KỸ THUẬT PHÂN TÍCH SINH HÓA
CÂU 1. NHỮNG CHẤT LÀM KẾT TỦA PROTEIN VÀ THU ĐƯỢC KẾT TỦA
Phương pháp tủa được sử dụng tương đối rộng rãi để thu nhận các phân tử sinh học mà
nhất là protein. Để tủa, người ta có thể dùng nhiều cách khác nhau: tủa bằng muối, tủa
bằng các dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch có chứa protein.

1. Tủa bằng muối
Đây là cách phổ biến để tủa protein. Khả năng hòa tan của protein tùy thuộc vào nhiều yếu
tố: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối…
Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối
cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out).
Đầu tiên, giả thuyết salting in ở nồng độ muối thấp được giải thích bởi Debye - Huckel.
Trong dung dịch, protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang điện tích trái
dấu. Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung môi, làm giảm các phân tử protein
không mang điện tích, do đó làm tăng tính tan của protein trong dung môi. Giả thuyết của
Debye – Huckel cho rằng: tính tan của protein được biểu diễn bằng một hàm logarit, giá trị
của hàm tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion trong dung dịch.
Thuật ngữ salting out trong môi trường có nồng độ muối cao được giải thích bởi
Kirkwood. Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình Solvate hóa,
giảm tính hòa tan của protein dẫn đến sự tủa.
Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn:
log S = B - KI
Trong đó
S: độ hòa tan của protein
B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ)
K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có trong dung dịch)
I: cường độ ion của muối.
Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối:

Hình 1. Độ tan theo nồng độ muối ( />
Những đường biểu diễn khác nhau tùy theo từng protein khác nhau. Vì thế, khi muốn tách

tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H
+
). Tại giá
trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không tích điện. Điều này làm giảm tính
tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác với môi trường, khi đó, các phân
tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường. Hiện tượng này được giải thích bằng phương trình
Cohn.
Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2 protein khác nhau thay đổi theo pH

Hình 2. Tỷ lệ protein tủa theo pH (

)

Phương pháp này thường dùng cho các protein đậu nành (có điểm đặng điện khoảng 4.6)

4. Tủa protein bằng các non – ionic polymer
Phương pháp này được thực hiện bằng cách cho thêm non – ionic vào trong dung dịch
protein. Khi thêm vào, số lượng các phân tử nước có thể tương tác được với protein giảm
xuống. Người ta thường sử dụng dextrans và polyethylen glycols.
µ
i
= µ
i
0
+ RT (ln m
i
+ f
ii
m
i

điện. Tại 1 giá trị pH nào đó (sau khi thêm non – ionic polymer) thì khả năng hòa tan của
protein cũng giảm xuống. Các ion non – ionic polymer thường sử dụng là các dung môi
hữu cơ như Ethanol hay Acetone. Các dung môi khác ít sử dụng vì khó thao tác và có thể
gây biến tính protein.

Chú ý:
- Nhiệt độ thấp làm tăng hiệu quả tủa và giảm sự biến tính protein.
- Nồng độ ion: 0.05 – 0.2.
- Đối với chất tan có trọng lượng phân tử càng cao thì lượng dung môi cần cho quá trình
tủa càng ít. Theo Scopes (1982), khi bắt đầu tủa protein bằng Acetone, nên tuân theo công
thức sau:
[(v/v)%] = 1.8 - 0.12 ln [MW]
Trong đó
(v/v)% là thể tích dung môi cần cho quá trình tủa – tính theo %
MW: trọng lượng phân tử của chất tan
Nếu trong hỗn hợp có sự hện diện của 2 protein, tính tan của protein này sẽ giảm vì sự hiện
diện của protein kia.
Thuận lợi của phương pháp tủa bằng cách sử dụng non – ionic polymers là protein sản
phẩm bền, và có thể sử dụng ở nhiệt độ phòng.

