BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT
TRIỂN NÔNG THÔN
VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CNSH
TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ĐẾN NĂM 2020

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm
đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp
nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi”

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học
Chủ nhiệm đề tài:
PGS. TS. Quyền Đình Thi
TS. Đỗ Thị Tuyên


KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm
đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp
nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi” Chủ nhiệm đề tài
TS. Đỗ Thị Tuyên PGS. TS. Quyền Đình Thi
Cơ quan chủ trì đề tài Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

2.7.3 Xác định hoạt tính subtilisin 21
2.7.4 Xác định ho
ạt tính xylanase 21
2.8 Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng tự nhiên sinh tổng hợp enzyme 21
2.8.1 Sinh tổng hợp glucanase 21
2.8.2 Sinh tổng hợp mannanase và xylanase 22
2.8.3 Sinh tổng hợp subtilisin 22
2.8.4 Xác định ảnh hưởng của các yếu tố lên hoạt tính enzyme 23
2.9 Các phương pháp sinh học phân tử 23
2.9.1 Phản ứng PCR 23
2.9.2 Thao tác cắt, gắn dính DNA và biến nạp hóa học 23
2.9.3 Biến nạp xung điện 23
2.9.4 Tách chiết RNA 23
2.9.5 Đọc trình tự DNA 24
2.9.6 Biểu hiện plasmid tái tổ hợ
p trong E. coli BL21 24
2.9.7 Biểu hiện plasmid tái tổ hợp trong Aspergillus 24
2.9.8 Biểu hiện trong Pichia pastoris 24
2.9.9 Biểu hiện Xln tái tổ hợp 24
2.9.10 Tách chiết DNA tổng số từ Pichia pastoris 24
2.9.11 Phương pháp tách DNA từ nấm sợi 25
2.9.12 PCR dung hợp hai đoạn 26
2.9.13 Biến nạp vào Bacillus subtilis WB800 26
2.10 Phương pháp tách chiết protein 26
2.10.1 Tinh sạch protein tái tổ hợp 26
2.10.2 Điện di SDS-PAGE 26
2.11 Các phương pháp sản xuất enzyme tái tổ hợp 27

2.11.1 Lên men sản xuất glucanase 27
2.11.2 Lên men sản xuất mannanase 27

3.4.3 Hiệu quả của chế phẩm đơn enzyme xylanase trên lợn con sau cai sữa 114
3.4.4 Hiệu quả của chế phẩm Vietzyme M trên gà Lương Phượng 115
3.4.5 Thử
nghiệm hiệu lực của chế phẩm đa enzyme lên sự sinh trưởng của lợn ở các
lứa tuổi 8-50kg 117
KẾT LUẬN 120
LỜI CÁM ƠN 121
KIẾN NGHỊ 121
TÀI LIỆU THAM KHẢO 121
1
BÁO CÁO TỔNG HỢP
1 TỔNG QUAN
Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 với mục tiêu xây dựng nền chăn nuôi an
toàn sinh học, bền vững được đề ra trong bối cảnh ngành còn đối mặt với nhiều khó khăn.
Nhiều ý kiến cho rằng, quy mô nhỏ lẻ, bất cập trong khâu giống, phát triển vùng nguyên liệu
cho chế biến thức ăn là “rào cản” khiến mục tiêu trên khó thành hiện thực. Những n
ăm qua,
ngành chăn nuôi luôn giữ mức tăng trưởng cao, bình quân giai đoạn 2001-2006 tăng
8,5%/năm. Giá trị sản xuất chăn nuôi năm 2006 tăng trưởng 7,3% so với năm 2005. Tuy
nhiên, năm 2007 chỉ đạt 4,6%, tỷ trọng của ngành tăng 24,1% (giảm 1,4% so với năm 2006).
Việt Nam là nước nông nghiệp nên các nguồn nguyên liệu từ phụ phế liệu của ngành
công nghiệp chế biến nông sản rất lớn, nếu sử dụng
được nguồn nguyên liệu này để sản xuất
thức ăn chăn nuôi sẽ mang lại hiệu quả kinh tế và lợi thế hơn nhiều so với các nguyên liệu
khác. Một trong những hạn chế lớn nhất của sử dụng nguyên liệu từ phụ phế liệu nông nghiệp
để sản xuất thức ăn chăn nuôi là những nguyên liệu này có tỷ lệ xơ cao, chính vì nhiều xơ nên
chúng có tỷ l
ệ tiêu hóa và giá trị năng lượng thấp. Thú có dạ dày đơn khó tiêu hóa chất này
do không sản xuất đủ lượng enzyme nội sinh cần thiết. Không những thế, chất xơ còn bao
bọc các chất dinh dưỡng, hạn chế khả năng tiêu hóa, hấp thu dưỡng chất. Trong môi trường

ững chế phẩm đa enzyme để phân
giải đồng thời nhiều hợp chất. Ví dụ: nếu dùng -glucanase thì chỉ phá vỡ được vách nội nhũ
của hạt đại mạch mà không phân giải được protein chứa trong tế bào chất, để phân giải được
protein trong lớp tế bào chất này phải cần thêm cả cellulase và pentosanase. Ngoài ra, phải
đặc biệt quan tâm tới mối quan hệ tương tác giữa enzyme với các nguyên liệu khác nhau
trong khẩu phầ
n.
2
Trong dinh dưỡng động vật dạ dày đơn, việc bổ sung các chế phẩm enzyme trong khẩu
phần được ứng dụng khá rộng rãi. Tác dụng chính của chúng là cải thiện khả năng tiêu hóa,
ngăn cản các tác hại của các chất kháng dinh dưỡng có trong khẩu phần, đồng thời giảm thiểu
các chất dinh dưỡng dư thừa bài thải ra môi trường. Từ đó sẽ góp phần cải thiện năng xuất
vậ
t nuôi, nâng cao hiệu qủa kinh tế và giảm ô nhiễm môi trường (Wen, 1992; Thacker, 1993;
Thacker and Baas, 1996). Trong các khẩu phần cho động vật dạ dày đơn, ngũ cốc thường
chiếm tỷ lệ khá lớn, từ 50-65% mà trong thành phần của chúng chứa các nhóm non-starch
polysaccharide (NSP) (ß-glucan; arabino-xylans; pentosans; triticale) là những hợp chất cơ
thể động vật không tiêu hóa được. Ngoài ra chúng còn làm giảm khả năng tiêu hóa, hấp thu
các chất dinh dưỡng khác do làm tăng độ nhớt của đường tiêu hóa (Campbell and Bedford,
1992; Friesen et al., 1992; Boros et al., 1995). Nhiều nghiên cứu đã ch
ứng minh là bổ sung
hỗn hợp các enzyme xylanase; cellulose; alpha-amilase; protease vào trong khẩu phần ngũ
cốc có tác dụng đáng kể trong việc cải thiện tăng trọng, giảm chi phí thức ăn, nâng cao tỷ lệ
tiêu hóa năng lượng, protein và acid amin trong khẩu phần so với không bổ sung (Gdala et
al., 1997; Yin et al., 2000; Barrera et al., 2003).
1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu trên thế giới về các enzyme sử dụng bổ sung thức ăn chăn nuôi đã tiến đượ
c
bước dài. Những enzyme sử dụng bổ sung thức ăn chăn nuôi đã được nhiều công ty hàng đầu
trên thế giới sản xuất từ hai chục năm nay, đã được ứng dụng thường quy ở những nước công

