ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------

Nguyễn Đình Tuấn

NGHIÊN CỨU VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG thraustochytrids
Ở RỪNG NGẬP MẶN XUÂN THỦY, NAM ĐỊNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------

Nguyễn Đình Tuấn

NGHIÊN CỨU VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG thraustochytrids
Ở RỪNG NGẬP MẶN XUÂN THỦY, NAM ĐỊNH
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

TS. Nguyễn Thị Hoài Hà
TS. Phạm Thế Hải

Docosahexaenoic Axit

DPA

Docopentaenoic Axit

EPA

Eicosapentaenoic Axit

FAS

Fatty Axit synthase – Tổng hợp axit béo

MUFA

Monounsanturated fatty Axit - Axit béo không no một nối đôi

GPY

Glucose – Peptone – Cao nấm men (Yeast extract)

PUFA

Polyunsanturated fatty Axit - Axit béo không no đa nối đôi

TLK

Tổng lượng khô


trưởng thành; (B,C) Túi bào tử; (D) Tản chưa trưởng thành. ...................................37
Hình 3.5. Hình thái tế bào của chủng PT-277 (thanh kích thước 10 µm). (A) Tản
chưa trưởng thành; (B) Túi động bào tử; (C) Thay đổi hình dạng ở tế bào dạng
amip; (D) Các cấu trúc giống động bào tử được giải phóng .....................................38
Hình 3.6. Hình thái tế bào của chủng PT-278 (thanh kích thước 10 µm). (A) Tản
chưa trưởng thành; (B, C) Túi động bào tử; (D) Tế bào dạng amip; (E) Thay đổi
hình dạng ở tế bào dạng amip ...................................................................................39


Hình 3.7. Hình thái tế bào của chủng PT-279 (thanh kích thước 10 µm). (A) Nang
bào tử; (B) Tản chưa trưởng thành; (C) Túi động bào tử; (D) Thay đổi hình dạng ở
tế bào dạng amip; (E) Giải phóng động bào tử .........................................................39
Hình 3.8. Hình dạng tế bào của chủng PT-280 (thanh kích thước 10 µm). (A) Túi
bào tử; (B) Sự phân cắt hướng tâm của các động bào tử nguyên phát từ túi động bào
tử; (C) Tế bào dạng amip ..........................................................................................40
Hình 3.9. Hình dạng tế bào của chủng PT-281 (thanh kích thước 10 µm). (A) Thay
đổi hình dạng ở tế bào dạng amip; (B) Sự vê tròn của tế bào dạng amip; (C) Sự giải
phóng các cấu trúc dạng động bào tử ........................................................................40
Hình 3.10. Hình thái tế bào của chủng PT-283 (thanh kích thước 10 µm). (A) Tản
trưởng thành với các hạt tế bào; (B, C, D) Túi bào tử ..............................................41
Hình 3.11. Hình dạng tế bào của chủng PT-286 (thanh kích thước 10 µm). (A, B)
Tản; (C) Túi bào tử....................................................................................................41
Hình 3.12. Cây phả hệ của chủng đại diện PT-268 dựa trên trình tự gen 18S rRNA
và các chủng có mối quan hệ gần..............................................................................43
Hình 3.13. Tỷ lệ % tổng số axit béo no (SFA), axit béo không no một nối đôi
(MUFA) và axit béo không no đa nối đôi (PUFA) của mười VTBDD
thraustochytrid...........................................................................................................46
Hình 3.14. So sánh thành phần các axit béo không no đa nối đôi của mười VTBDD
thraustochytrid...........................................................................................................50
Hình 3.15. Tỷ lệ % axit béo EPA, DPA so với tổng số axit béo (TFA) của mười

Đặc điểm sinh học của VTBDD thraustochytrid ............................................... 10

1.1.2.1.

Đặc điểm tế bào ............................................................................................. 10

1.1.2.2.

Chu kỳ sinh trưởng ........................................................................................ 12

1.1.3. Vai trò của thraustochytrid trong hệ sinh thái............................................................ 13
1.2.

Axit béo VTBDD thraustochytrid............................................................................. 15

1.2.1.

Tổng hợp axit béo bằng con đường FAS (Fatty Axit Synthase) ....................... 15

1.2.2.

Tổng hợp axit béo bằng con đường PKS (polyketide synthase) ....................... 18

1.3.

Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và sản xuất PUFA ....................................... 22

1.3.1.

Dinh dưỡng ........................................................................................................ 22

Hóa chất và thiết bị ............................................................................................ 26

Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 26

2.2.1.

Phương pháp thu mẫu và chuẩn bị mẫu............................................................. 26

2.2.2.

Phương pháp phân lập ....................................................................................... 27

1


2.2.2.1.

Phân lập bằng micropipette............................................................................ 27

2.2.2.2.

Kiểm tra và thuần khiết giống trên đĩa thạch ................................................. 27

2.2.3.

Phương pháp phân loại hình thái học ................................................................ 27

2.2.4.

Phương pháp phân tích trình tự gen .................................................................. 27

.................................................................................................................................. 31

3.1.1.

Đặc điểm hình thái khuẩn lạc ............................................................................ 32

3.1.2.

Đặc điểm hình thái tế bào 10 chủng thraustochytrid ......................................... 35

3.2.

Phân tích trình tự gen 18S......................................................................................... 31

3.3.

Thành phần axit béo của mười VTBDD thraustochytrid .......................................... 44

3.4.

Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ đến sinh trưởng và tổng hợp Lipit ............... 51

3.4.1.

Ảnh hưởng của nguồn cacbon ........................................................................... 51

3.4.2.

Ảnh hưởng của nguồn nitơ ................................................................................ 53


phí nhiên liệu do nhu cầu sử dụng ngày càng tăng.
Ngoài ra, các VTBDD có khả năng sinh trưởng nhanh, dễ dàng duy trì điều
kiện nuôi cấy tối ưu, không bị ảnh hưởng bởi mùa vụ và khí hậu, có thể kiểm soát
được quá trình sản xuất và chất lượng sản phẩm. Trên thế giới, trong một vài năm
gần đây, các loài VTBDD thuộc chi Thraustochytrium, Schizochytrium,

3


Labyrinthula, Ulkenia,…đã trở thành đối tượng nghiên cứu chính cho các nhà khoa
học ở một số nước như: Úc, Nhật Bản… để sản xuất DHA làm thực phẩm chức
năng cho con người và phối trộn chúng cùng nấm men và một số vi tảo biển khác
làm thức ăn tươi sống hoặc nhân tạo trong nuôi trồng thủy sản. Vì vậy, việc phân
lập và tuyển chọn các VTBDD cho các ứng dụng mang tính thương mại là hết sức
quan trọng và cần thiết.


Nội dung nghiên cứu:
• Phân lập và tuyển chọn được 10 vi tảo dị dưỡng ở rừng ngập mặn Xuân

Thủy, Nam Định.
• Phân loại vi tảo biển dị dưỡng:
− Phân loại theo hình thái học: miêu tả, kích thước hình dạng tế bào vi tảo
biển dị dưỡng họ thraustochytrid.
− Phân loại bằng sinh học phân tử: phân tích giải trình tự rDNA 18S
• Sàng lọc vi tảo biển dị dưỡng họ thraustochytrid giàu thành phần Axit béo
không no quan trọng như DHA, AA, EPA.
• Ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ đến sinh trưởng và tổng hợp chất béo.




Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1.

Giới thiệu về vi tảo biển dị dưỡng thraustochytrid
Vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) thraustochytrid thuộc giới Straminipila có mối

