VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HOÀNG THỊ LAN ANH

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI
TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM
MANGROVEI PQ6

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI, 2014


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hoàng Thị Lan Anh

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ
KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA CHỦNG VI TẢO BIỂN
DỊ DƯỠNG SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 01 16
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Đặng Diễm Hồng
Viện Công nghệ sinh học

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên
cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn
thành luận án của mình.

Hà Nội, ngày

tháng năm 2014

Tác giả

Hoàng Thị Lan Anh


ii

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được
công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các
đồng tác giả;
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2014


3

1.1.2.

Kĩ thuật phân lập và định tên

6

1.1.2.1.

Kĩ thuật phân lập

6

1.1.2.2.

Các kĩ thuật định tên

7

1.2.

Các axít béo không bão hòa đa nối đôi omega-3 (-3 PUFA)

8

1.2.1.

Giới thiệu chung về -3 PUFA


14

PUFA ở Schizochytrium
1.3.2.1.

Ảnh hưởng của nguồn C và N

14

1.3.2.2.

Ảnh hưởng của nồng độ muối

16

1.3.2.3.

Ảnh hưởng của nhiệt độ

17

1.3.3.

Con đường sinh tổng hợp DHA ở chi Schizochytrium

20

1.4.


31

1.5.3.

Sản xuất dầu sinh học giàu omega-3

32

1.5.4.

Sản xuất nhiên liệu sinh học

33

1.6.

Tình hình nghiên cứu vi tảo biển dị dƣỡng ở Việt Nam

34

27
27

Chƣơng II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

37

2.1.

Vật liệu


38

2.3.

Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

38

2.4.

Môi trƣờng

39

2.5.

Phƣơng pháp nghiên cứu

40

2.5.1.

Phân lập chi Schizochytrium

40

2.5.2.

Chụp ảnh hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM)


42

2.5.3.5.

Xác định trình tự gen

44

2.5.4.

Xác định sinh trưởng của các chủng Schizochytrium spp.

44


v

2.5.5.

Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng
Schizochytrium spp.

45

2.5.6.

Xác định hàm lượng lipít trong sinh khối tảo

45

47

2.5.10.2.

Nghiên cứu độc tính bán trường diễn

47

2.5.11.

Nghiên cứu hiệu lực của chế phẩm Algal Omega- 3

49

2.5.11.1.

Xác định phản xạ tìm kiếm thức ăn trong mê lộ

49

2.5.11.2.

Nghiên cứu trên mô hình phản xạ tránh shock chủ động có điều kiện

49

2.5.11.3.

Nghiên cứu trên mô hình gây suy giảm năng lực tâm thần kinh


2.5.12.4.

Sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 làm giàu Artemia làm thức ăn
cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790)

53

2.5.12.5.

Nghiên cứu sử dụng sinh khối S. mangrovei PQ6 làm giàu Artemia

56

làm thức ăn cho ấu trùng cua xanh (Scylla serrata Forskal, 1775)
2.6.

Xử lý số liệu

57


vi

Chƣơng III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.

Đặc điểm sinh học của các đại diện thuộc chi vi tảo biển

58
58


Một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng tiềm năng

63

3.1.3.3.

Phân tích hàm lượng lipít, axít béo tổng số và DHA của các chủng tiềm
năng

68

3.1.3.4.

Bảo quản giống

70

3.1.4.

Phân loại các chủng tiềm năng

72

3.1.4.1.

So sánh một số đặc điểm hình thái của các chủng tuyển chọn với một số

72



87

3.2.4.

Phân tích thành phần dinh dưỡng sinh khối vi tảo thu được

89

3.3.

Bƣớc đầu sử dụng sinh khối chủng PQ6 trong sản xuất viên thực
phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản

90


vii

3.3.1.

Sản xuất viên Algal Omega- 3 từ sinh khối khô chủng PQ6

90

3.3.1.1.

Quy trình tạo viên Algal Omega-3

90


119

Artemia làm thức ăn sống cho ấu trùng cá Chẽm (Lates calcarifer
Bloch, 1790)

Chƣơng IV. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

121

4.1.