ng
vật chăn nuôi và với mọi nguyên liệu làm thức ăn để tạo điều kiện dễ dàng cho các
nghiên cứu về giá thành – lợi nhuận.
3
9. Nghiên cứu tác động của enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi làm giảm ô nhiễm môi
trường, phân chia dinh dưỡng và thay đổi đáp ứng nội tiết tố và tình trạng sức khỏe
của động vật.
Rõ ràng nghiên cứu và sản xuất enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi sẽ không ngừng phát
đạt, tăng tốc và thu được nhiều lợi nhuận. Lĩnh vực hấp dẫn của nghiên cứu sẽ tập trung vào
nghiên cứu và phát triển dinh dưỡng động vật trong tương lai.
Các hướng nghiên cứu (1-3) là những hướng nghiên cứu tương đối cổ điển: đánh giá tác
dụng của các loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi thương mại hoặc các enzyme đang
nghiên cứu trong phòng thí nghiệm lên năng suất chăn nuôi lợn, bò sữa, gà vịt, ngan ngỗng,
gà tây hoặc lên năng suất thu trứng và vắt sữa và mở rộng sang tất cả các động v
ật chăn nuôi
còn lại như cừu, dê, ngựa, cá, rùa và tất cả các loại động vật chăn nuôi khác. Các nghiên cứu
này nhằm đánh giá từng enzyme đơn lẻ một hoặc đánh giá hiệu quả chăn nuôi khi bổ sung
cùng một lúc nhiều enzyme khác nhau.
Các nguồn lựa chọn khác về enzyme (4) bao gồm: (4.1): Tìm kiếm những các nguồn vi
sinh vật mới tổng hợp ra các enzyme này, tối ưu nuôi cấy, lên men, sản xuất, tinh sạch và
đánh giá tính chất hóa lý. Hai hướng nghiên c
ứu tuy có vẻ cổ điển, nhưng họ sử dụng nhiều
phương pháp hiện đại hơn để đánh giá chính xác hơn như sử dụng phương pháp phân tử 16S,
18S, 26S hoặc 28S rRNA để phân loại vi sinh vật, sử dụng các loại kít có cột sắc ký hoặc
kích thước lỗ để tinh sạch enzyme sử dụng vào việc đánh giá tính chất hóa lý. (4.2): Tạo ra
các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp từ
các enzyme đã biết nhằm mục đích nâng
cao năng suất hoặc tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi cải biến từ những enzyme đã
có nhằm nâng cao hoạt tính thủy phân đặc hiệu. (4.3): Nhắm tới một tương lai xa hơn là
chuyển gene mã hóa các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi này vào những cây trồng để tạo

4
amino acid, ADG, và tỷ lệ thức ăn : tăng trọng; tuy nhiên, sự cải thiện này ít hơn khi bổ sung
amino acid tổng hợp (Barrera et al., 2003).
Omogbenigun et al. (2004) đã bổ sung các chế phẩm đa enzyme vào thức ăn của lợn con
và thấy rằng các chế phẩm multienzyme đã cải thiện hiệu quả sử dụng dinh dưỡng và tốc độ
sinh trưởng của lợn cai sữa. Đây là công thức thân thiện môi trường và hiệu quả
kinh tế cao
đối với thức ăn cho lợn con (Omogbenigun et al., 2004).
Cowieson và Adeola (2005) đã đánh giá các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi
carbohydrase, protease, và phytase. Họ thấy rằng các enzyme này có một tác dụng hỗn hợp
trong thức ăn chăn nuôi gà giò khi đồng thời cho bổ sung cùng các enzyme với nhau. Họ kết
luận sử dụng phytase và XAP (xylanase, amylase, phytase) đồng thời trong thức ăn cho gà
giò sẽ có hiệu quả kinh tế và có thể thu lợi nhuận khi chăn nuôi gia cầm (Cowieson and
Adeola, 2005). Sieo et al. (2005) đã
đánh giá mức độ ảnh hưởng của các chủng Lactobacillus
tái tổ hợp sinh tổng hợp -glucanase lên các tính chất của hệ tiêu hóa và sự di chuyển thức ăn
ở gà giò. Sự bổ sung các chủng Lactobacillus biến nạp vào thức ăn chăn nuôi đã cải thiện
được các tính chất của hệ tiêu hóa đồng thời nâng cao tốc độ di chuyển thức ăn trong ruột của
gà giò (Sieo et al., 2005).
Slominski et al. (2006) đã s
ử dụng công nghệ enzyme để cải thiện tình trạng sử dụng
năng lượng từ các hạt có dầu cho gia cầm. Họ đã đánh giá các công thức bổ sung enzyme
riêng lẻ khác nhau và tổ hợp từ các enzyme cellulose, xylanase, glucanase, pectinase,
mannanase. Bổ sung carbohydrase đa hoạt tính có thể được sử dụng làm công thức để cải
thiện tình trạng sử dụng năng lượng từ hạt lanh nhiều dầu, do đó nâng cao được giá trị dinh
dưỡng cho gia c
ầm (Slominski et al., 2006). Trong một nghiên cứu tương tự trước đó (Meng
et al. 2006) nhưng đối với hạt cải dầu, họ kết luận mặc dù tác dụng enzyme lên tiêu hóa mỡ ở
hệ tiêu hóa ruột mề ở mức độ rất đáng kể, các chỉ số khác cũng cho thấy cải thiện đáng kể chỉ
khi tỷ lệ thể vùi enzyme cao được sử dụng. Số liệu này củng cố s