5. Tủa bằng ion kim loại
Trong phương pháp tủa này, ion kim loại sẽ gắn với một phần của phân tử protein. Thuận
lợi của phương pháp này là có thể tủa được protein trong một dung dịch rất loãng. Các ion
kim loại có thể chia làm ba nhóm. Các ion như Mn
2+
, Fe
2+
, Co
2+
, Ni

2. Chuyển mẫu protein vào trong các tube eppendorff thích hợp.
3. Thêm 4 lần thể tích acetone lạnh vào tube.
4. Vortex, ủ ở - 20
0
C trong 60 phút.
5. Ly tâm ở 13.000 – 15.000 x g trong vòng 10 phút.
6. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi. Tránh chạm tới phần cặn protein.
(Nếu muốn loại bỏ hoàn toàn các chất tạp nhiễm, có thể lặp lại các bước từ 2 – 6) trước khi
tiến hành bước 7)
7. Để cho acetone bay hơi tự do ở nhiệt độ phòng trong vòng khoảng 30 phút.

Tủa bằng Acetone/TCA (Trichloroacetic acid)
1. Chuẩn bị dung dịch TCA 10% trong aceton. Bảo quản ở - 20
0
C cho đến khi sử dụng.
2. Thêm 10 thể tích TCA 10% trong acetone vào mẫu. Vortex. Ủ ở - 20
0
C ít nhất 3h (tốt
nhất nên ủ qua đêm).
3. Ly tâm ở 15 000 x g trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi.
4. Thêm 1 thể tích acetone lạnh ( - 200C). Vortex. Để ở - 20
0
C ít nhất 10 phút.
5. Ly tâm 15000 x g trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi.
6. Để cặn khô tự nhiên trong không khí.

Tủa bằng TCA/DOC (Deoxycholate)
1. Chuẩn bị dung dịch DOC 2%.
2. Trộn mẫu với DOC 2% theo tỉ lệ 1/1000. Ủ trên đá 30 phút.
3. Thêm TCA 100% vào mẫu sao cho nồng độ cuối cùng của TCA là 15%. Vortex ngay

protein không trở về trạng thái dung dịch keo bền vững như trước nữa
CÂU 3.TRANG THÁI KEO LÀ GÌ??????????
Sol, còn gọi là dung dịch keo, là một hệ phân tán các hạt rắn kỵ dung môi có kích
thước từ 1 đến 1000 nanômét trong một chất lỏng, có thể được tạo thành từ một huyền
phù hay bằng cách hóa đặc. Các kỹ thuật huyền phù bao gồm cả việc nghiền nát chắt
rắn trong một máy nghiền. Hóa đặc hay các phương pháp kết tủa dùng chất kết tủa
(muối) hay thay đổi nhiệt độ để các hạt keo chuyển từ trạng thái dung dịch sang trạng
thái hệ keo. Người ta dùng các chất tạo huyền phù để tăng độ bền cho sol.
a). Khái niệm và phân loại hệ keo Các chất tồn tại dưới dạng các hạt có kích thước khác
nhau. Một số hạt như hạt cát có thể nhìn thấy bằng mắt thường; một số khác như các tế bào
vi khuẩn không thể nhìn thấy bằng mắt thường nhưng có thể quan sát thấy nhờ kính hiển vi
quang học; với các kính hiển vi chuyên dụng hiện đại có thể phát hiện được cả nguyên tử.
Người ta định nghĩa Các hạt có kích thước hơn phân tử và ion nhưng không đủ lớn để có
thể quan sát được bằng kính hiển vi quang học được gọi là các hạt keo.
Hạt keo là một hệ phức tạp tạo nên bởi một số lượng lớn khoảng từ nguyên tử,
có khối lượng khoảng đến 10
-7
cm.
Hạt keo có thể là chất vô cơ hay hữu cơ. Hầu như tất cả các chất đều có thể tồn tại ở dạng
keo.
Một hệ keo luôn luôn bao gồm các hạt keo gọi là chất phân tán và một chất làm môi trường
phân tán. Môi trường phân tán quan trọng thường gặp là nước và không khí.
b). Tính chất của hệ keo
Các hệ keo có tính chất tương tự như dung dịch. Các hạt keo không tách ra khỏi hệ như các
hạt có kích thước lớn khác, và có thể xuyên qua được giấy lọc. Tuy nhiên tốc độ khuếch
tán của các hạt keo trong hệ chậm hơn tốc độ khuếch tán của các hạt trong dung dịch như
phân tử và ion.
Sự tán xạ ánh sáng cũng là một thuộc tính quan trọng của hệ keo. Khi chiếu ánh sáng đi
qua một hệ keo ta có thể quan sát đường đi của chùm sáng từ mặt bên thẳng góc với
phương truyền của chùm sáng. Ðây là hiệu ứng Tyndall được dùng để phân biệt hệ keo với

