BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

NGUYỄN CẨM HÀ

NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG
SHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƯỚNG LÀM NGUYÊN
LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE,
MỸ PHẨM VÀ DƯỢC PHẨM

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 9 42 01 16

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội – Năm 2020


Công trình được hoàn thành tại: Viện Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học và
Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. Đặng Diễm Hồng
Viện Công nghệ Sinh học

Phản biện 1: …


9.

Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Minh Hiền, Nguyễn Hoàng Ngân, Đặng Diễm Hồng, Đánh
giá mức độ an toàn và tác dụng của squalene tách chiết từ Schizochytrium mangrovei PQ6
đến sự tăng cholesterol của lipoprotein tỷ trọng cao (HDL-C) ở động vật thực nghiệm.
Tạp chí Sinh học, 2019, 41(2), 39-48.
Hoang Thi Lan Anh, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Pham
Van Nhat, Hoang Thi Minh Hien, Ngo Thi Hoai Thu, Dang Diem Hong, Different
fermentation strategies by Schizochytrium mangrovei strain PQ6 to produce feedstock for
exploitation of squalene and omega-3 fatty acids. Journal of Phycology, 2018, 54 (4), 550556 (SCI, Q1; IF-3,0).
Nguyễn Cẩm Hà, Hoàng Thị Minh Hiền, Đặng Diễm Hồng, Cơ chế giảm cholesterol của
squalene tách chiết từ Schizochytrium mangrovei PQ6. Báo cáo toàn văn tại Hội thảo
Khoa học công nghệ sinh học toàn quốc 2018 tại Trung tâm Hội nghị quốc gia Hà Nội
26.10.2018, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ; 2018, 589-594.
Nguyen Cam Ha, Hoang Thi Minh Hien, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Dang
Diem Hong, Optimization of fermentation conditions for squalene production by
heterotrophic marine microalgae Schizochytrium mangrovei. Academia Journal of
Biology, 2017, 39(3), 449-458.
Hoang Thi Minh Hien, Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Dang Diem Hong, Squalene
promotes cholesterol homeostasis in macrophage and hepatocyte cells via activation of
liver X receptor (LXR) α and β. Biotechnology Letters, 2017, 39 (8), 1101-1107 (SCI, Q2;
IF-1,7).
Đặng Diễm Hồng, Nguyễn Cẩm Hà, Lê Thị Thơm, Lưu Thị Tâm, Hoàng Thị Lan Anh,
Ngô Thị Hoài Thu, Nhiên liệu sinh học từ vi tảo biển dị dưỡng của Việt Nam: Biodiesel và
tận thu các sản phẩm phụ (acid béo không bão hòa đa nối đôi - PUFAs, glycerol và
squalene) trong quá trình sản xuất biodiesel. Tạp chí Sinh học, 2017, 39 (1), 51-60.
Nguyen Cam Ha, Le Thi Thom, Hoang Thi Huong Quynh, Pham Van Nhat, Hoang Thi
Lan Anh and Dang Diem Hong, Extraction of squalene from Vietnam heterotrophic
marine microalga. Proceeding of The 4 the Academic conference on natural Science for