liên quan đến tảo lông doi lệch như tảo vàng ánh (Chrysophytes), tảo vàng lục
(Xanthophytes), tảo nâu (Phaeophytes) và tảo silic (Diatoms), trước đây chúng được
xếp vào giới nấm do đặc điểm hóa dị dưỡng điển hình kết hợp hình thái học giữa
nấm thực và nấm noãn [23, 34].
Nấm và nguyên sinh vật dạng nấm là sinh vật phân giải trong các hệ sinh thái,
tầm quan trọng của chúng đối với các hệ sinh thái trên cạn từ lâu đã được nghiên
cứu và công nhận. Tuy nhiên các nguyên sinh vật dạng nấm trong môi trường nước
mặn lại ít được quan tâm hơn so với vi khuẩn, chủ yếu do sự phong phú và hàm
lượng sinh khối thấp cũng như vai trò sinh thái chưa được biết nhiều của chúng.
Thraustochytrid do đó có thể được coi là một phần quan trọng của chuỗi thức ăn
nước mặn đã bị bỏ qua. Mặc dù vậy chúng xuất hiện ở hầu hết các vùng ngập mặn
cửa sông và vùng biển trên toàn thế giới [32]. Mật độ của phù du thraustochytrid
được ước tính khoảng từ 103- 105/l bằng cách đếm trực tiếp bằng kính hiển vi ngoại
huỳnh quang [45]. Dù mật độ này rất nhỏ nếu so sánh với số lượng của vi khuẩn
phù du trong nước mặt (ước tính vào khoảng 108- 109/l), tuy vậy thể tích tế bào của
thraustochytrid có thể lớn hơn 103 lần so với vi khuẩn phù du. Sinh khối tế bào
thraustochytrid cũng đã được tính toán lớn hơn sinh khối vi khuẩn phù du khoảng
104 lần. Sự phong phú tương đối thấp của thraustochytrid do đó được bù đắp bởi thể
tích tế bào và sinh khối cao của chúng [27]. Ngoài ra, thraustochytrid có khả năng
sản xuất cellulase và xylanases ngoại bào để phân hủy các vật liệu thực vật như tảo
và lá rụng trong rừng ngập mặn [35]. Chúng cũng được biết với khả năng tích lũy
một lượng lớn omega-3 PUFA như DHA và DPA [45], do đó chúng có tiềm năng
trở thành nguồn thức ăn cho sinh vật ở bậc dinh dưỡng cao hơn ở biển môi trường.

bọc hoặc bao phủ hoàn toàn bởi mạng lưới ectoplasmic của chúng. Những mạng
lưới này không được sử dụng để di chuyển, nhưng có chứa các enzym ngoại bào
cho phép xâm nhập vào các bề mặt rắn và phân hủy các hợp chất hữu cơ cho quá
trình hấp phụ và vận chuyển các chất dinh dưỡng [11, 13]. Các trạng thái tế bào
sinh dưỡng của thraustochytrid bao gồm các tế bào đơn có đường kính đo được từ 4

7


– 20 µm, và hầu hết các thraustochytrid tái sản sinh bằng các động bào tử [42].
Trong khi nhiều tế bào trưởng thành các tế bào sinh dưỡng chuyển hóa trực tiếp
thành túi bào tử động, một số khác lại chuyển thành dạng tế bào amip, các tê bào
amip này sau đó chuyển hóa thành các bào tử động [20]. Trạng thái của các tế bào
sinh dưỡng và các đặc điểm hình thái khác nhau thay đổi tùy theo các chi
thraustochytrid khác nhau [38, 57].
Họ Thraustochytriaceae ban đầu được phân loại bao gồm 7 chi dựa trên các
đặc điểm hình thái như sau [33, 38]: Althornia Jones và Alderman, Aplanochytrium
Bahnweg và Sparrow, Japonochytrium Kobayasi và Ookubo, Labyrinthuloides
Perkins, Schizochytrium Goldstein và Belsky emend. Booth và Miller,
Thraustochytrium Sparrow c. Johnson, và Ulkenia Gaertner. Tuy nhiên, một nghiên
cứu khá toàn diện được thực hiện bởi Honda và cộng sự (1999) đã chỉ ra rằng sự
phân loại ở mức chi này không bao gồm sự phân loại gen dựa trên các dải trình tự
rRNA 18S [23]. Sử dụng kết hợp các đặc điểm hình thái và phân loại phân tử,
Levàer và Porter (2000) đã kết luận rằng Aplanochytrium và Labyrinthuloides là
tương đồng và do đó đã sửa đổi lại định nghĩa về chi Aplanochytrium, chi này bao
gồm tất cả các loài Labyrinthuloides. Ngoài ra, các loài thuộc chi Schizochytrium
được tái sắp xếp lại thành 3 chi riêng biệt Schizochytriumsensu stricto,
Aurantiochytrium và Oblongichytrium gen. nov. dựa trên các đặc điểm về hình thái,
phân loại sinh hóa, và phân loại gen theo trình tự rRNA 18S [46]. Hơn nữa, chi
Ulkenia cũng được phân tách thành 4 chi có chứa 3 chi mới, Ulkeniasensu stricto,

