biến.
Ở Việt Nam, vì sự không đồng bộ về cơ sở vật chất, trang thiết bị cũng
như sự không ổn định về kỹ năng thực hành chẩn đoán phòng thí ngiệm, những
phương pháp sinh học phân tử hiện đại nhằm chẩn đoán S. suis rất khó có thể áp
dụng rộng rãi. Tuy nhiên trong các phương pháp hiện đại, nhanh và chính xác,
phương pháp PCR đa mồi (nhân gen đa mồi) là phương pháp có tính khả thi hơn
cả về mặt kinh tế và kỹ năng thực hiện so với phương pháp PCR định lượng
(Real time PCR). Với phương pháp PCR đa mồi, chúng ta có thể đồng thời phát
Đặng Thị Kiều Oanh 1
Cao học K18
kháng nguyên liên quan đến nhóm D theo phân loại của Lancefield, mặc dù về
mặt di truyền, vi khuẩn này không có sự liên quan đến thành viên khác của nhóm
này. Thời điểm ban đầu, theo hệ thống phân loại của Lancefield, S. suis thuộc
nhóm R, S và T tương ứng với các type huyết thanh 2, 1 và 15 [36]. Nhưng đến
năm 1995, dựa vào cấu trúc vỏ các nhà khoa học đã nghiên cứu được S.suis có
tổng cộng 35 type huyết thanh (từ typ 1 đến typ 34 và typ 1/2 ) [48] nhưng typ 32
và 34 vừa được chứng minh là Streptococcus orisratti. Mặc dù vậy, các chủng
gây bệnh cho người đáng chú ý là typ 1, 2, 14, chúng có thể thay đổi theo vùng và
theo thời gian [50]. Nhưng typ 2 gây bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng ở lợn và là
kiểu huyết thanh phổ biến nhất ảnh hưởng đến con người rộng rãi trên toàn thế
giới, có rất ít trường hợp gây bệnh ở người do typ 1 và typ 14.
Hình 1.1: Vi khuẩn liên cầu lợnliên cầu khuẩn lợn qua kính hiển vi điện tử
(http://genome.jgipsf.org/strsu/strsu.home.html)
Vi khuẩn S. suis phát triển trong điều kiện môi trường có 5 10% CO2, mọc
trên các môi trường nuôi cấy giàu chất dinh dưỡng như môi trường thạch máu,
Đặng Thị Kiều Oanh 3
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
thạch Chocolate, nhưng mọc tốt nhất trên môi trường Columbia, nhiệt độ thích
hợp 370C, nhưng có thể phát triển được ở một khoảng nhiệt độ rất rộng 10 –
450C, pH thích hợp 7–7,2. Sau 24 giờ, ở 37 0C, vi khuẩn mọc tạo những khuẩn lạc
nhỏ, tròn, lồi, bờ đều, màu xám hoặc trong suốt, hơi nhầy.
trạng
Chr
Plasmids
1
Đặng Thị Kiều Oanh 4
KT GC
(Mb) %
No data [1]
Gene Protein
2.1 41.1 2,254 2,186
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
TT
Vi sinh vật
Chr
Plasmids
Gene Protein
1
2.01 41.3 2,011 1,824
1
1
2.17 41 2,136 1,947
1
2.1 41.1 2,253 2,185
1
1
1
1
1
2.14 41.1 2,162 2,119
2.39 41.2 2,427 2,334
41.2
41.3
41
41.4
41.2
41.1
41.2
41.4
41.3
2,064
2,190
*Suilysin
Đặng Thị Kiều Oanh 5
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
Suilysin là một yếu tố gây tan huyết được mã hóa bởi gen sly của S. suis.
Protein suilysin thuộc nhóm các độc tố kết hợp với cholesterol và có độ tương
đồng cao với pneumolysin (yếu tố ly giải tế bào của Streptococcus pneumoniae).
Gen sly có mặt ở hầu hết các typ. Nghiên cứu của Takamatsu và cs (2002)
cho rằng gen sly có thể có nguồn gốc ngoại lai. Suilysin có khả năng gây tổn
thương tế bào và làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn (thí nghiệm được
tiến hành in vitro sử dụng các tế bào biểu mô và các tế bào miễn dịch). Ngoài ra,
suilysin còn có thể "khởi động" cho quá trình sản xuất và tác động của các
cytokine. Thí nghiệm sử dụng các dạng đột biến của sly cho thấy mức độ ảnh
hưởng khác nhau của suilysin tùy thuộc vào vật chủ, loại tế bào và loại đột biến.