Trong một nghiên cứu, Ciftci et al. (2005) đã đánh giá tác dụng của phytase vi khuẩn bổ
sung vào thức ăn chăn nuôi lên khối lượng thức ăn lấy vào, số lượng trứng đẻ và hiệu quả
thức ăn trong gà mái đẻ
trứng. Tuy nhiên, trọng lượng gà trước và sau khi cho ăn rất giống
nhau ở mọi lô thí nghiệm. Nhưng bổ sung phytase vi khuẩn đã cải thiện được tỷ lệ đẻ trứng rõ
ràng (Ciftci et al., 2005).
Rengasayee et al. (2005) đã tối ưu các thông số vận hành để sản xuất xylanase sử dụng
chủng tự nhiên Aspergillus bằng lên men mẻ chìm sử dụng thiết bị bán tự động. Đây là thí
nghiệm đầu tiên sử dụ
ng chủng nấm sợi để sản xuất enzyme ở Công ty Spic Biotech Ltd.
(nhà sản xuất chính các enzyme công nghiệp ở Ấn Độ), mà cho tới nay chỉ được sử dụng nuôi
cấy vi khuẩn. Sau khi lên men một số mẻ 200 lít để thu được các thông số về tốc độ khuấy,
sục khí, pH, độ nhớt, thể tích, hoạt tính enzyme, nhiệt độ, họ đã nâng lên quy mô lên men
1500 lít rồi 9000 lít để sản xuất enzyme (Rengasayee et al., 2005).
1.1.2 Tìm các nguồn enzyme mới
M
ặc dù trên thế giới đã có hàng trăm công ty sản xuất các loại enzyme bổ sung thức ăn
chăn nuôi và bán trên thị trường, nhưng các phòng thí nghiệm trên thế giới vẫn không ngừng
nghiên cứu, tìm tòi các enzyme cùng loại nhưng từ những chủng chưa ai nghiên cứu tới để
tìm ra các ưu thế vượt trội hoặc tìm ra các giải pháp thay thế, vướng mắc trong việc mua bán
bản quyền, vần đề cạnh tranh giữa các công ty.
Boyce và Walsh (2007) đã sản xu
ất, tinh sạch và đánh giá định hướng ứng dụng -
glucanase từ Rhizomucor miehei DSM 1330. Họ sử dụng môi trường cám lúa mỳ cho sinh
trưởng và cảm ứng sinh tổng hợp -glucanase ngoại bào từ R. miehei. Enzyme được tinh sạch
đồng nhất. Tính đặc hiệu cơ chất và độ tương đồng protein cho thấy đây là một endo-1,3(4)-
-glucanase (EC 3.2.1.6). Enzyme này có tiềm năng ứng dụng cho thức ăn chăn nuôi gia
cầm. Nó có hoạt tính đáng k
ể ở dãy pH pH 2,6-6,5 đặc trưng của bộ máy tiêu hóa loài chim.
Enzyme cũng bền nhiệt hơn các loại -glucanase thương mại đang có, đặc biệt khi hâm nóng

nâng cao năng suất tổng hợp, hoạt tính riêng và chuyển enzyme sinh tổng hợp từ tế bào chủ
gây độc sang tế bào chủ không độc hại đối với động vật chăn nuôi hoặc từ tế bào chủ khó lên
men, môi trường đắt tiền sang tế
bào chủ dễ lên men, tận dụng được các phế thải nông công
nghiệp. Các công trình về nhân dòng và biểu hiện các enzyme cùng loại với các enzyme bổ
sung thức ăn chăn nuôi trên thế giới thì nhiều vô kể, nhưng các enzyme bổ sung thức ăn chăn
nuôi cũng được nhiều nhóm nghiên cứu nhân dòng, biểu hiện năng suất cao và đăng ký bản
quyền. Sau đây là những ví dụ thật tiêu biểu.
Onderci et al. (2006) đã đánh giá hiệu quả củ
a E. coli sinh tổng hợp -amylase từ
Bacillus stearothermophilus sự phát triển, sử dụng thức ăn và hình thái của ruột non của gà
giò cho ăn ngô. Gà được uống nước E. coli tái tổ hợp tăng trọng hằng ngày và cải thiện sự
chuyển hóa thức ăn. Cuối thí nghiệm, gà được uống nước chứa E. coli ăn nhiều hơn, lớn
nhanh hơn và chuyển hóa thức ăn tốt hơn gà đố
i chứng không cho uống. Sự hiện diện của vi
khuẩn cũng cải thiện sự tiêu hóa các hợp chất hữu cơ. Tuy nhiên, không có tác dụng đối với
dầu mỡ. Bổ sung E. coli làm giảm trọng lượng tụy tương đối, nhưng không ảnh hưởng trọng
lượng gan và độ dài của hệ thống ruột – mề. Độ dài lông nhung và chân lông thì tăng lên đối
với bổ sung vi khuẩn. Sự có mặt của gene hemoglobin vi khu
ẩn không gây sự khác biệt nào
đáng kể mà quan sát thấy. Số liệu này cho thấy bổ sung E. coli có khả năng sinh tổng hợp -
amylase đã cải thiện khả năng tiêu hóa thức ăn và tốc độ sinh trưởng của gà giò cho ăn ngô
(Onderci et al., 2006).
Sieo et al. (2005) đã đánh giá sự ảnh hưởng của các chủng tái tổ hợp Lactobacillus sinh
-glucanase lên các tính chất hệ thống tiêu hóa và tốc độ đưa thức ăn
ở gà giò. Bổ sung các
chủng Lactobacillus biến nạp vào thức ăn gà giò làm giảm đáng kể độ keo nhớt dịch ruột 21-
46% so với gà cho ăn thức ăn không được bổ sung hoặc bổ sung các chủng Lactobacillus tự
nhiên. Trọng lượng tương đối của tụy, gan, hệ thống ruột mề, ruột kết giảm 6-27%, và độ dài
tương đối của hệ thống ruột mề giảm 8-15%. Kiể

max
75714,54 mol/phút mg, sử dụng xylan bạch dương làm cơ chất. Ngoài ra,
enzyme tinh sạch có độ bền pH rộng 4-10 khi ủ ở 40C trong 4 giờ (Chantasingh et al.,
7
2006). Enzyme này giữ được 90% hoạt tính khi ủ ở 50C, 30 phút. Nó có tiềm năng ứng dụng
trong công nghiệp thức ăn chăn nuôi và bột giấy.
- amylase (EC 3.2.1.1) từ chủng Gram dương Alicyclobacillus acidocaldarius là một
enzyme ưa acid nhiệt, với nhiệt độ và pH tối ưu lần lượt là 75C và 3 (Yuan et al., 2005).
Trình tự nucleotide của gene amy được nhân dòng bằng PCR. Gene amy (3901bp) gồm một
khung đọc mở mã hóa một polypeptide (1301 aa). Khối lượng tính toán của 
-amylase AMY
~140 kDa. Gene amy được biểu hiện ở E. coli BL21 (DE3) và P. pastoris đều có hoạt tính
sinh học. Hoạt tính amylase biểu hiện trong P. pastoris được chứng minh bằng nhuộm hoạt
tính amylase. -amylase biểu hiện trong P. pastoris được tinh sạch và đánh giá tính chất.
Khối lượng phân tử rõ ràng ~160 kDa trên SDS-PAGE. pH tối ưu của enzyme là pH 3,2 như
enzyme tự nhiên; nhưng nhiệt độ tối ưu là 65C thấp hơn một chút so với enzyme tự nhiên.
Khoảng 50% ho
ạt tính tương đối giữ được sau khi ủ 30 phút ở 70C. Như vậy enzyme biểu
hiện trong P. pastoris cũng là ưa acid nhiệt. Ngoài ra trình tự được nhân dòng bằng PCR,
nằm từ +1174 bp đến +3288 bp trên gene amy, mã hóa 705 aa với khối lượng phân tử tính
toán 79 kDa. Gene cắt bới đầu amy' được biểu hiện trong E. coli BL21 (DE3), cảm ứng bởi 1
mM IPTG, cũng giữa nguyên hoạt tính -amylase.
Phytase có thể làm tăng giá trị dinh dưỡng của thức
ăn khi giải phóng ra phosphate vô cơ
từ phytate, dạng dự trữ chính của phosphorus ở thực vật. Phytase (phyC) từ chủng Bacillus
subtilis VTT E-68013 được biểu hiện ở Lactobacillus plantarum chủng 755 sử dụng tín hiệu
tiết từ Lact. amylovorus (Kerovuo and Tynkkynen, 2000). Trong dịch nuôi cấy qua đêm trong
môi trường MRS chứa cellobiose để cảm ứng -amylase promoter, phytase hoạt động xúc tác
được tiết ra như một protein ngoại bào chủ yếu. Tuy nhiên, phân tích lai Western cho thấy
phytase được cải biến và không c