nhiên, việc khai thác quá mức làm ảnh hưởng đến sự bảo tồn nguồn lợi cá biển trong tự nhiên, cũng như sự phụ
thuộc vào thổ nhưỡng, mùa vụ của các loại cây trồng có dầu dẫn đến nguồn khai thác squalene đang bị giảm sút.
Trong khi đó, hiện nay nhu cầu về squalene trong các ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm đang ngày càng
tăng. Do vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới thay thế nguồn truyền thống để tách chiết
squalene là rất cần thiết và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Trong đó, vi
sinh vật nói chung và vi tảo biển nói riêng là một nguồn tiềm năng cho sản xuất squalene trên quy mô lớn. Gần đây,
một số các loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) như thraustochytrids được xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng
để sản xuất các chất có giá trị cao trong đó có squalene. Tuy nhiên, việc nghiên cứu squalene ở Việt Nam mới được
bắt đầu từ 2012, kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc cung cấp cơ sở khoa học ban đầu về hàm lượng
squalene từ một số chủng vi tảo, chưa có được các phương pháp tối ưu cho tách chiết, làm giàu và tinh sạch
squalene; chưa có được điều kiện nuôi trồng tối ưu vi tảo tiềm năng có sức sản xuất sinh khối có hàm lượng
squalene cao; chưa có được quy trình công nghệ tạo chế phẩm squalene có hoạt tính sinh học bảo đảm an toàn cho
sử dụng theo định hướng làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm ở Việt Nam. Chính vì vậy, với
mục tiêu lớn là cung cấp được các sản phẩm giàu squalene phục vụ cho sức khỏe cộng đồng từ nguồn tài nguyên
thiên nhiên sẵn có trong nước trong đó có vi tảo, chúng tôi mong muốn thực hiện đề tài “Nghiên cứu squalene từ vi
tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ
phẩm và dược phẩm”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
- Sàng lọc và xác định được điều kiện nuôi trồng thích hợp của chủng Schizochytirum mangrovei PQ6 của
Việt Nam tiềm năng lựa chọn được cho sản xuất squalene.
- Xác định điều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ sinh khối chủng S. mangrovei PQ6 lựa
chọn được; đánh giá độ an toàn và tác dụng sinh học, dược lý của squalene tách chiết được theo định hướng làm
nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
- Sàng lọc được chủng/loài vi tảo biển của Việt Nam tiềm năng cho sản xuất squalene từ một số chủng vi
tảo biển Việt Nam
- Tối ưu điều kiện nuôi cấy để thu được sinh khối tảo có hàm lượng squalene cao ở chủng tiềm năng lựa
chọn được ở quy mô bình tam giác; bình lên men 30 Lít.
- Tối ưu điều kiện tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene từ sinh khối chủng vi tảo biển lựa chọn được;
xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene; xác định độ sạch và cấu trúc của squalene tách chiết được.

Bình Định năm 2013-2014, chủng S. mangrovei PQ6 phân lập ở Huyện đảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang năm 20062008 được sử dụng cho nghiên cứu.
2.1.2. Các bộ kit sinh phẩm: Kit tinh sạch sản phẩm PCR (Genjet Purification, Thermo ScientificTM (EU)), kit tách
chiết ARN tổng số RNAiso Plus (Takara, Tokyo, Nhật Bản), kit tổng hợp cDNA (RevertAid First Strand cDNA Thermo Fisher Scientific Inc., Singapore) đã được sử dụng trong nghiên cứu. Trình tự các cặp mồi nhân các gen
(CYP7A1, LDL-R, ABCA-1, LXRα, ABCA-1, ABCG-1, ApoE, LXRß GADPH) do Phòng Công nghệ tảo, Viện
Công nghệ sinh học thiết kế.
2.1.3. Động vật thí nghiệm: Chuột cống trắng, chuột nhắt trắng do Ban động vật thí nghiệm - Học Viện Quân Y
cung cấp.
2.1.4. Các dòng tế bào: Dòng tế bào gan người HepG2 và tế bào đại thực bào từ chuột RAW264.7 có nguồn gốc từ
ngân hàng Tế bào sống, trường Đại Học Seoul, Hàn Quốc và do GS. TS. Sung-Joon Lee, Trường Đại học Korea,
Hàn Quốc tặng.
2.1.5. Hóa chất: Các hóa chất sử dụng là các hóa chất thông dụng trong phòng thí nghiệm, đạt độ tinh khiết cần
thiết cho các nghiên cứu.
2.1.6. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm: Sử dụng các máy móc và thiết bị thông dụng trong phòng thí nghiệm.
2.1.7. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường giữ giống và cấy chuyển chi Schizochytrium: ký hiệu GPY bao gồm glucose (2 g/L),
polypepton (1 g/L), cao nấm men (0,5 g/L), muối biển nhân tạo (17,5 g/L), agar (15 g/L).
- Các chủng tảo thuộc chi Schizochytrium được nuôi trong các bình tam giác 1.000 mL chứa 300 mL môi
trường M1, chế độ lắc 200 vòng/phút ở 25-28oC.