1.1.2. Đặc điểm sinh học của VTBDD thraustochytrid
1.1.2.1. Đặc điểm tế bào
Thraustochytrid là sinh vật đơn bào, nhân thực, hóa dị dưỡng. Tế bào sinh
dưỡng trong môi trường dịch thể tồn tại ở dạng tản hình trứng hoặc hình cầu với
đường kính từ 4 - 20µm [8], được liên kết với một mạng lưới ngoại chất (EN) dạng
sợi như rể giả (hình 1.2 b-h), ngoại trừ ở chi Althornia không có EN [4], nhiệm vụ
của EN là làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc, hỗ trợ tế bào gắn kết với chất nền,
thủy phân các hạt cơ chất rắn sau đó cung cấp dinh dưỡng cho tế bào [8]. Thành tế
bào của chúng gồm nhiều lớp, các lớp này không chứa xenlulloza mà hình thành từ
fucoza hoặc dẫn xuất của galactoza và có nguồn gốc từ thể Golgi [8, 27, 41]. Rể giả
được kết nối với tản qua một cấu trúc nút phức tạp (hình 1.2 b) còn được gọi là bào
quan sagenogenetosome [42] hoặc bothrosome [29].
Phương thức sinh sản thường thấy ở VTBDD thraustochytrid là sinh sản vô
tính bằng cách tạo ra động bào tử hai doi lệch. Doi gắn ở phần ngọn, doi trước dài,
bề mặt được bao phủ bởi lớp lông tơ và doi sau ngắn, trơn, không có lông tơ. Động
bào tử phát triển trong các túi động bào tử có nguồn gốc từ các tế bào sinh dưỡng,
sau đó chúng được giải phóng rồi mất doi, hình thành tản mới [5]. Giai đoạn amip
cũng đã được quan sát [16]. Ở một số chi của họ thraustochytrid tản sinh phát triển
ở bên trong, như ở T. rossi (hình. 1.2 c-e) [4], trong khi ở chi Schizochytrium, sự

10


phân chia tản phân đôi liên tiếp (hình 1.2). Bào tử nghỉ Epibiotic được tạo ra một số
loài, mặc dù nó đã không được ghi nhận là những kết quả của sinh sản hữu tính [4].

Hình 1.2. Đặc điểm hình thái các dạng tế bào của họ thraustochytrid
(a) Chi tiết siêu cấu trúc của phức hệ bothrosome (sagenogenetosome) phân
tách từ lưới ngoại chất của Aplanochytrium minutum, cho thấy sự nối tiếp nhau
trong phức hệ xuyên màng. (b) Sơ đồ minh họa siêu cấu trúc tản đơn bào chưa

mỗi cụm sau đó sẽ phát triển thành một động bào tử hay túi động bào tử.
Dù sinh trưởng theo các phương thức khác nhau nhưng khái quát vòng đời của
thraustochytrid đều trải qua 3 chu kỳ:
Chu kỳ 1: các tế bào trong giai đoạn sinh trưởng khi đạt được đến một kích
thước nhất định, chúng có thể hình thành nên các động bào tử, và giải phóng động
bào tử. Mặt khác, chúng có thể hình thành nên các tế bào dạng amip, hoặc tiếp tục
sinh trưởng đến giai đoạn trưởng thành rồi thực hiện quá trình phân chia 2, 4 tế bào.
Chu kỳ 2: tế bào tiếp tục phân chia 8, sau đó các tế bào được giải phóng tạo
thành các tế bào đơn, tiếp tục sinh trưởng tạo tế bào trưởng thành.
Chu kỳ 3: nội chất bên trong của tế bào trưởng thành được hoàn thiện, bắt đầu
tạo thành các động bào tử. Sau một thời gian các động bào tử được giải phóng và
phát triển thành tế bào đơn theo chu kỳ khép kín.
1.1.3. Vai trò của thraustochytrid trong hệ sinh thái
Các nghiên cứu đã phát hiện ra sự hiện diện của thraustochytrid trong các môi
trường cửa sông, biển và vùng nước sâu. Thraustochytrid tồn tại trong các thủy vực
hầu hết có đường kính giữa 3.5 và 20 µm và lớn hơn đường kính của vi khuẩn phù
du (
dự kiến.
1.2. Axit béo VTBDD thraustochytrid
Thraustochytrid có khả năng tích lũy hàm lượng axit béo cao, đặc biệt là axit
béo không no. Chúng có khả năng sản xuất một lượng lớn axit béo không no đa nối
đôi (PUFA -polyunsaturated fatty Axits) và axit béo không no một nối đôi (MUFA
- monounsaturated fatty Axit). Các loại axit béo không no này có ứng dụng quan
trọng trong sản xuất thực phẩm chức năng, dược phẩm, sản xuất diesel sinh học và
một số ngành công nghiệp khác.
1.2.1.

