BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******  ******

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE
ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG
KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2007
1
LỜI CẢM ƠN

Con xin cảm ơn Ba Má cùng các anh chị trong gia đình đã nuôi dạy con đến
ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài.
 Chân thành cảm ơn!
Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí
Minh.
Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam bộ
Trung Tâm Công nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh.
Đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án tốt nghiệp đúng tiến
độ.
 Chân thành cảm ơn!
Tất cả các Thầy Cô đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức cho lớp chúng tôi
trong thời gian học tập tại trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.
 Chân thành cảm ơn!
TS.Vƣơng Đình Tuấn
TS. Nguyễn Quốc Bình
Đã luôn tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi

- Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dòng cây Keo lá tràm ở Việt Nam.
 Phƣơng pháp nghiên cứu
- Sử dụng kĩ thuật PCR để khuếch đại DNA ly trích từ mẫu lá của 100dòng Keo
lá tràm thu đƣợc với 9cặp mồi.
 Kết quả
- Bƣớc đầu thanh lọc đƣợc một số cặp mồi SSR đƣợc sử dụng cho phân tích đa
dạng di truyền. Và có sự khác nhau về trọng lƣợng các bands của các cá thể phân
tích và có sự biến động di truyền giữa các cá thể.
 Kết luận
3
- Thí nghiệm đã thanh lọc đƣợc một số cặp mồi (Am 341, Am 326 và Am 770)
có thể cho hiệu quả phân tích đa dạng di truyền Keo lá tràm khá tốt.
4
MỤC LỤC

ĐỀ MỤC ...................................................................................................... TRANG
TRANG TỰA ........................................................................................................... ii
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... iii
TÓM TẮT ............................................................................................................... iv
MỤC LỤC ................................................................................................................ v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ..................................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ................................................................. x
Phần 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1
1.2 Yêu cầu và mục đích nghiên cứu của đề tài ....................................................... 2
1.4 Giới hạn của đề tài ............................................................................................. 2
Phần 2. TỔNG QUAN ............................................................................................. 4
2.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học ........................................................................... 4
2.1.1 Định nghĩa ....................................................................................................... 4


2.5.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ .......................................... 25
2.5.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di ...................................... 26
2.6 Tổng quan về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) .................................. 28
2.6.1 Vài nét về chi Keo (Acacia) .......................................................................... 28
2.6.1.1 Đặc điểm sinh học của các loài Keo .......................................................... 28
2.6.1.2 Công dụng của các loài Keo (Acacia) ........................................................ 30
2.6.2 Vài nét về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis A. Cunn ex Benth) ........ 32
2.6.2.1 Các đặc điểm sinh học và sinh thái ............................................................ 33
2.6.2.2 Công dụng và tiềm năng gây trồng ............................................................ 35
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................... 36
6
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ....................................................................... 36
3.1.1 Thời gian thực hiện ....................................................................................... 36
3.1.2 Địa điểm thực hiện ....................................................................................... 36
3.2 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................... 36
3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm .................................................................................. 36
3.4 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................... 37
3.5 Ly trích DNA ................................................................................................... 37
3.5.1 Hóa chất ....................................................................................................... 37
3.5.2 Quy trình ly trích DNA ................................................................................. 38
3.5.3 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích ................................................................. 40
3.6.1 Qui trình phản ứng PCR ................................................................................ 40
3.6.2 Điện di sản phẩm PCR .................................................................................. 42
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 44
4.1 Quá trình ly trích ............................................................................................. 44
4.2 Phản ứng PCR .................................................................................................. 44
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 48
5.1 Kết luận ............................................................................................................ 48
5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 48