6
- Chủng tảo thuộc chi Thraustochytrium được nuôi trên môi trường Bajpai cải tiến, chế độ lắc 200 vòng/
phút ở 25-28oC.
- Môi trường nuôi trồng Schizochytrium spp. trong bình lên men 30L gồm Môi trường M12 cho lên men
theo mẻ (9% glucose, 1% cao nấm men, muối biển nhân tạo 17,5 g/L); Môi trường sử dụng để nhân giống cấp 1
(CNT1), giống cấp 2 (CNT2), cho lên men theo mẻ (CNT3) có bổ sung cơ chất gồm: Môi trường CNT1 (%):
glucose - 3, cao nấm men -0,4, monosodium glutamate- 6,42, NaCl - 1,25, MgSO4 - 0,4, KCl - 0,05, CaCl2 - 0,01,
NaHCO3 - 0,05, KH2PO4 - 0,4, hỗn hợp vitamin - 0,14 (vitamin B1 - 45 g/L, vitamin B6 - 45 g/L và vitamin B12 0,25 g/L) và vi lượng - 0,8; Môi trường CNT2 (%) gồm: glucose - 8,57, cao nấm men - 0,64, monosodium
glutamate - 6,42, NaCl - 2, KH2PO4 - 0,64, MgSO4 - 2,29, CaCl2 - 0,03, NaHCO3 - 0,03, Na2SO4 - 0,03, hỗn hợp
vitamin - 0,14, và vi lượng - 0,2; Môi trường CNT3 (%) gồm: glucose- 7,5, cao nấm men - 1,2, monosodium

các bình nuôi 1 L có chứa 300 mL môi trường M1, lắc ở 200 v/p, nhiệt độ nuôi 28C trong thời gian 96 h.
- 2% giống cấp 1 được bổ sung vào bình lên men 30 L chứa 15 L môi trường M12 với nồng độ glucose thay
đổi từ 3, 6, 9, 12, 22%. Sau 24, 48, 72, 96 và 120 h lên men, tiến hành thu mẫu, chụp ảnh hình thái tế bào, đếm
MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng lipid và squalene.
Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ: 2% giống cấp 1 được bổ sung vào bình lên men 30 L chứa 15 L môi
trường M12 với nguồn nitơ là 1% cao nấm men hoặc kết hợp 1,2% cao nấm men (Y) và 6,42% monosodium
glutamate (YM). Sau 24, 48, 72, 96 và 120 h lên men, tiến hành thu, chụp ảnh hình thái tế bào, đếm MĐTB, xác
định SKT, SKK, hàm lượng đường dư và squalene.
Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch):


7
- Giống cấp 1: Khuẩn lạc S. mangrovei PQ6 được cấy chuyển sang bình nuôi 500 mL có chứa 200 mL môi
trường CNT1, nuôi lắc ở 28oC, 200 v/p trong 24 h.
- Giống cấp 2: 1% giống cấp 1 được bổ sung vào bình tam giác 2 L có chứa 1 L môi trường CNT2, nuôi lắc
ở 28oC, 200 v/p trong 24 h.
- 2% giống cấp 2 được bổ sung vào bình lên men 30 L có chứa 15 L môi trường CNT3. Tại thời điểm 48 h,
bổ sung glucose đến nồng độ 22%. Sau 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 và 108 h, thu mẫu, đếm MĐTB, xác định
SKT, SKK, hàm lượng đường dư và squalene.
Nghiên cứu ảnh hưởng của vitamin trong lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất
- Giống cấp 1: Khuẩn lạc S. mangrovei PQ6 được cấy chuyển sang bình nuôi 500 mL có chứa 200 mL môi
trường CNT1, nuôi lắc ở 28oC, 200 v/p trong 24 h.
- Giống cấp 2: 1% giống cấp 1 được bổ sung vào bình tam giác 2 L có chứa 1 L môi trường CNT2, có hoặc
không có bổ sung 0,14% hỗn hợp vitamin, nuôi lắc ở 28oC, 200 v/p trong 24 h.
- 2% giống cấp 2 được bổ sung vào bình lên men 30 L có chứa 15 L môi trường CNT3 có hoặc không có bổ
sung 0,4% hỗn hợp vitamin. Sau 12, 24, 36, 48 h xác định hàm lượng đường dư trong môi trường nuôi. Khi hàm
lượng đường dư nhỏ hơn 2% thì bổ sung glucose để đạt nồng độ 22%. Sau khi bổ sung glucose 12, 24, 36, 48, 60,
72, 84, 96, và 108 h tiến hành thu mẫu, đếm MĐTB, xác định SKT, SKK, hàm lượng đường dư và squalene.
2.2.2. Nhóm phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch squalene từ S. mangrovei PQ6
2.2.2.1. Phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ sinh khối S. mangrovei PQ6