8
beta-glucan lúa mạch và lichenan làm cơ chất. Ở quy mô lên men phòng thí nghiệm, nồng độ
protein tiết ra vào khoảng 250 mg/l. Hoạt tính -glucanase lần lượt là 334 và 257 IU/ml với
beta-glucan lúa mạch và lichenan làm cơ chất; tuy nhiên, không hoạt tính enzyme về
cellulose được quan sát thấy. So với đối chứng không tối ưu, mức độ biểu hiện của -
glucanase tối ưu dựa trên các codon thích hợp trong P. pastoris cao gấp 10 lần. Enzyme được
tối ưu codon chiếm khoảng 53,8% protein tiết ra tổng số.
Độ acid và nhiệt độ và tối ưu của
enzyme tái tổ hợp này lần lượt là pH 6 và 45C.
Xylanase TB lai được thiết kế bằng cách thay thế phân đoạn đầu N của S. olivaceoviridis
xylanase XYNB với vùng tương ứng của Thermomonospora fusca xylanase TfxA (Yang et
al., 2006 ).Gene lai tb, mã hóa TB, được biểu hiện đúng ở E. coli BL21 và P. pastoris
GS115. TB được tinh sạch và đánh giá tính chất. Nhiệt độ và pH tối ưu của TB là 70C và 6,
rõ ràng được cải thiệ
n hơn so với XYNB. Độ bền nhiệt TB cao gấp 6 lần so với XYNB sau
khi ủ các dịch enzyme ở 80C và 90C trong 3 phút. Độ bền pH của TB thấp hơn 5-9 lần so
với của XYNB. Tuy nhiên, TB vẫn có hoạt tính riêng cao như XYNB. Phân tích độ tương
đồng trình tự để tìm ra các yếu tố ảnh hưởng tới tính chất và mối quan hệ giữa cấu trúc và
chức năng của enzyme TB.
1.1.4 Chuyển gene mã hóa enzyme vào thực vật
Có thể nói ý tưở
ng chuyển gene mã hóa enzyme bổ sung trực tiếp vào thực vật, nguồn sản
xuất thức ăn chăn nuôi sau này là một ý tưởng hay, đón đầu tương lai. Trong một tương lai
gần, ngay bản thân nguồn sản xuất thức ăn chăn nuôi đã chứa rất nhiều enzyme bổ sung thức
ăn chăn nuôi rồi, thì người ta không còn phải sản xuất enzyme bổ sung riêng nữa. Hiện nay,
trên thế giới người ta đã tiến rấ
t sâu theo hướng nghiên cứu này, tới giai đoạn đánh giá các
loại thức ăn đã chuyển gene mã hóa enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi lên năng suất chăn
nuôi động vật.
Giá trị dinh dưỡng thấp của hạt lúa mạch đối với gia cầm là nguyên nhân của sự vắng mặt

Bổ sung 75 hoặc 151 g/kg mạch nha chuyển gene chứa 4,7 hoặc 98 mg/kg -glucanase ưa
nhiệt vào 545 hoặc 469 g/kg lúa mạch không chuyển gene làm tăng trọng lượng gà giò
Cornish Cross như thức ăn ngô sử dụng hiện nay. Gene mã hóa enzyme được biểu hiện trong
hạt aleurone với một promoter của gene
-amylase lúa mạch và enzyme được tổng hợp với
peptide tín hiệu để tiết vào nội nhũ của hạt mạch nha (von Wettstein et al., 2003).
Trọng lượng cũng đạt tương đương khi cho thức ăn bao gồm 39 g/kg hạt lúa mạch chuyển
gene (chứa 66 mg/kg -glucanase ưa nhiệt) và 581 g/kg lúa mạch không chuyển gene thay
cho ngô hạt. Ở đây, gene mã hóa enzyme được biểu hiện với promoter của gene D-hordein
(Hor3-1) trong quá trình chín hạt. Enzyme được tổng hợp dưới dạ
ng tiền thân có peptide tín
hiệu vaccine đi qua lưới nội chất vào các không bào dự trữ. Enzyme được cất dưới dạng
protein dự trữ prolamin của nội nhũ, bảo vệ nó không bị phân hủy trong quá trình tế bào chết
theo lập trình của nội nhũ ở giai đoạn cuối của quá trình chín hạt và tạo ra độ bền nhiệt khác
thường. Một lượng lớn -glucanase hoạt tính cao trong hạt chín cho phép giảm thành phần
hạt chuyể
n gene xuống còn 0,2 g/kg thức ăn như các muối khoáng được bổ sung vào thức ăn
chuẩn (von Wettstein et al., 2003).
Bổ sung hạt chuyển gene (1 g/kg thức ăn) và bổ sung enzyme thương mại Avizyme 1100
(1 g/kg) cho trọng lượng, tiêu hao thức ăn và hiệu quả thức ăn tương đương ở gà giò cho ăn
thức ăn hạt lúa mạch. Đặc tính ỉa phân dính ở gà giò được loại bỏ với cả 9 thí nghiệm thức ăn
và giảm xu
ống mức quan sát thấy với thức ăn ngô chuẩn khi bổ sung lúa mạch chuyển gene
(von Wettstein et al., 2003). Sự tăng trọng tốt và sống sót bình thường của 400 gà giò kiểm
tra trên thức ăn lúa mạch được bổ sung hạt chuyển gene hoặc mạch nha chỉ ra rằng hạt và
mạch nha đều không độc hại.
Thức ăn hạt lúa mạch với hạt hoặc mạch nha chuyển gene bổ sung có -glucanase ưa
nhiệt là m
ột lựa chọn thân thiện môi trường so với bổ sung enzyme, do nó sử dụng năng
lượng quang tổng hợp để sản xuất enzyme trong hạt vì vậy tránh sử dụng năng lượng không