Tuy kháng thể chống suilysin có tác dụng bảo vệ nhất định, các thử nghiệm
gây nhiễm trên động vật với các chủng mang suilysin cho rằng suilysin không
phải là yếu tố thiết yếu cho độc lực của liên cầu khuẩn.
*Hệ thống Arginine deminase
Năm 2002 Winterhoff và các cộng sự đã xác định được 2 protein bề mặt vi
khuẩn có kích thước 47 kDa và 53 kDa. Hai protein này có mức độ tương đồng
cao với hệ thống arginine deminase (ADS) của S. pyogenes. Protein 47 kDa
tương đồng với ornithine carbamoyl transferase còn 53 kDa tương đồng với
streptococcal acid glycoprotein (SAGP).
ADS là hệ thống enzym cung cấp ATP từ quá trình biến đổi arginine thành
Các gen này mã hóa cho các protein có chức năng như: yếu tố điều hòa, vận
chuyển, đảm nhận chức năng đối với quá trình sinh lý của bản thân vi khuẩn và
cả các nhóm chưa xác định được chức năng. Một nghiên cứu gây nhiễm bằng
chủng S. suis có độc lực yếu và bổ sung thêm các gen từ các chủng gây bệnh đã
tìm thấy chuỗi nucleotide có kích thước 3kb mang thông tin quan trọng liên quan
đến độc lực của vi khuẩn.
Năm 2004, Allen và cs. đã xác định yếu tố làm tan có khả năng hỗ trợ cho sự
xâm nhập của vi khuẩn qua tác động đến acid hyaluronic (tương tự như tác động
của nhiều loại vi khuẩn khác).
1.1.3. Cơ chế gây bệnh của S.suis
Quá trình xâm nhập
Đặng Thị Kiều Oanh 7
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
Cơ chế xâm nhập của S. suis vào vật chủ ít được biết đến. Các tác nhân gây
bệnh có thể tồn tại trong amidan lợn trong thời gian dài. Mô lympho của amidan
được bao phủ bởi các biểu mô niêm mạc. Đặc biệt ở lợn, diện tích bề mặt vòm
miệng tăng đáng kể do biểu mô lõm sâu trong các mô bạch huyết hình thành rất
nhiều phân nhánh [49]. Có thể là sau khi bám dính và xâm nhập vào các tế bào
biểu mô amidan, vi khuẩn vẫn chưa bị phát hiện bởi hệ thống miễn dịch. Tuy
nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào giải thích việc làm thế nào S. suis có thể vượt
qua hàng rào bảo vệ đầu tiên của vật chủ để gây bệnh. Giả thuyết được chấp
nhận nhất hiện nay là các tác nhân gây bệnh làm thủng biểu mô niêm mạc trong
đường hô hấp trên của lợn [21]. Tương tự như vậy, đối với con người, S. suis có
cao trong cơ thể lợn bị bệnh sẽ gây đáp ứng sản xuất kháng thể, mặc dù tiềm
năng để enolaza được biết đến như là một kháng nguyên bảo vệ vẫn còn gây
tranh cãi [15, 58]. Gần đây, một dipeptidylpeptidase (DppIV) của S. suis cũng
được chứng minh là tương tác với fibronectin của người, tính độc hại của một
chủng bị đột biến thiếu dppIV bị suy yếu đáng kể [18]. Sự liên kết của S. suis
với collagen cũng đã được báo cáo [16]. Chủng S. suis bị đột biến mất sortase
SrtA cũng làm giảm khả năng bám dính với protein ECM [55], điều này cho thấy
các peptidoglycan cũng rất quan trọng đối với sự tương tác của các tác nhân gây
bệnh này với các protein ECM.
Nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng sự bám dính của vi khuẩn vào tế bào biểu
mô như là một mô hình để đánh giá các yếu tố độc lực. Một loại enzyme với
hoạt tính 6phosphogluconatedehydrogenase, amylopullulanase, tất cả đều góp
phần vào sự bám dính của S. suis vào tế bào biểu mô [17]. Đột biến mất các yếu
tố điều hòa 2 thành phần CiaRH hoặc điều hòa phiên mã RevSC21 và CovR cũng
làm cho sự bám dính của S.suis vào tế bào biểu mô bị suy giảm đáng kể [46, 57].
Tuy nhiên, cơ chế của hiện tượng này vẫn chưa được biết đến.
Ngoài các chất bám dính như trên thì suilysin rất độc hại cho tế bào [21].