Đặc điểm sinh học của các chủng Schizochytrium đã phân lập

121

4.2.

Nuôi trồng chủng tiềm năng PQ6 ở các hệ thống lên men

127

4.3.

Sử dụng sinh khối chủng PQ6 làm thực phẩm chức năng và nuôi trồng
thủy sản

135

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ


Algal Omega- 3

Algal Omega- 3

ALT

Alanine aminotransferase

Alanine aminotransferase

AST

Aspartate aminotransferase

Aspartate aminotransferase

ASTM

American Society for Testing and

Hiệp hội vật liệu và thử nghiệm Hoa

Materials

Kỳ

CCT

Chuột cống trắng


Axít docosapentaeoic

E.coli

Escherichia coli

Vi khuẩn E.coli

EPA

Eicosapentaenoic acid (C20:5-3)

Axít eicosapentaenoic

FAME

Fatty acid methyl ester

Các axít béo dạng methyl ester

GPYc

Glucose-Polypepton- Yeast

Môi trường phân lập Schizochytrium

extract- chloramphenicol

gồm glucose-polypepton- cao nấm


Lauria Betani

Môi trường LB

LCPUFA

Long Chain Polyunsaturated Fatty

Axít béo không bão hòa mạch dài đa

Acid

nối đôi

Lethal dose

Liều gây chết 50% số động vật thực

LD50

nghiệm
MĐTB

Mật độ tế bào

Mật độ tế bào

MUFA


Scanning electron microscope

Kính hiển vi điện tử quét

SFA

Saturated fatty acid

Axít béo bão hòa

TFA

Total fatty acid

Axít béo tổng số

TLS

Tỷ lệ sống

Tỷ lệ sống

VTBDD

Vi tảo biển dị dưỡng

Vi tảo biển dị dưỡng


x

Bảng 2.1.

Thời gian và địa điểm thu mẫu

37

Bảng 2.2.

Sơ đồ thí nghiệm nuôi và làm giàu luân trùng

53

Bảng 2.3.

Sự tương quan giữa mật độ (cá thể/ml) với thức ăn A1 DHA Selco

54

Bảng 3.1.

Một số đặc điểm của vị trí thu mẫu

58

Bảng 3.2.

Sinh trưởng và hàm lượng lipít tổng số của các chủng thuộc chi

60


Bảng 3.7.

Sự thay đổi thành phần và hàm lượng các axít béo trong sinh khối

85

chủng PQ6 nuôi trong bình lên men 30 lít thu tại các thời điểm khác
nhau
Bảng 3.8.

Thành phần dinh dưỡng, và kim loại nặng trong sinh khối chủng
PQ6 (% KLK)

89


xi

Bảng 3.9.

Thành phần dinh dưỡng của viên Algal Omega-3 (% KLK)

91

Bảng 3.10.

Các chỉ tiêu lý hoá, vi sinh và kim loại nặng của viên Algal Omega-3

92



101

điều kiện ở chuột cống trắng
Bảng 3.16.

Thời gian đáp ứng phản xạ của chuột nhắt trắng non trong thử

101

nghiệm nhảy khỏi phiến nóng
Bảng 3.17.

Hàm lượng lipit và axít béo ở Artemia sau khi làm giàu bằng sinh

104

khối khô chủng PQ6 với các nồng độ khác nhau
Bảng 3.18.

Hàm lượng lipit và axít béo ở luân trùng sau khi làm giàu bằng sinh

107

khối khô chủng PQ6 với các nồng độ khác nhau
Bảng 3.19.

Thành phần axit béo của Artemia ở các lô thí nghiệm làm giàu bằng

111


3

Hình 1.2.

Chu trình sống của các chi đại diện thuộc ngành Labyrinthulomycota

4

Hình 1.3.

Cấu trúc hoá học của DHA và EPA

9

Hình 1.4.

Con đường tổng hợp PUFA ở động vật có vú, thực vật và chi

22

Schizochytrium
Hình 3.1.