olivaceoviridis A1 trong cây khoai tây chuyển gene (Solanum tuberosum L.). Protein tái tổ
hợp XYNB đạt tới 5% protein lá hòa tan tổng số trong tế bào chất. Trong dịch chiết thân và
lá, hoạt tính xylanase đạt tới 87 M/min/g lá tươi (9,7 M/min/mg protein hòa tan tổng số).
Xylanase bền ở 60C và 70C trong đệm pH 5,2 tớ
i 5 phút. Hơn nữa, hoạt tính xylanase giữ
nguyên không thay đổi qua nhiều thế hệ khoai tây. Những kết quả này chứng minh rằng
khoai tây chuyển gene có thể được sử dụng để sản xuất ra xylanase với hoạt tính enzyme
riêng cao và có thể là một giải pháp khác đối với cách bổ sung xylanase ngày nay vào thức ăn
chăn nuôi (Yang et al., 2007).
1.2 Tình hình sản xuất enzyme bổ sung thức ăn gia súc trên thế giới
Novozymes A/S có thể nói là một trong những công ty hàng đầu trên thế gi
ới sản xuất các
loại enzyme công nghiệp trong đó có công nghiệp bột giặt, công nghiệp dệt, công nghiệp
thuộc da, công nghiệp chế biến thực phẩm và công nghiệp sản xuất enzyme bổ sung thức ăn
gia súc. Trong dòng enzyme bổ sung thức ăn gia súc phải kể đến các loại Ronozyme mà
hãng sản xuất chứa một trong các enzyme xylanase, protease, glucanase, phytase, pectinase,
amylase, cellulose (www.novozymes.com). Theo danh mục hàng hóa nhập khẩu vào Việt
Nam của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (90/2006/QĐ-BNN ngày 02/10/2006), các
sản phẩm này
được phép nhập về Việt Nam.
Công ty hóa chất lớn của Đức BASF cũng sản xuất rất nhiều chế phẩm enzyme bổ sung
thức ăn chăn nuôi như các loại Natuphos và Natugrain chứa phytase và xylanase tương
ứng (www.nutrition.basf.com). Các sản phẩm thương mại được đóng gói dưới dạng khô hoặc
dịch lỏng.
Công ty sản xuất enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi lớn khác trên thế giới là Danisco
Animal Nutrition (Đan Mạch, Anh Qu
ốc, www.danisco.com) với các dòng sản phẩm
Avizyme, Grandazym, Porzyme chứa enzyme đơn hoặc các tổ hợp enzyme khác nhau bao
gồm xylanase, glucanase, subtilisin, amylase, pectinase.
Vào năm 1975, một công ty của Mỹ US Kcmlri Co. khởi động với enzyme thức ăn gia

gia súc và gia cầm, người ta đã nghiên cứu, sản xuất và đánh giá hiệu quả của các ch
ế phẩm
đa enzyme cao hơn so với các chế phẩm đơn enzyme. Omogbenigun et al. (2004) đã bổ sung
các chế phẩm đa enzyme vào thức ăn của lợn con và thấy rằng các chế phẩm multienzyme đã
cải thiện hiệu quả sử dụng dinh dưỡng và tốc độ sinh trưởng của lợn cai sữa. Đây là công
thức thân thiện môi trường và hiệu quả kinh tế cao đối với thức ăn cho lợn con
(Omogbenigun et al.
, 2004).
Cowieson và Adeola (2005) đã đánh giá các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi
carbohydrase, protease và phytase. Họ thấy rằng đa enzyme này có một tác dụng hỗn hợp
trong thức ăn chăn nuôi gà giò khi đồng thời cho bổ sung cùng các enzyme với nhau. Họ kết
luận sử dụng phytase và XAP (xylanase, amylase, phytase) đồng thời trong thức ăn cho gà
giò sẽ có hiệu quả kinh tế và có thể thu lợi nhuận khi chăn nuôi gia cầm (Cowieson and
Adeola, 2005).
Slominski et al. (2006) đã sử dụng công nghệ enzyme để cải thiện tình trạ
ng sử dụng
năng lượng từ các hạt có dầu cho gia cầm. Họ đã đánh giá các công thức bổ sung enzyme
riêng lẻ khác nhau và tổ hợp từ các enzyme cellulase, xylanase, glucanase, pectinase,
mannanase. Kết quả nghiên cứu này cho thấy rằng bổ sung carbohydrase đa hoạt tính có thể
được sử dụng làm công thức để cải thiện tình trạng sử dụng năng lượng từ hạt lanh nhiều dầu,
do đó nâng cao được giá trị dinh dưỡng cho gia cầm (Slominski et al., 2006). Trong m
ột
nghiên cứu tương tự trước đó (Meng et al., 2006) nhưng đối với hạt cải dầu, họ kết luận mặc
dù tác dụng enzyme lên tiêu hóa mỡ ở hệ tiêu hóa ruột mề ở mức độ rất đáng kể, các chỉ số
khác cũng cho thấy cải thiện đáng kể chỉ khi tỷ lệ thể vùi enzyme cao được sử dụng. Số liệu
này củng cố sự
cần thiết bổ sung carbohydrase cho thức ăn gia cầm có hạt cải có nhiều dầu.
Olukosi et al. (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng liên quan tới thời gian chăn nuôi của dịch
chiết xylanase, amylase, và protease hoặc phytase đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau trong chăn
nuôi gà giò. Nghiên cứu này chỉ ra rằng sự kết hợp XAP (xylanase, amylase, và protease) và

trình chưa đăng ký bản quyền và ít được các công ty sản xuất thức ăn chăn nuôi quan tâm tới.
Các hướng tìm ra các nguồn vi sinh vật mới (đối với Việt Nam) để sinh tổng hợp các enzyme
bổ sung thức ăn chăn nuôi cũng thường không được chú trọng phát triển tiếp.
Các hướng tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chă
n nuôi tái tổ hợp hoặc cải biến di
truyền, hoặc tạo ra các nguyên liệu làm thức ăn có sẵn các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi
ở Việt Nam đang ở thời kỳ manh nha. Hiện nay đã có một số nhóm nghiên cứu ở Việt Nam
đã và đang tạo ra các enzyme tái tổ hợp sử dụng làm thức ăn chăn nuôi như Quyền Đình Thi
et al. về các enzyme cellulase (Trịnh Đình Khá et al., 2007c; Trịnh Đình Khá et al., 2007d),
protease (Nguyễn Thị Thảo and Quyền Đình Thi, 2004; Quyền Đình Thi and Trần Thị Quỳnh
Anh, 2007b) và mannanase (Nguyễn Sỹ Lê Thanh et al., 2006); Đỗ Thị Ngọc Huyền (nhóm
Nguyễn Thị Thùy Châu, Viện Sau thu hoạch) về phytase phân lập từ chủng Bacillus (Đỗ Thị
Ngọc Huyền et al, 2005; Đỗ Thị Ngọc Huyền, 2007). Đương nhiên hướng cải biến các
enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi có sẵn càng chưa có điều kiện
để phát triển ở Việt Nam
cũng như tạo nguyên liệu làm thức ăn có sẵn enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi. Các nhóm
chuyển gene vào thực vật ở Việt Nam hiện nay mới quan tâm đến các gene kháng sâu bệnh
(rầy nâu, khô văn) và các gene chống chịu các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như khô hạn, úng
ngập, mặn, phèn chua.
Các hướng khác như chuẩn hóa phương pháp đánh giá tác dụng của enzyme thức ăn ch
ăn
nuôi, đánh giá đáp ứng đối với enzyme thức ăn chăn nuôi của động vật được cho ăn, xây
dựng mô hình hay đánh giá quan tâm tới giảm thiểu ô nhiêm môi trường hầu như là con số
zero ở Việt Nam. Rất ít các công trình nghiên cứu cơ bản về những hướng đi này.
Tóm lại khác biệt về trình độ khoa học và công nghệ trong nước và thế giới trong lĩnh vực
enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi c
ả bề sâu lẫn bề rộng.
1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước trong thời gian qua
Để phát triển chăn nuôi lợn, gà hàng hóa thì vấn đề giảm giá thành sản xuất, giải quyết
hiệu quả nguồn nguyên liệu thức ăn có lợi thế trong nước nhằm đảm bảo một nền chăn nuôi