Tổng hợp axit béo bằng con đường FAS (Fatty Axit Synthase)

Trước 2001, nhiều ý kiến cho rằng Thraustochytrid chỉ sản xuất DHA bằng
con đường tổng hợp axit béo FAS, con đường này bao gồm quá trình khử bão hòa
và kéo dài chuỗi [33]. Con đường FAS có chứa một protein đa enzyme xúc tác tổng
hợp axit béo [24]. Và được chia thành hai loại: FAS I - đặc trưng ở nấm và vật có
xương sống, trong đó các vị trí xúc tác cho các bước khác nhau trong sinh tổng hợp
Lipit chứa các vùng dọc theo chiều dài của protein đa chức năng và FAS II - đặc
trưng ở vi khuẩn và thực vật, trong đó mỗi vị trí xúc tác mang một tiểu đơn vị
protein riêng biệt. Sự kéo dài chuỗi axit béo bởi FAS dừng lại khi hình thành axit
palmitic (C16: 0) - sản phẩm cuối cùng của con đường tổng hợp FAS (hình 1.4).
Quá trình này bao gồm các chu kỳ trùng hợp lặp đi lặp lại được xúc tác bởi
ketosynthase (KS) để tạo thành một protein mang ketoacyl-acyl (ACP), tiếp theo là
quá trình khử bởi ketoreductase (KR) để tạo thành hydroxyacyl-ACP, khử nước bởi
dehydratase (DH) để tạo thành enoyl-ACP, và tiếp tục khử bởi enoyl reductase (ER)
để tạo acyl-ACP. Khi chuỗi carbon bão hòa đã đạt đến chiều dài đầy đủ - 16 nguyên
tử carbon, nó được giải phóng từ ACP nhờ thioesterase để tạo thành một axit béo.

15


đánh dấu. Như vậy, trong động vật có vú, DHA được sản xuất không phụ thuộc Δ4
desaturase. Thay vào đó, DHA được sản xuất bởi sự kéo dài DPA tạo C24: 5 (n-3),
khử bão hòa thông qua Δ6 desaturase tạo C24: 6 (n-3), và cuối cùng là quá trình
oxy hóa để C22: 6 (n-3) bởi quá trình β-oxy hóa. Oxy hóa axit béo là quá trình
ngược với quá trình kéo dài, trong đó hai carbon được gỡ bỏ khỏi đầu axit
cacboxylic của axit béo [39, 54].
Không giống như động vật có vú, Thraustochytrid và nhiều vi sinh vật khác đã
được phát hiện có chứa các gen mã hóa cho enzym Δ4 desaturase. Bằng chứng cho
việc tổng hợp enzyme Δ4 desaturase và sự tham gia của nó trong tổng hợp DHA ở
Thraustochytrium spp. [41]. Trong nghiên cứu của Qiu (2001) đã xác định một
cDNA ở Thraustochytrium spp. mã hóa cho một loại protein tương tự cấu trúc
enzyme Δ4 desaturase phân lập từ các sinh vật khác.

17


Tách dòng (cloning) và
biểu hiện cDNA này trong cả
nấm

men

(Saccharomycese

cerevesia) và thực vật (Brassica
juncea) bình thường không tổng
hợp enzyme Δ4 desaturase cho
thấy liên kết đôi Δ4 được chèn
vào DPA do đó tạo ra DHA.
DHA không tự nhiên được sản

PUFA chuỗi dài bắt đầu trên vi khuẩn biển. EPA hay DHA được tìm thấy trong một
số chủng vi khuẩn biển ưa lạnh. Sau đó, một phân đoạn DNA genome từ một loại vi
khuẩn tổng hợp EPA (Shewanella sp. SCRC-2738) được chuyển nhiễm vào
Escherichia coli và tổng hợp EPA [56]. Các protein được mã hóa bởi năm khung
đọc mở được xác định là cần và đủ để tổng hợp EPA [59]. Bốn trong số những
protein này là các tiểu đơn vị của một enzyme phức tạp có khả năng tổng hợp de
novo EPA. Metz (2001) xác định vài vùng bắt cặp của enzyme tổng hợp PUFA

18