Khuẩn lạc nuôi cấy trên đĩa thạch (A) và chụp dưới kính hiển vi

59

quang học (B, độ phóng đại 100 X) của chủng Schizochytrium sp.
PQ6, PQ7, TH16 và TB17


Hình 3.6.

Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng

65

Hình 3.7.

Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng

66

Hình 3.8.

Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng

67

Hình 3.9.

Ảnh hưởng của pH môi trường lên sinh trưởng

68

Hình 3.10.

Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số và PCR nhân một phần gen 18S

74

xiii

Hình 3.15.

Hình thái tế bào chủng PQ6 trong bình lên men 5 lít (A), 10 lít (B) ở

82

các giai đoạn nuôi cấy khác nhau
Hình 3.16.

Sinh trưởng của chủng PQ6, sự thay đổi pH và hàm lượng glucose

83

còn lại trong môi trường nuôi trong bình lên men 30 lít
Hình 3.17.

Ảnh chụp tế bào chủng PQ6 nuôi ở bình 30 lít tự tạo ở các thời điểm

84

khác nhau dưới kính hiển vi quang học (A) và kính hiển vi huỳnh
quang (B) sau khi nhuộm Nile Red
Hình 3.18.

Sơ đồ quy trình nuôi theo mẻ chủng PQ6 trong bình lên men 30 lít

87



120

và Artemia được làm giàu bằng sinh khối chủng PQ6 và A1 DHA
Selco
Hình 3.24.

Tăng trưởng về chiều dài của cá Chẽm giai đoạn 3 ngày tuổi đến 1
tháng tuổi khi ăn bằng luân trùng và Artemia làm giàu bằng sinh khối
chủng PQ6 và A1 DHA Selco

120


1

MỞ ĐẦU
Được coi là nền công nghiệp mang lại hàng tỷ đô la hàng năm, công nghệ sinh
học vi tảo ngày càng mở ra nhiều lĩnh vực nghiên cứu mới. Mặc dù vậy, việc sử dụng
vi tảo nhằm tăng cường giá trị dinh dưỡng của thực phẩm cho con người và thức ăn
cho động vật vẫn là những lĩnh vực chiếm ưu thế, mang lại lợi nhuận cao và có một
lịch sử phát triển tương đối lâu dài.
Schizochytrium là một chi vi tảo biển dị dưỡng phân bố rộng rãi trong hệ sinh
thái biển và rừng ngập mặn. Chúng đóng vai trò là những sinh vật phân huỷ, mắt
xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn ở những hệ sinh thái nói trên. Loại vi tảo này có
khả năng tích lũy hàm lượng cao lipit (có thể lên tới 70% khối lượng khô) và các axít
béo không bão hoà thuộc nhóm omega-3 (-3 PUFA) như axít eicosapentaenoic
(EPA, C20: 5-3), axít docosahexaenoic (DHA, C22: 6-3). Những tác động tích
cực cũng như tầm quan trọng của các -3 PUFA này đã được chứng minh ở nhiều
khía cạnh như sự phát triển toàn diện của trẻ nhỏ, sức khỏe đối với hệ tim mạch, hệ

biển, vùng rừng ngập mặn ở Việt Nam;
 Nghiên cứu đặc điểm sinh học cơ bản của một số chủng tiềm năng đã phân
lập;
 Nuôi trồng Schizochytrium mangrovei PQ6 trong các hệ thống lên men khác
nhau (5, 10 và 30 lít);
 Sản xuất viên Algal Omega- 3 từ sinh khối Schizochytrium mangrovei PQ6,
đánh giá tính an toàn và hiệu lực của chế phẩm này trên động vật thực
nghiệm;
 Sử dụng sinh khối Schizochytrium mangrovei PQ6 làm giàu Artemia và luân
trùng (Brachionus plicatilis) để ương nuôi ấu trùng cua xanh (Scylla serrate
Forskal, 1775) và cá Chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790).
Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN
 Bổ sung thêm chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium mới vào danh sách các
chi vi tảo biển có nguồn gốc từ Việt Nam;
 Có được những dẫn liệu khoa học về các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa
của một số loài/chủng tiềm năng thuộc chi Schizochytrium đã được phân lập;
 Chứng minh được khả năng ứng dụng chủng vi tảo Schizochytrium mangrovei
PQ6 trong lĩnh vực sản xuất thực phẩm chức năng và nuôi trồng thủy sản.