đó vi sinh vật chứa rất nhiều loại enzyme và các enzyme vi sinh vật này có hoạt lực khá cao.
Thêm vào đó, chúng sinh sản khá nhanh, dễ nuôi cấy và môi trường lên men lại là các phụ
phẩm nông nghiệp rẻ tiền, sẵn có ở nước ta như: cám gạo, trấu, bã mía, bã khoai mỳ (sắn).
Ở Việt Nam, nhiều tác giả đã nghiên cứ
u về các enzyme bổ sung thức ăn gia súc, đặc biệt
từ các chủng vi sinh vật nhưng các kết quả nghiên cứu này vẫn còn nhiều hạn chế, cho nên
việc áp dụng các sản phẩm enzyme trong nước trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi vẫn
chưa được cơ sở sản xuất thức ăn quan tâm. Nguyên nhân chủ yếu là do năng suất sinh tổng
hợp của các enzyme tự nhiên còn thấp, chất lượng các enzyme tự nhiên không
được cải biến
bằng các kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại và hầu hết các chế phẩm enzyme bổ sung cho
thức ăn chăn nuôi đã được các nhóm nghiên cứu đều ở dạng đơn enzyme. Do đó các chế
phẩm này chưa cạnh tranh được với các chế phẩm ngoại nhập là các chế phẩm đa enzyme và
đã có cải biến về di truyền, sử dụng các chủng vi sinh vật tái tổ h
ợp.
Chính vì vậy, mục tiêu của đề tài là chọn lọc các chủng vi sinh vật tự nhiên có khả năng
tổng hợp các các enzyme như lactase, xylanase, glucanase, phytase, subtilisin, lipase và
amylase), kế đến là tạo ra các chủng tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp các enzyme trên
với năng suất, hoạt lực cao; bước kế đến là xây dựng được các quy trình sản xuất các enzyme
tái tổ hợp và nguyên thủy năng suất cao và cuối cùng là lên men tạo chế phẩm đa enzyme bổ
sung thức ăn cho gia súc.

Trong một thời gian tương đối dài, ở Việt Nam đã có nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau
thực hiện các công trình nghiên cứu liên quan tới enzyme bổ sung thức ăn gia súc. Thành tựu
bước đầu đạt được rất đáng kể. Hầu hết các nhóm nghiên cứu đều tập trung vào khâu tuyển
chọn các chủng vi sinh vật tự nhiên trong các mẫu đất, phân, nước thải, có hoạt tính thủy
phân chất xơ, tinh bột, protein. Sau đó họ ch
ọn các chủng có hoạt tính cao nhất rồi nuôi cấy
phòng thí nghiệm và đánh giá một số tính chất hóa lý, và thực hiện các thí nghiệm phối trộn
với thức ăn gia súc và đánh giá hiệu quả của các chế phẩm enzyme này.

hiện đề tài "Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế phẩm sinh h
ọc có nguồn gốc từ men vi sinh
trong khẩu phần của bò sữa và bê". Cũng trong năm, Viện Sinh học Nhiệt đới thông báo đã
sản xuất được các chế phẩm enzyme bằng phương pháp vi sinh vật: -Amylase từ
Aspergillus oryzae và Bacillus subtilis; hoạt tính 15 đơn vị/g; sử dụng vào thức ăn gia súc với
nhiệt độ và pH thích hợp lần lượt là 60C, pH 6 và 80C, pH 6-6.5; phân giải tính bột thành
các dextrin và đường. Chế phẩm cellulose từ
Aspergillus oryzae và Trichoderma viride; bổ
sung vào thức ăn gia súc; phân giải cellulose thành các dextrin, đường; nhiệt độ và pH thích
hợp 40C, pH 5-6. Các chế phẩm này ứng dụng vào thức ăn gia súc nhằm tăng khả năng tiêu
hóa thức ăn, tăng sản lượng thịt, sữa, đạt hiệu quả kinh tế cao với chi phí thấp. Năm 2002, Võ
Thị Hạnh (Viện Sinh học Nhiệt đới) chủ nhiệm đề tài "Nghiên cứu để sản xuất ch
ế phẩm hỗn
hợp vi sinh vật sống và enzyme dùng trong chăn nuôi (heo) và thủy sản (tôm)".
Năm 2004 ở Thành phố Hồ Chí Minh, một số đề tài liên quan tới việc sản xuất các
enzyme bổ sung cho thức ăn gia súc cũng đã được tiến hành. Trần Thạnh Phong (Trung tâm
Phát triển Khoa học và Công nghệ Trẻ) đã “Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme
xylanase từ Trichoderma reesei và Aspergillus niger trên môi trường lên men bán rắn”. Chế
phẩm sinh học từ bã mía dùng b
ảo quản cỏ xanh làm thức ăn cho gia súc: Hướng nghiên cứu
này vừa được Trần Thạnh Phong, Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM, thực hiện thành công.
Trần Thạnh Phong và nhóm cộng sự đã tận dụng nguồn phế liệu bã mía kết hợp với cám mì,
dùng phương pháp công nghệ sinh học (lên men bán rắn) để tổng hợp thành chế phẩm sinh
học, mang tên là chế phẩm enzyme xylanase. Chế phẩm này kết hợp với chế phẩ
m VEM
(chứa nhóm vi khuẩn lactic và nấm men) dùng vào việc ủ cỏ xanh (hoặc các phế phẩm nông
nghiệp khác như bắp, đậu) có tác dụng duy trì được một thời gian dài giá trị dinh dưỡng của
cỏ như là lúc mới thu hoạch. Giải pháp này đã thiết thực đáp ứng cho vấn đề bảo quản dự trữ
nguồn thức ăn cho gia súc. Đinh Minh Hiệp (Trung tâm Phát triển Khoa học và Công nghệ
Trẻ) đã thực hiệ