8
- Nghiên cứu độc tính cấp của squalene theo phương pháp của Litchfield - Wincoxon (Đỗ Trung Đàm, 2014), quy
định của Bộ Y tế Việt Nam (2018), hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD) (2002) và Tổ
chức Y tế thế giới (2000).
- Đánh giá độc tính bán trường diễn: qui định của Bộ Y tế Việt Nam (2018), hướng dẫn của Tổ chức Hợp tác và
Phát triển Kinh tế (OECD) (2000) và Tổ chức Y tế thế giới (2000).
- Tác dụng làm tăng HDL-C của squalene trên chuột nhắt trắng được tiến hành đánh giá theo phương pháp được
mô tả bởi Clara Gaba´s-Rivera và cộng sự (Đỗ Trung Đàm, 2006).
2.2.4.2. Nhóm phương pháp đánh giá bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ
S. mangrovei PQ6 trên mô hình in vitro
- Tế bào HepG2 và RAW264.7 được nuôi cấy trên môi trường DMEM/high glucose có chứa 10% FBS, 100 U/mL
penicillin, và 0,1 mg/mL streptomycin trong tủ nuôi cấy vô trùng ở 37C, 5% CO2.
- Độc tính của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên tế bào HepG2 được phân tích theo phương pháp MTT.
- Nhuộm lipid bằng Oil red O (ORO) theo phương pháp của Hoang và cộng sự (2012).
- Tách chiết lipid nội bào.
- Hàm lượng cholesterol và triglyceride nội bào được xác định bằng phương pháp enzyme
- Tách chiết RNA tổng số (theo kit RNAiso PlusTakara - Tokyo, Nhật Bản), tổng hợp cDNA (theo kit RevertAid
First Strand cDNA - Thermo Fisher, Scientific Ins., Singapore). Các cDNA sau đó được sử dụng như khuôn mẫu
cho phản ứng qPCR. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase được sử dụng để chuẩn hóa số liệu.
2.2.5. Thống kê phân tích số liệu
Số liệu được trình bày bằng số trung bình ± sai số chuẩn. Sự sai khác được coi là có ý nghĩa thống kê ở
mức P
3.2.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ terbinafine lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác
TBNF là một chất ức chế enzyme squalene monooxygenase trong con đường sinh tổng hợp sterol. Enzyme
này có vai trò xúc tác quá trình oxy hóa squalene thành 2,3 oxidosqualene trong sự có mặt của phân tử ôxy và
NADH (Ono 2002; Ryder và cs, 1992). Việc bổ sung TBNF từ 0,1 lên 200 µg/mL vào môi trường làm giảm đáng
kể MĐTB và lượng SKK sau 5 ngày nuôi. Tuy nhiên, hàm lượng lipid và squalene lại tăng lên đáng kể. Hàm lượng
squalene thay đổi không đáng kể khi tăng nồng độ TBNF lên 10 lần (0,1-1 µg/mL). Khi tăng nồng độ TBNF lên
1000 lần (100 g/mL), hàm lượng squalene đạt cực đại (97,34 ± 1,97) mg/g SKK sau 5 ngày nuôi.
3.2.1.5. Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp vitamin lên sinh trưởng và hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác
Nghiên cứu của Pora và cộng sự (2014) cho thấy các vitamin như B1, B6 và B12 có tác dụng làm tăng sản
xuất squalene trong nuôi cấy tảo Schizochytrium. Khi nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp các vitamin này với nồng độ 00,6% lên quá trình tổng hợp squalene của chủng PQ6 đã cho thấy, sinh trưởng và hàm lượng squalene của chủng
này đạt cao nhất khi bổ sung tổ hợp vitamin ở nồng độ 0,4 và 0,6%. Do không có sự khác biệt đáng kể giữa 2 nồng
độ này, nên nồng độ 0,4% được lựa chọn cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo. Sau 6 ngày nuôi cấy, SKK và
hàm lượng squalene của chủng PQ6 đạt được cao nhất khi bổ sung 0,4% tổ hợp vitamin tương ứng là (39,98 ±
0,35) g/L và (76, 16 ± 2,34) mg/g SKK (tăng 34,43% so với đối chứng không bổ sung vitamin).
3.2.2. Tối ưu điều kiện nuôi trồng chủng S. mangrovei PQ6 ở bình lên men 30 lít để thu sinh khối tảo giàu
squalene
3.2.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi
trồng theo mẻ trong hệ thống bình lên men 30 L
Nồng độ glucose ban đầu có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và khả năng tích lũy squalene của loài A.
mangrovei (tên trước đây là S. mangrovei) đã được chứng minh trong các nghiên cứu của Fan và cs (2010),
Nakazawa và cộng sự (2012). Kết quả đạt được khi nuôi chủng PQ6 ở bình lên men 30 L với nồng độ glucose từ 322% đã cho thấy MĐTB, SKK và sản lượng squalene của chủng PQ6 tăng mạnh khi nồng độ glucose tăng từ 3 đến
9%. Với nồng độ glucose ban đầu là 9% cho lượng SKK và lượng squalene đạt giá trị cao nhất. Lượng SKK và
squalene đạt giá trị cực đại tương ứng là (35,5 ± 0,1) g/L và (1,1 ± 0,1) g/L. Kích thước tế bào đồng đều ở nồng độ
6% - 9% glucose và lớn hơn so với nồng độ cao là 12% và 22% glucose. Do vậy, nồng độ glucose ban đầu là 9%
được lựa chọn để nuôi trồng chủng PQ6 bằng hệ thống lên men 30 L theo mẻ.
3.2.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng
theo mẻ trong hệ thống lên men 30 L
Khi kết hợp cả hai nguồn nitơ là cao nấm men và monosodium glutamate, MĐTB, SKK và sản lượng
squalene đạt cực đại, tương ứng là (3,3 x 108) tế bào/mL, 46,7 g/L và 1,6 g/L sau 72 h nuôi cấy. Hàm lượng
squalene không có sự thay đổi đáng kể khi sử dụng nguồn nitơ là cao nấm men hoặc kết hợp cả cao nấm men và