3

Chương I. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Hệ thống phân loại, các kĩ thuật phân lập và định tên chi Schizochytrium
1.1.1. Hệ thống phân loại
Trong những nghiên cứu trước đây, chi Schizochytrium được xếp vào bộ
Saprolegniales thuộc ngành Oomycota do có nhiều nét tương đồng với nấm động
bào tử. Tuy nhiên, ngày nay với những bằng chứng về siêu cấu trúc và trình tự
nucleotit của đoạn gen 18S rRNA thu được, các nhà khoa học đã xếp chúng vào
một giới riêng - giới Chromista. Chi Schizochytrium được xếp vào ngành



4

tử có hai roi lệch. Hình 1.2 là hình mô tả chu trình sống của một số chi đại diện
(Porter, 1990).

Hình 1.2. Chu trình sống của các chi đại diện thuộc ngành Labyrinthulomycota

(Porter, 1990)
Chú thích: chi Schizochytrium: tế bào non với mạng lưới ngoại chất (a) phân chia liên tiếp
tạo thành 4 tế bào (b) và tạo thành một khối các tế bào (c); Mỗi tế bào phát triển thành túi
động bào tử (d) và giải phóng động bào tử (e), động bào tử biệt hóa thành tế bào non.

Thành tế bào có chứa sulphate polysacharide với thành phần chủ yếu là
galactose hoặc fructose và protein (Chamberlain, 1980). Hệ thống mạng lưới ngoại
chất (EN) được sinh ra từ một hoặc nhiều điểm trên thành tế bào. EN hình thành
nên một mạng lưới nhánh của màng sinh chất kéo dài, liên quan đến một bào quan
gọi là bothrosome hoặc sagenogenetosome (sagenogen) ở phía bề mặt ngoài tế bào
(Porter, 1990). EN góp phần làm tăng vùng bề mặt tế bào, có chứa enzyme thủy


5

phân gắn trên bề mặt hoặc nằm chìm trong môi trường xung quanh đã giúp cho việc
tiêu hóa dễ dàng các vật liệu hữu cơ. EN cũng gắn tế bào với môi trường và tiến
hành phân hủy các cơ chất hữu cơ. Tế bào hầu như không sản xuất EN khi phát
triển trên môi trường lỏng giàu dinh dưỡng, đặc biệt là trong điều kiện nuôi lắc
(Raghukumar, 2008).
Hiện có 5 loài thuộc chi Schizochytrium đã được mô tả bao gồm S.


Tên mới

Oblongichytrium

Tên gốc

Oblongichytrium minutum

Schizochytrium

minutum

(A. Gaertn.) R. Yokoyama và D. Honda

Gaertn.

Oblongichytrium octosporum

Schizochytrium octosporum

(Raghuk.) R Yokoyama và D. Honda

Raghuk.

Aurantiochytrium limacinum (D. Honda và Schizochytrium limacinum
Aurantiochytrium