 U: Đơn vị hoạt tính của Taq
 UV: Ultra Violet 8
DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân ..................................................... 16
Hình 2.2: Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã ................................................. 16
Hình 2.3:Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR ................................................... 20
Hình 2.4: Hình thái lá các loài Keo(Acacia) .......................................................... 29
Hình2.5:Hình thái một số loài Keo ........................................................................ 30
Hình 2.6. Keo lá tràm ............................................................................................. 33
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay cùng với sự phát triển của đời sống, kinh tế, xã hội, nhiều sản
phẩm làm từ các chất liệu nhƣ nhựa, nhôm, hợp kim,…,đã ra đời với nhiều công
dụng tiện lợi phục vụ cho đời sống tất bật của xã hội loài ngƣời trong giai đoạn phát
triển vũ bão. Tuy nhiên các sản phẩm này vẫn không thể nào thay thế đƣợc hoàn
toàn sự hiện diện của các sản phẩm đƣợc làm từ gỗ nhƣ: bàn ghế, cửa, kệ, tủ, hàng
thủ công mỹ nghệ, tập sách vở…trong các gia đình, công sở, nhà hàng, khách sạn,
phòng triển lãm, khu trƣng bày, trƣờng học,…Do các sản phẩm làm từ gỗ mang lại
sang trọng, ấm cúng, gần gũi với thiên nhiên cho không gian sử dụng, và chúng còn
có thể tái chế. Vậy mà thực tế cho thấy nguồn nguyên liệu gỗ ngày càng suy kiệt,
giảm chất lƣợng do sự khai thác bừa bãi, nạn phá rừng của con ngƣời, thiên tai lũ
lụt, hạn hán, cháy rừng, sự ô nhiễm môi trƣờng...
Keo lá tràm hay còn gọi Keo bông vàng, là loại cây mọc nhanh có xuất xứ từ
Australia, Papua, New Guinea và Indonesia,…(Turnbull,1986). Đƣợc du nhập vào
Việt Nam từ thập niên 60 của thế kỉ XX, với mục đích chủ yếu là cung cấp nguồn
nguyên liệu cho sản xuất giấy, làm đồ trang trí nội thất, làm than củi,...
(http://snnptnt.thanhhoa.gov.vn). Tại Việt Nam hiện nay, Keo lá tràm đƣợc trồng
phổ biến ở nhiều địa phƣơng, tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền Trung và vùng
Đông Nam Bộ. Keo lá tràm đóng góp một cách có ý nghĩa trong ngành công nghiệp
sản xuất giấy, nghề chế tác hàng thủ công mỹ nghệ và cũng nhƣ đời sống của nông
dân trồng rừng (Bùi Việt Hải,1998). Vì vậy việc chọn và tạo giống Keo lá tràm chất
lƣợng cao với năng suất cao, chống chịu sâu bệnh là một nhu cầu hết sức cấp thiết
đặt ra cho ngành lâm nghiệp. Việc nghiên cứu chọn giống Keo cũng đã đƣợc triển
khai từ hàng chục năm nay ở Viện Khoa học lâm nghiệp nhƣng biện pháp chủ yếu
là nhập hạt giống chất lƣợng cao, khảo nghiệm và chọn giống theo phƣơng pháp cổ
điển của các dòng cây trội. Việc nghiên cứu chọn giống Keo sử dụng chỉ thị phân tử
11
hoặc trên các cơ sở kỹ thuật cao hầu nhƣ chƣa có nhiều. Các phƣơng pháp chọn
giống cổ điển tuy đã góp phần hình thành nên những giống vật nuôi đa dạng, nhƣng
do chỉ tiêu chọn thuộc về hình thái, chủ yếu về kiểu hình và chỉ tiêu sinh hóa


13
Phần 2. TỔNG QUAN

2.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học
2.1.1 Định nghĩa
Thuật ngữ "đa dạng sinh học" lần đầu tiên đƣợc Norse và McManus (1980)
định nghĩa, bao hàm hai khái niệm có liên quan với nhau là: đa dạng di truyền (tính
đa dạng về mặt di truyền trong một loài) và đa dạng sinh thái (số lƣợng các loài
trong một quần xã sinh vật).
Đa dạng sinh học (Biodiversity) là sự giàu có, phong phú và đa dạng về
nguyên liệu di truyền, về loài và các hệ sinh thái (Lê Trọng Cúc, 2002).
Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – WWF (1989) đề xuất định nghĩa: “ Đa
dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật,
động vật và vi sinh vật, là những gene chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh
thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trƣờng”.
2.1.2 Ý nghĩa của đa dạng sinh học
Sự đa dạng của sinh vật trong thiên nhiên chứa dựng vẻ đẹp vô tận, đó chính