ổ hợp
Phòng CNSH Enzyme (Viện CNSH) đã và đang triển khai các đề tài nghiên cứu theo
hướng tạo ra các chủng vi sinh vật tái tổ hợp sinh tổng hợp các enzyme sử dụng bổ sung vào
thức ăn chăn nuôi như protease (Quyền Đình Thi et al., 2006; Quyền Đình Thi and Trần Thị
Quỳnh Anh, 2007a), mannanase (Nguyễn Sỹ Lê Thanh et al., 2006), cellulase (Trịnh Đình
Khá et al., 2007b; Trịnh Đình Khá et al., 2007a), lactase (ĐTCS: Nghiên cứu nhân dòng, biểu
hiện enzyme lactase từ một chủng vi sinh v
ật và định hướng ứng dụng bổ sung vào sữa và các
sản phẩm từ sữa), lipase (Quyền Đình Thi et al., 2006; Quyền Đình Thi and Trần Thị Quỳnh
Anh, 2007a; Quyen et al., 2007). Có enzyme đã được biểu hiện năng suất cao trong E. coli,
đánh giá tính chất hóa lý và sẽ được biểu hiện trong nấm men và Bacillus như protease,
mannanase và lipase. Trong luận văn nghiên cứu sinh của Đỗ Thị Ngọc Huyền, tác giả cũng
nhân dòng, đọc trình tự, phân tích và
đăng ký GenBank một gene mã hóa phytase từ Bacillus
subtilis. Sau đó tác giả đã biểu hiện thành công ở E. coli và đánh giá tính chất hóa lý (Đỗ Thị
Ngọc Huyền, 2007).
Tuy nhiên để sử dụng các chủng vi sinh vật tái tổ hợp sản xuất các enzyme bổ sung thức
ăn chăn nuôi tái tổ hợp thì bắt buộc phải chuyển các gene trên vào các chủng sản xuất như
Bacillus subtilis, Lactobacillus, Aspergillus niger và Trichoderma. Hiện nay Phòng CNSH
Enzyme đang tiếp cận các phươ
ng pháp xây dựng vector chuyên biểu hiện ở các hệ thống tế
bào chủ Bacillus và nấm sợi và các phương pháp biến nạp vector vào các hệ thống tế bào chủ
này. Đây sẽ là khâu khó khăn nhất, vì hầu hết các phòng thí nghiệm công nghệ sinh học ở
Việt Nam đều chỉ sử dụng các loại vector biểu hiện ở E. coli hoặc nấm Pichia pastoris, mang
tính nghiên cứu nhiều hơn. Hơn nữa E. coli không thể s
ử dụng cho lợn ăn được.
1.5.2 Tình hình nhập khẩu và liên doanh sản xuất
Hiện nay trên thị trường Việt Nam đã bán các sản phẩm enzyme sử dụng bổ sung vào
thức ăn chăn nuôi cho các đối tượng bò, lợn, gà, vịt. Những sản phẩm này đều được sản xuất
ở nước ngoài. Nếu các cơ sở sản xuất trong nước có khả năng sản xuất được các chế phẩm

cao đã được chứng minh qua hàng trăm công trình nghiên cứu đã được công bố
trên các tạp chí quốc tế (Nsereko et al., 2002; Omogbenigun et al., 2004; Ciftci et al., 2005;
Cowieson and Adeola, 2005; Wu et al., 2005; Slominski et al., 2006; Balci et al., 2007;
Olukosi et al., 2007). Chính vì hiệu quả kinh tế cao cho nên hàng chục công ty lớn trên thế
giới đã và đang sản xuất các chế phẩm enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi như Novozymes
A/C (Đan mạch), BASF (Đức), Danisco Animal Nutrition (Đan Mạch, Anh Quốc), Alltech
Inc. (Mỹ) từ hơn chục năm nay.
Trong đề tài chúng tôi đề xuất sẽ sử dụng các chủng vi sinh vật như Aspergillus niger và
Bacillus subtilis để sản xuất các loại enzyme như trên. Các chủng vi sinh vật này hoàn toàn là
những chủng vi sinh vật an toàn đối với người và động vật. Bacillus subtilis là chủng vi sinh
vật được sử dụng bổ sung vào hệ thống vi sinh vật tiêu hóa ở người, động vật, tôm cá từ lâu.
Theo các tiêu chuẩn của FDA (Mỹ) và các tiêu chuẩn của Châu Âu, các chủng này hoàn toàn
an toàn đối v
ới động vật.
Trong số các chủng Aspergillus, Aspergillus oryzae và Aspergillus niger được công nhận
là chủng an toàn “the Generally Recognized as Safe (GRAS)” trong danh sách của Tổ chức
Thuốc và Thực phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration (FDA) ở Hoa Kỳ.
Tất cả các công trình nghiên cứu ở Việt Nam về các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi
đều đã sử dụng các chủng Bacillus subtilis và Aspergillus niger để sản xuất enzyme và bổ
sung trực tiếp vào thức ăn mà không có vấn đề gì về
độc hại. Trong đề tài này, các chủng E.
coli tái tổ hợp được sử dụng để nghiên cứu các tính chất hóa lý của enzyme tái tổ hợp, chứ
không được sử dụng trực tiếp để sản xuất enzyme tái tổ hợp dùng bổ sung vào thức ăn chăn
nuôi. Do vậy vấn đề an toàn của các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi ở đề tài này hoàn
toàn tuân thủ theo các quy định chung của quốc tế lẫn Việt Nam.
2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Chủng vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật dùng để khảo sát hoạt tính enzyme do phòng CNSH Enzyme (Viện
CNSH) sưu tập và phân lập: 137 chủng Aspergillus (Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh

4.10
-5
% biotin; 1% (v/v) glycerol hoặc 0,5% (v/v) methanol
SPII 10 ml T-base; 200 µl 25% glucose; 100 µl 1% casamino acid;
35 µl 1 M MgCl
2
hoặc MgSO
4
; 50 µl 0,1 M CaCl
2

T-base (1 lít) 2 g (NH4)
2
SO
4
; 18,3 g K
2
HPO
4
. 3H2O; 6 g KH2PO4; 1 g natri-citrate
Môi trường phục hồi
AMMREG
(Regeneration
medium)
NaNO
3
, 6,0 g/liter; KCl, 0,52; g/liter; KH
2
PO
4

7
.10H
2
O, 0,1 g/liter; (NH
4
)
6
Mo
7
O
24
.4H
2
O, 0,05 g/liter]; 200g sucrose;
16g agar; 1 lit H
2
O khử ion.
Czapek 0,2% (w/v) NaNO3; 0,1% (w/v) K2HPO4; 0,05% (w/v) MgSO4; 0,05%
(w/v) KCl; 2% (w/v) sucrose; pH 6,5. Môi trường thạch được bổ sung 2%
(w/v).
CM (Complete
medium)
10ml solution A (10% Ca(NO
3
)
2
); 10ml solution B (2% KH
2
PO
4