Yokochi) R. Yokoyama và D. Honda



1.1.2.2. Các kĩ thuật định tên
* Kĩ thuật hóa sinh
Kĩ thuật nhuộm huỳnh quang đã được phát triển nhằm xác định số lượng tế
bào nhờ phản ứng giữa fluorochrome (acriflavine), thành tế bào và nhân. Khi đó,
thành tế bào bắt màu đỏ, nhân bắt màu xanh. Tuy nhiên, kĩ thuật này trong một số
trường hợp không thể phát hiện được các tế bào Schizochytrium ở giai đoạn động
bào tử (do hầu hết các loài không có thành tế bào) hoặc khi các tế bào có thành
mỏng (Gupta và cs, 2012). Một phương pháp đặc hiệu để phát hiện họ
Thraustochytriidae là lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) đã được thiết lập với việc sử
dụng một đầu dò ThrFL1 đối với rRNA đích đã cho phép giải quyết được những
hạn chế nêu trên (Takao và cs, 2007). Trong kĩ thuật FISH có quá trình lai giữa đầu
dò ThrFL1 với rRNA sẽ cho phép phát hiện các động bào tử và các tế bào sinh
dưỡng còn non. Phương pháp nhuộm bằng Sudan Black cũng đã được sử dụng để
phát hiện ra các tế bào thuộc họ Thraustochytriidae nói chung (Wong và cs, 2008;
Gupta và cs, 2012).
* Định tên bằng kĩ thuật sinh học phân tử
Kĩ thuật định tên bằng sinh học phân tử dựa trên việc đọc và phân tích trình
tự của gen hoặc đoạn gen 18S rRNA đã được sử dụng để xác định mối quan hệ di
truyền của các chủng phân lập chưa biết và những chủng đã được biết thuộc họ
Thraustochytriidae. Phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen 18S rRNA cần một cặp
mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên các trình tự gen đã biết của các chủng nghiên
cứu. Sau đó việc so sánh và phân tích mối quan hệ di truyền sẽ được tiến hành để
tìm ra loài mới (Mo và cs, 2002; Yokoyama & Honda, 2007). Đây là công cụ tương
đối chính xác cho phép xác định hoặc thiết lập các mối quan hệ giữa các loài thuộc
họ Thraustochytriidae.
* Phân tích siêu cấu trúc
Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) đã cho phép phát hiện nhiều
thể lipit trong phần tế bào chất của tế bào thuộc họ Thraustochytriidae. Các thể lipit
này sau đó được xác định lại bằng phương pháp nhuộm với Sudan Black B

và động vật. Cấu trúc hoá học của hai ω-3 PUFA này được chỉ ra trên hình 1.3
(Sijtsma & de Swaaf, 2004).


9

Hình 1.3. Cấu trúc hoá học của DHA và EPA (Sijtsma & de Swaaf, 2004)
1.2.2. Vai trò của -3 PUFA đối với sức khoẻ con người
Các PUFA có ba vai trò sinh học chủ yếu. Đầu tiên phải kể tới việc tham gia
vào sự điều hòa quá trình trao đổi lipít, vận chuyển và hướng tới các mô. Ví dụ các
hoạt động bao gồm sự ức chế quá trình sinh tổng hợp triacylglycerol ở gan bởi các
-3 PUFA. Bên cạnh đó, các PUFA còn tham gia vào thành phần cấu trúc nên
thành tế bào. Sự có mặt của chúng trong thành phần phospholipit góp phần tạo nên
tính linh động của màng. Điều này góp phần quan trọng trong việc điều chỉnh hoạt
động của các protein màng. Màng phospholipit cũng là nguồn các phân tử thông tin
thứ hai như diacylglycerol, phosphatidic, inositol–1, 4, 5- trisphosphate, ceramide
và AA (axít arachidonic) - những phân tử chịu trách nhiệm cho các hoạt động tín
hiệu của màng tới vùng nguyên sinh chất và nhân để điều chỉnh tương ứng các phản
ứng đáp lại; và các phân tử tín hiệu ngoại bào như yếu tố hoạt hoá tiểu cầu. Ngoài
ra, một số PUFA còn đóng vai trò là cơ chất cho việc tổng hợp các phân tử có hoạt
tính sinh học như prostaglandin (PG), thromboxan (TX) và leukotrien (LT) (Calder,
2003).
Trong thập niên 80, những hiểu biết của con người về PUFA nói chung đã
được mở rộng, đặc biệt là các -3 PUFA. Con người không tự tổng hợp được -3
và -6 PUFA do thiếu enzyme delta-12 và delta-15 desaturase và vì vậy, chúng
phải được lấy từ ngoài vào thông qua chế độ ăn (Calder, 2003). Việc tiêu thụ EPA
và DHA đã được chứng minh là có thể ngăn ngừa bệnh tim mạch, hệ thần kinh và
tình trạng viêm. Do liên quan đến sức khỏe tim mạch nên nếu thường xuyên tiêu thụ



trẻ em trong độ tuổi đến trường (Richardson & Montgomery, 2005). Tác động tích