khác. Cách này đƣợc sử dụng để nghiên cứu quá trình tiến hoá khảo sát mối quan hệ
về gene.
Theo Rojas và Stanley (1992), những vấn đề tồn tại trong việc phân biệt và
định loại các loài trên thực tế thƣờng phức tạp hơn nhiều so với lý thuyết. Một loài
có thể có rất nhiều phân loài mà ta có thể dễ dàng phân biệt dựa theo đặc điểm cấu
tạo và hình thái. Nhƣng, đôi khi các phân loài giống nhau đến mức tƣởng nhƣ là
chúng cùng một loài.
15
Vì vậy nghiên cứu về phân loại học để xác định loài của một nhóm loài và
định loài của những mẫu vật mới chƣa đƣợc biết đến, nhằm tạo cơ sở xây dựng và
bảo vệ sự đa dạng loài là rất cần thiết.
2.1.3.3 Đa dạng về di truyền
Đa dạng di truyền là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học.
Đa dạng di truyền thể hiện qua sự khác nhau của tất cả các gen di truyền của
tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật. Đa dạng di truyền là sự đa
dạng về thành phần gen giữa các cá thể tồn tại trong cùng một loài và giữa các loài
khác nhau (http://www.nea.gov.vn/html/DDDT).
Đa dạng di truyền tạo nên sự khác biệt giữa các cá thể trong quần thể.Xét
cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp
bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền. Nghiên cứu về đa
dạng di truyền là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài. Sự
đa dạng về mặt di truyền trong loài chịu ảnh hƣởng bởi tập tính sinh sản của các cá
thể trong quần thể. Các cá thể trong một quần thể thƣờng có bộ gene khác nhau. Sự
đa dạng về bộ gene này là do các cá thể có các gene khác nhau, dù chỉ là rất ít (Lâm
Vỹ Nguyên, 2006).
Những hình thái khác nhau của gene đƣợc thể hiện bằng những alleles và
những khác biệt do sự đột biến. Những alleles khác nhau của một gene có thể ảnh
hƣởng đến sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau.
Những sự khác biệt về gene trong di truyền học tăng dần khi con cái nhận
đầy đủ tổ hợp gene và nhiễm sắc thể của bố mẹ thông qua sự tái tổ hợp của các gene


Dựa trên kiểu hình có thể chia DNA marker thành hai nhóm (CNSH cây
trồng, Phạm Thành Hổ):

-
Marker đồng trội: Những marker có thể phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp
tử và cá thể dị hợp tử. Bao gồm marker allozyme, Microsatellite, RFLP.

- Marker trội: Những marker không thể phân biệt những cá thể đồng hợp
tử và dị hợp tử. Bao gồm RAPD, AFLP.

17
Bảng 2.1 : Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005)
Chỉ thị (marker) Tên đầy đủ
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
AP-PCR Arbitrary Primer-PCR
DAF DNA Amplification Fingerprinting
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism
ALP Amplicon Length Polymorphism
SSR Simple Sequence Repeat (Microsatellite)
SSCP Single Strand Conformation Polymorphism
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
SNP Single Nucleotide Polymorphism
STS Sequence-Tagged Sites

2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Ngay từ klhi ra đời, RFLP một chỉ thị phân tử rất hữu dụng trong việc đánh
giá đa dạng di truyền. RFLP đƣợc định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân
đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thƣớc các phân đoạn đƣợc tạo ra
khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme-RE) khi có sự thay

enzyme cắt thƣờng xuyên và một enzyme cắt không thƣờng xuyên. Enzyme cắt
thƣờng xuyên tạo ra những trình tự nhỏ và enzyme cắt không thƣờng xuyên sẽ
nhằm hạn chế số lƣợng các đoạn cắt. Cặp enzyme thƣờng đƣợc dùng nhất là EcoRI
- MseI. Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ
đƣợc gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2
phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản
19
ứng PCR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc
khoảng vài nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và
trình tự nucleotide chọn lọc mới đƣợc khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm
giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích.( Matthes et
al., 1998; Karp et al., 1997)
AFLP nhanh, không phức tạp nhƣ RFLP nhƣng vẫn khảo sát đƣợc toàn bộ
gene. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lƣợng DNA ban đầu. Tuy nhiên, thông tin di truyền
phải đƣợc biết rõ để chuẩn bị primer tƣơng ứng, và AFLP là một marker trội, điều
này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp.
2.2.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)
Là phƣơng pháp xác định sự đa hình về kích thƣớc các đoạn DNA sau khi
thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà
không cần biết trƣớc thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp,
đơn, ngắn, dãy mã đƣợc thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR. Sau khi bắt cặp tại
các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các
đoạn có kích thƣớc khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thƣớc khác
nhau này đƣợc nhận biết bằng điện di. Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA
giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể đƣợc dùng nhƣ những marker để xác
định sự đa dạng di truyền. RAPD đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp tạo sự đa hình
DNA nhanh và hữu hiệu. Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã đƣợc thƣơng mại
hóa trên thị trƣờng và các primer cũng rất dễ đƣợc tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ
cần có máy PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều
kiện thí nghiệm, chƣơng trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa

2.3 Kỹ thuật Microsatellite
2.3.1 Khái niệm về Microsatellite
Microsatellite (SSR marker): Một dạng của VNTR (variable number of
tandem repeats) là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thƣờng xảy ra ngẫu nhiên
trên hầu hết genome thực vật (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,2005), là một đoạn
DNA đƣợc mô tả đặc điểm bởi sự xảy ra của số lƣợng bản copy biến thiên (từ một
vài bản lên đến 30 hay nhiều hơn) của dãy trong vòng 5 hoặc số bases ít hơn (gọi là
đơn vị lặp lại). Một microsatellite điển hình có đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở khoảng
100.000 vị trí khác nhau trong bộ genome động vật điển hình. Ở bất kì một vị trí
nào (locus), thƣờng xuyên có khoảng 5 – 7 “alleles” khác nhau, mà mỗi alleles có
thể nhận biết tuỳ thuộc vào số đơn vị lặp lại. Những alleles này có thể phát hiện bởi
PCR , sử dụng primers đƣợc thiết kế từ một dãy đơn và cũng có trên cả mặt kia của
microsatellite. Khi sản phẩm PCR đƣợc chạy trên gel điện di, alleles đƣợc ghi nhận
khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp lại,...
21
Microsatellite là một marker DNA chuẩn, chúng dễ dàng đƣợc phát hiện
bằng PCR và chúng có khuynh hƣớng xác định vị trí bằng nhau từ đầu đến cuối của
genome. Hàng ngàn SSR đã đƣợc lập bản đồ trong nhiều loài khác nhau.
Tóm lại, microsatellite ngày nay trở thành một thuật ngữ chung nhất để miêu
tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, thay vì sử dụng các thuật ngữ STR (short
tandem repeats) hay VNTR (variable number of tandem repeats) (Edward; 1991).
Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 2 - 6 bp và kích thƣớc tại mỗi locus
là 20 - 100 bp. Microsatellite đƣợc tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc biệt là ở
những cơ thể sống có bộ gen lớn và phân bố đều trên genome.
Microsatellite có tính đa hình rất cao, là những codominant-al hay al đồng
trội (bao gồm 2 loại: al đồng hợp và al dị hợp), nó có các tính chất cần thiết cho một
marker. Tần số đột biến từ 10
4
- 5.10
-6

2.3.3 Sự phát triển của primer Microsatellite
Primer của microsatellite đƣợc phát triển bởi việc tạo dòng ngẫu nhiên một
đoạn DNA từ những giống loài trọng tâm. Những đoạn này đƣợc chèn vào plasmid
hoặc phage vector, và đƣợc chuyển tiếp vào vi khuẩn Escheria coli. Khuẩn lạc sau
đó phát triển và đƣợc chụp lên phim với những trình tự nucleotide đƣợc đánh dấu
huỳnh quang đƣợc lai với trình tự lặp lại của microsatellite, nếu nó có hiện diện trên
đoạn DNA. Nếu dòng dƣơng tính có thể thu đƣợc từ quy trình này, đoạn DNA đƣợc
đọc trình tự và primers PCR sẽ đƣợc chọn từ vùng trình tự liên kết nhƣ vùng để xác
định vị trí đặc trƣng. Quy trình này liên quan đến những thử nghiệm thành công, khi
trình tự lặp lại của microsatellites phải đƣợc dự đoán trƣớc và primers đƣợc thu
nhận ngẩu nhiên có thể không biểu hiện tính đa hình có ý nghĩa. Vị trí microsatellite
đƣợc trải xuyên suốt genome và có thể đƣợc thu nhận từ sự thoái hoá DNA chung
của những mẫu cũ hơn, khi đó là tất cả những chất nền cần thiết và hợp lí để khuếch
đại thông qua PCR.
Primer microsatellite đặc trƣng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở
những vị trí tƣơng đồng (cùng locus trên mỗi al) đối với từng cá thể trong loài. Điều
23
này có thể thực hiện đƣợc là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng
flanking- vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế primer- đƣợc bảo tồn
trong quá trình di truyền của loài. Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát hiện
trình tự microsatellite đặc trƣng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể.
2.3.4 Giới hạn của Microsatellite
Microsatellite đƣợc chứng tỏ là marker phân tử hữu hiệu, đặc biệt trong
nghiên cứu quần thể, thế nhƣng chúng không phải không có hạn chế. Microsatellite
đƣợc phát triển cho những chủng đặc trƣng có thể đƣợc ứng dụng thƣờng xuyên với
những chủng có mối quan hệ họ hàng gần nhau, tuy nhiên tỉ tệ phần trăm vị trí di
truyền đƣợc khuếch đại thành công có thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di
truyền.
Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một loài nào đó có thể
dẩn đến sự cố alleles không giá trị(null alleles), nơi mà primer microsatellite không