Suilysin là một hemolysin 54kDa, là một chất độc có hoạt tính thiol tác dụng vào
cholesterol trong màng của các tế bào có nhân điển hình [20]. Tuy nhiên, các
chủng không sản xuất suilysin cũng có thể để đi đên các mạch máu và khuếch
tán trong cơ thể vật chủ.
IgA đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống lại các tác nhân
gây bệnh ở niêm mạc. Vi khuẩn có khả năng sản xuất IgA protease để hạn chế
số lượng của IgA chức năng. Chúng cũng có thể tận dụng lợi thế của các mảnh
Đặng Thị Kiều Oanh 9
Cao học K18
Đặng Thị Kiều Oanh 10
Cao học K18
Luận văn thạc sĩ Vi sinh vật
học
axit sialic đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình gây bệnh của S.suis [42].Các
chủng type huyết thanh khác mà lớp vỏ capsit cũng chứa axít sialic như các type
huyết thanh 1 và 16, đôi khi cũng gây bệnh ở người [42]. Axít sialic cũng đã được
chứng minh liên quan đến việc bám dính của S. suis với bạch cầu đơn nhân, vì
thế giả thuyết được đặt ra là các tác nhân gây bệnh sẽ di chuyển trong máu mà
không liên kết với các tế bào thực bào này [ 21] . Cuối cùng, một giả thuyết về sự
bắt chước cấu trúc phân tử đã được đề xuất [ 19], dựa trên thực tế là axit sialic
liên kết 26 được tìm thấy trong vỏ capsit của type huyết thanh 2 và 14 [ 42]
tương tự như đường epitope trên bề mặt của tất cả các tế bào động vật có vú
[22]. Điều này có thể dẫn đến việc nhận biết kháng nguyên của vật chủ bị ảnh
hưởng. Trong thực tế, S. suis kiểu huyết thanh 2 đã được báo cáo là khi nhiễm
vào vật chủ gây đáp ứng miễn dịch kém ở cả lợn và ngựa. [42].
Mặc dù vai trò của CPS rất quan trọng góp phần vào sự hình thành nên tính
độc của S.suis. Nhưng thực tế là một chủng có vỏ capsit không có nghĩa là chủng
có độc tính. Điều này đã chỉ ra rằng sự tồn tại trong máu của S.suis không chỉ dựa
vào lớp vỏ capsit mà còn dựa vào nhiều yếu tố khác. Thực tế, những chủng có
vỏ nhưng không có độc lực có thể chỉ tồn tại trong máu trong vòng 48h, các
chủng có độc lực có thể tồn tại trong vài ngày. Khả năng chống lại sự thực bà
của vi khuẩn còn liên quan đến quá trình biến đổi thành tế bào peptidoglycan
bằng Ndeacetylation. Một chủng đột biến có vỏ capsit nhưng không có PgdA
deacetylase, chịu trách nhiệm làm biến đổi peptidoglycan bị giảm khả năng kháng
khi tăng trưởng trong cơ thể, sắt tự do khan hiếm, làm tăng cường sự điều hòa
biểu hiện của cps2A và rpgG có thể xảy ra [52]. Mặc dù đây là một giả thuyết
hấp dẫn, một sự liên quan rõ ràng giữa sự thiếu sắt và sản xuất CPS vẫn còn
phải được xác minh. Trong thực tế, có báo cáo cho rằng S. suis có thể thích nghi
với môi trường bị hạn chế sắt bằng cách thay đổi trong chuyển hóa của nó, thay
thế sắt bằng mangan, magiê [42]. Ngoài ra, lipoprotein TroA cần thiết cho sự tăng
trưởng S. suis trong các môi trường có mangan thấp, lipoprotein này rất quan
trọng cho sự sống còn của vi khuẩn trong cơ thể. Gần đây, các nhà nghiên cứu đã
tiến hành thí nghiệm làm bất hoạt làm mất lipoprotein tham gia trong sự hấp thu
kẽm, kết quả độc tính bị giảm 50 lần so với chủng ban đầu.
Superoxide dismutase (Sod) là một yếu tố độc lực của vi khuẩn gây bệnh
bằng cách làm giảm quá trình oxy hóa của tế bào thực bào. Khung đọc mở
SSU1356 của một chủng SS2 lâm sàng ZJ081101 mã hóa một loại protein trên
Đặng Thị Kiều Oanh 12
Cao học K18
Copyright: Tài liệu đại học ©