A,B,C (B); vector nhân dòng
pJET1.2/blunt (C).
2.5 Hóa chất
3,5-Dinitrosalisilic acid, D(+)-xylose, xylan từ bột mịn yến mạch được mua từ Fluka
(Đức); agarose, peptone và yeast extract từ từ Bio basic INC (Canada); D-glucose, methanol,
sodium chloride, sodium hydroxide, glycerol từ Merck (Đức), sodium dodecylsulfate từ
Sigma (Mỹ); gel DNA extraction kit (Promega), tryptone (Ấn Độ); Probond
TM
của
Invitrogen (Mỹ); Taq polymerase, EcoRI, XbaI, MssI, T4-ligase được mua từ Fermentas
(Litva), sorbitol từ Scharlau (Tây ban nha).
Các hóa chất khác được sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết.
2.6 Các bộ mồi
Các bộ mồi dùng trong thiết kế plasmid biểu hiện gene glucanase, mannanase, subtilisin,
xylanase trong pET22b
+
, pPICZαA và pAC7 được thể hiện ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các bộ mồi dùng trong thiết kế vector biểu hiện.
Tên mồi
Trình tự nucleotide 5'3'
Sản phẩm
pEcsubF GC GAATTC G GTGAGAAGCAAAAAATTG Preprosub
1146 bp
pEprosubF GC GAATTC G GGAAAAAGCAGTACAGAA Prosub
19
1056 bp
pEsubF GC GAATTC G GCGCAATCTGTTCC Sub 825 bp
pEsubR GC CTCGAG TTGTGCAGCTGCTTGTAC
acoAF GC GAATTC TCAGTCAAACGATGCAG

XlnDR CG GGATCC TCA GTGGTGGTGGTGGTGGTG
CGATAAAGTCCTCCCCTC

XlnBF CG AGATCT ATG CTCACCAAGAACCTTCTCC pANxlnB
XlnBR CGAGATCTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGAACAGTGATGG
2.7 Xác định hoạt tính
2.7.1 Xác định hoạt tính glucanase
Định tính

Nguyên tắc: CMC có trong thạch bị endo-β-1,4-glucanase thủy phân sẽ không bắt màu
với lugol. Môi trường thử hoạt tính enzyme [0,2% (w/v) CMC; 0,5% (w/v) KNO
3
; 0,35%
(w/v) KH
2
PO
4
; 0,0625% (w/v) MgSO
4
; 0,025% (w/v) cao nấm men; 1,8% (w/v) agar; pH 7]
được khử trùng và đổ vào đĩa peptri với độ dày ~4 mm. Mỗi đĩa thạch được đục 3 lỗ tròn
đường kính 7 mm.
Chủng B. subtilis CC được nuôi cấy trong môi trường MT1 và MT2. Sau các khoảng thời
gian nhất định, đánh giá khả năng thủy phân CMC của chủng vi khuẩn bằng cách rỏ 100 l
dịch vi khuẩn nuôi cấy vào các lỗ đục sẵn trên đĩa thạch và 100 l nước cất vô trùng cho lỗ
đối chứng. Ủ 30 phút các đĩ
a trên ở 4C, giúp enzyme có khả năng khuếch tán vào trong
thạch. Sau đó, để vào tủ ấm 37C. Sau 24 giờ nhỏ dung dịch lugol vào và tráng đều khắp mặt
thạch, để yên trong 15 phút. Gạn bỏ hết lugol và quan sát. Vùng CMC bị phân giải xung
quanh lỗ sẽ có màu trong suốt do không bắt màu của lugol. Đo đường kính vòng phân giải D-

2
-KI được bổ sung vào mỗi ống và trộn đều. Để ở 25C trong 1
giờ. Acid hóa với 5 ml 1,2 N phosphoric acid và trộn đều bằng đũa thủy tinh. Đo ở bước sóng
480 nm.
Xác định hoạt tính glucanase bằng cách xác định đường khử.
Theo phương pháp này, một đơn vị hoạt độ được xem là lượng enzyme trong 1 ml của
dung dịch tạo ra một lượng đường khử tương ứng với 0,5 mg glucose khi ủ ở 50C trong 20
phút, với 1 ml 1% CMC trong
đệm 0,1 M citrate, pH 5. Từ đó ta có đồ thị xác định hoạt tính
enzyme thông qua lượng đường khử tạo thành.
2.7.2 Xác định hoạt tính mannanase
Định tính:
Hoạt tính endo--1,4-mannanase được xác định tương đối theo phương pháp
khuếch tán enzyme trên đĩa thạch. Đĩa thạch chứa cơ chất 0,5% LBG trong đệm KP, dày
khoảng 0,5 cm được đục lỗ đường kính 0,5 cm. 50 l dịch enzyme được rỏ vào lỗ rồi ủ 12
giờ trong tủ lạnh cho enzyme khuếch tán. Sau đó, đĩa thạch được ủ 6 giờ ở 37C, rồi nhuộm
với 1% lugol. Bán kính vòng thủy phân R
halo
= R-r, với R là bán kính vòng ngoài tính từ tâm
lỗ đến mép ngoài cùng vòng thủy phân và r là bán kính lỗ, biểu thị hoạt tính tương đối của
enzyme.
Định lượng:
Hoạt tính -mannanase được xác định chính xác theo phương pháp quang
phổ (Miller, 1959), với cơ chất 0,5% LBG trong đệm 20 mM phosphate pH 7. Hàm lượng
đường khử giải phóng ra trong dung dịch phản ứng ở 40C trong 5 phút được đo bằng quang
phổ bước sóng 540 nm. Độ hấp phụ được đối chiếu với đường chuẩn nồng độ đường
mannose (hình 2.2) để tính hàm lượng đường giải phóng tương đương. Một đơn vị hoạt tính
mannanase được định ngh
ĩa là lượng enzyme xúc tác thủy phân giải phóng 1 mol manose
trong 1 phút ở điều kiện thích hợp.

Một đơn vị hoạt độ enzyme là lượng
enzyme xúc tác thủy phân 1 µmol mannose
trong 1 phút ở điều kiện thích hợp.
Hình 2.2. Đường chuẩn mannose.
2.7.3 Xác định hoạt tính subtilisin
Hoạt tính subtilisin với cơ chất casein được xác định theo phương pháp Anson cải tiến
(Phạm Thị Trân Châu). Đơn vị hoạt tính là lượng enzyme phân giải protein (casein) tạo thành
các sản phẩm hòa tan trong trichloracetic acid cho phản ứng màu với thuốc thử Folin trong 1
phút tương ứng với 1 µmol tyrosine ở điều kiện thí nghiệm theo công thức sau:




SE
T
VVT
Vmol
mlU

/
mol = số mol tyrosine
V
T
: tổng thể tích làm phản ứng (ml)
T: Thời gian làm ứng
V
E
: Thể tích enzyme tham gia phản ứng
V
S