3.3. Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene từ S. mangrovei PQ6
3.3.1. Tối ưu điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ S. mangrovei PQ6
3.3.1.1. Tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S. mangrovei PQ6
Các điều kiện thích hợp cho quá trình tách chiết lipid tổng số của S. mangrovei PQ6 là sinh khối ban đầu
sấy ở 80oC đến độ ẩm 3%, sử dụng dung môi n-hexane, nhiệt độ tách chiết 70-75oC, khuấy liên tục trong thời gian
4 giờ, chiết 1 lần với tỷ lệ sinh khối: dung môi là 1:8 (w/v).
3.3.1.2. Tách chiết lipid không xà phòng hóa- lipid KXPH từ lipid tổng số
Trong các tỷ lệ khảo sát của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform là 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 và 5:1, hàm
lượng squalene trong lipid KXPH ở tỷ lệ 2:1 đạt cao nhất là (8,1 ± 0,14)%.
3.3.1.3. Tinh sạch và định lượng squalene bằng sắc ký mỏng và sắc kỷ lỏng cao áp
Kết quả chỉ ra trên Hình 3.15 A cho thấy mẫu lipid KXPH tách chiết từ chủng PQ6 xuất hiện băng tương
đồng với squalene chuẩn. Định lượng bằng HPLC, hàm lượng squalene khoảng (50,10 ± 0,03) mg/g SKK.
Squalene tách chiết được có độ tinh sạch cao (98,6%) (Hình 3.15 B). Hàm lượng squalene thu được bằng
phương pháp này cao hơn Aurantiochytrium limacinum 9F-4a (0,6 mg/g SKK), 4W-1b (0,5 mg/g SKK),
Schizochytrium limacinum SR21 (0,2 mg/g) nhưng lại thấp hơn A. limacinum SR21 (171,1 mg/g SKK) (Nakazawa
và cộng sự (2012).
A
B

Hình 3.15. Sắc ký lớp mỏng mẫu lipid không xà phòng hóa (A) và sắc kí
đồ squalene tinh sạch từ sinh khối chủng PQ6 (B)
(A: giếng 1: squalene chuẩn - 2 mg; giếng 2, 3, 4, 5, 6, 7: lipid KXPH tách từ
sinh khối chủng PQ6)


11
3.3.1.4. Tách chiết, tinh sạch và làm giàu squalene bằng phương pháp dung môi
Do hàm lượng squalene thu được sau khi sử dụng phương pháp TLC và HPLC thấp nên đã tiến hành làm
giàu squalene theo mô tả của Choo và cộng sự (2005) bằng phương pháp dung môi. Hàm lượng squalene đã tăng

3.3.3. Tách chiết và tinh chế lượng lớn squalene từ S. mangrovei PQ6
Với quy trình đã xây dựng ở trên (Hình 3.26), từ 46 L dịch lên men (khoảng (3,9 ± 0,1) kg SKK) đã tách
chiết được (1,08 ± 0,29) kg squalene thô, tinh chế được khoảng 131 mL squalene tinh khiết ở dạng dịch lỏng không


12
màu, không mùi, có hàm lượng squalene là (305,23 ± 2,34) g (Hình 3.27). Kết quả phân tích sắc ký HPLC cho thấy
squalene thu được có độ tinh sạch cao (chiếm từ 90-95%; Hình 3.28) và không bị tạp nhiễm.
Phân tích phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3), phân tích khối phổ 13C NMR (125 MHz, 140 CDCl3) (Hình
3.29) và so sánh với squalene chuẩn (Pouchert và Behnke, 1993), có thể khẳng định đã tách được squalene từ
VTBDD S. mangrovei PQ6.
3.3.4. Phân tích các chỉ tiêu về cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim loại của squalene tách chiết từ S. mangrovei
PQ6
Kết quả phân tích chất lượng squalene tách chiết được tại Trung tâm Chứng nhận phù hợp (Quacert),
Trung tâm Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng, Bộ KH và CN đã cho thấy squalene đạt yêu cầu chất lượng để làm
nguyên liệu cho định hướng sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm: dạng lỏng, không màu,
không mùi; chỉ số acid- 0,524 mgKOH/g; chỉ số peroxyt- 4,2 Meq O2/kg, không có chứa dư lượng urê, các chỉ tiêu
về kim loại nặng đều nằm trong giới hạn cho phép.
B
A

Hình 3.27. Ảnh minh họa sản
phẩm squalene thô (A), squalene
tinh sạch và hỗn hợp acid béo
(B) tách từ dịch lên men theo mẻ
có bổ sung cơ chất từ sinh khối
tảo chủng PQ6

Hình 3.28. Sắc ký đồ HPLC của squalene
chuẩn (A) và squalene (B) tinh sạch từ

tổn thương tế bào gan và không ảnh hưởng đến chức năng gan, không ảnh hưởng lên chức năng thận của chuột
trong nghiên cứu.
Kết quả giải phẫu mô bệnh gan, thận, lách cũng cho thấy không xuất hiện bất cứ tổn thương nào ở các cơ
quan này ở chuột được uống với liều 400 và 1.200 mg/kg KLCT/ngày sau 60 ngày dùng liên tục.
3.4.3. Tác dụng dược lý của squalene trên chuột nhắt trắng thí nghiệm
Để làm rõ hơn tác dụng của squalene khi làm tăng chỉ số HDL-C trong máu chuột, khối lượng cơ thể, cân
nặng gan, và các chỉ số lipid máu chuột nhắt trắng thí nghiệm đã được đánh giá. Với liều 600 mg/kg/ngày và liều
1.200 mg/kg/ngày, uống liên tục trong 60 ngày, squalene có tác dụng làm tăng hàm HDL-C và tỷ lệ HDLC/cholesterol toàn phần trong máu, làm giảm hàm lượng LDL-C và VLDL-C trong máu và không ảnh hưởng đến
các chỉ số cholesterol toàn phần và TG máu, cân nặng gan và sự phát triển cân nặng cơ thể. Kết quả thu được tương
tự với các nghiên cứu của Pallavi và cộng sự (2013), Gabas-Rivena và cộng sự (2014).
3.5. Bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô
hình in vitro
3.5.1. Đánh giá độc tính của squalene trên các dòng tế bào
Kết quả đánh giá độc tính của squalene trên 2 dòng tế bào HepG2 và RAW264.7 đã cho thấy squalene
không gây độc ở tất cả các nồng độ thử nghiệm. Khoảng 95 đến 100% tế bào vẫn sinh trưởng bình thường sau khi
bổ sung squalene trong 72 h.
3.5.2. Tác dụng giảm lipid của squalene lên tế bào gan và tế bào đại thụ thể
3.5.2.1. Tối ưu hóa thời gian và nồng độ ủ squalene lên sự thay đổi hàm lượng lipid trong tế bào gan HepG2
Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của thời gian ủ và nồng độ squalene lên sự thay đổi nồng độ lipid trên dòng
tế bào HepG2 bị rối loạn chuyển hóa đã cho thấy, hàm lượng TG trong tế bào HepG2 được ủ với acid oleic (OA)
và acid palmitic (PA) đều tăng 85% so với đối chứng không được ủ với acid. Sau 72 h ủ với squalene ở các nồng
độ 20, 50 và 100 M, sự tích lũy lipid nội bào của HepG2 giảm 20% so với đối chứng. Do đó, nồng độ 50 và 100
M squalene được sử dụng để xử lý tế bào trong các thí nghiệm tiếp theo trong thời gian 72 h.
3.5.2.2. Tác dụng của squalene lên sự thay đổi hàm lượng lipid nội bào trong tế bào gan HepG2 và RAW64.7
Ủ tế bào HepG2 với 100 M squalene đã làm giảm cholesterol và trigyceride từ 100% trong tế bào đối
chứng xuống tương ứng 80% (P < 0,05) và 65% (P
Như vậy, không giống như các chất kích hoạt thụ thể LXR bằng phương pháp tổng hợp hóa học, squalene
tách chiết từ S. mangrovei PQ6 có thể kích hoạt một cách chọn lọc các gen đích của LXR mà không gây ra sự tổng
hợp lipid trong tế bào gan. Từ kết quả trên, sơ đồ cơ chế tác dụng giảm cholesterol và tác dụng giảm triglycerid của
squalene đã được đưa ra (Hình 3.39).
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Lựa chọn được chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong số 32 chủng Schizochytrium spp. và 8 chủng
Thraustochytrium spp. từ Bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ Tảo, Viện Công nghệ Sinh học có khả năng tổng
hợp squalene cao nhất (đạt 102,01 mg/g sinh khối khô).
2. Điều kiện thích hợp cho sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 khi nuôi ở bình tam giác
là 28oC, nồng độ glucose 3%, cao nấm men 1% và bổ sung tebinafine với nồng độ 100 g/mL.


15
3. Điều kiện thích hợp cho sinh trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6 khi nuôi ở bình lên men
30 lít tự tạo là lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất; môi trường nuôi cấy được bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin
(vitamin B1 - 45 g/L, vitamin B6 - 45 g/L và vitamin B12 - 0,25 g/L) với nguồn nitơ là 1,2% cao nấm men và 6,42%
monosodium glutamate; thời gian tối ưu để bổ sung glucose là tại thời điểm 36 giờ và tiến hành thu sinh khối tảo
sau 48 giờ bổ sung glucose, mật độ tế bào tảo đạt (369,35 ±7,94) x 106 tế bào/mL; sinh khối khô đạt (75,41± 1,35)
g/L, hàm lượng squalene đạt (93,53 ± 2,45) mg/g sinh khối khô và sản lượng squalene đạt (6928,6± 14,6) mg/L.
4. Đã xây dựng được quy trình tách chiết và tinh sạch squalene ở quy mô nhỏ và quy mô pilot từ sinh khối chủng S.
mangrovei PQ6. Từ 46 L dịch lên men (tương đương 3,9 ± 0,1 kg sinh khối khô), squalene tinh khiết có hàm lượng
(305,23±2,34)g với độ tinh sạch đạt 90-95%, đảm bảo yêu cầu chất lượng theo định hướng làm nguyên liệu cho
thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm.
5. Những thử nghiệm độc tính cấp và bán trường diễn trên mô hình động vật thực nghiệm cho thấy squalene tách
chiết từ S. mangrovei PQ6 là không độc. Sau 60 ngày sử dụng liên tục, chuột đuợc uống squalene với liều 400 và
1.200 mg/kg khối lượng cơ thể chuột/ngày đảm bảo an toàn, không làm thay đổi các chỉ tiêu huyết học, sinh hoá,
không gây tổn thương tế bào và chức năng gan, thận và lách của chuột thực nghiệm so với công thức đối chứng.
6. Trên mô hình in vivo và in vitro đã cho thấy squalene có tác dụng tăng lipoprotein có tỷ trọng cao gắn với
cholesterol và tỷ lệ HDL-cholesterol/cholesterol toàn phần trong máu; có tác dụng giảm cholesterol và tryglyceride