.v.v. rất cần thiết cho sự hoạt động của enzym thuỷ phân axít nucleic. Nếu
trong dung dịch có EDTA, chất này sẽ liên kết với các ion hoá trị hai nói trên, liên kết
này dẫn tới sự ức chế hoạt động của enzym thuỷ phân axít nucleic, do vậy mà axít
nucleic sẽ không bị phân huỷ.
Tris: Axít nucleic còn bị ảnh hưởng rất lớn bởi độ axít và kiềm của dung dịch sử
dụng trong tách chiết, axít có thể làm cho axít nucleic bị gãy, chẳng hạn axít clohydric
(HCl) làm cho ADN bị đứt ở những vị trí purin, trong khi đó nếu ở nồng độ kiềm cao
thì ADN sẽ bị tách thành sợi đơn. Để loại trừ ảnh hưởng của axít và kiềm người ta đã
sử dụng Tris để điều chỉnh pH của dung dịch.
CTAB (Cetryl Ammonium Bromide): Là hoá chất dùng trong chiết suất axít
nucleic có hiệu quả cao và đang được sử dụng phổ biến hiện nay. CTAB dung dịch là
một dung môi có khả năng hoà tan cao axít nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với
vai trò là chất chính trong tách chiết axít nucleic. Để tăng hiệu quả hoạt động của
CTAB, mẫu đựơc xử lý với nhiệt khoảng từ 55
O
C đến 65
O
C. Ở nhiệt độ như vậy, nó
còn có tác dụng làm rách thêm màng tế bào và màng nhân để giải phóng tối đa lượng
axít nucleic ra dung dịch và làm biến tính một số protein, đặc biệt là enzym thuỷ phân
axít nucleic.
Chloroform: Trong dung dịch tách chiết, ADN tạo thành liên kết với CTAB, để
loại bỏ CTAB và đồng thời làm biến tính protein trong dung dịch cần sử dụng
chloroform. Sau đó dung dịch tách chiết được ly tâm, loại bỏ các tạp chất (bị kéo
xuống phần phía dưới ống nghiệm) còn lại axít nucleic hoà tan trong lớp dung dịch
nằm phía trên và được chuyển sang một ống nghiệm mới.
Ethanol hoặc isopropanol:
Ethanol thường được dùng trong môi trường dung dịch có lực ion, hay nồng độ
muối cao, trong điều kiện như vậy axít nucleic dễ dàng bị kết tủa, sự kết tủa của axít
nucleic sẽ đạt hiệu quả cao hơn nếu như được xử lý trong môi trường lạnh.

của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương
pháp sấy nhẹ bằng quạt gió.
II. Phương pháp tủa bằng muối
Người ta có thể dùng muối (NH
4
)
2
SO
4
, NaCl… để tủa protein vì các muối
này vừa làm trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện
trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein. Các protein khác nhau có
thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng
các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng.
CÂU 8.TÍNH CHẤT CỦA PHÂN TỬ
Háo nước,ưa nước. Kị nước.tao ko biết
CÂU 9.TAO KO BIẾT??????
CÂU 10.TRÍCH LY CÁM LẤY VITAMIN A?????????/
CÁM GẠO
(Bran rice)
I. Giới thiệu
Trong qui trình xay xát và chế biến gạo, sau khi thu được sản phẩm chính là gạo thì còn
một sản phẩm phụ có giá trị khá cao đó là cám gạo. Từ lâu cám gạo được các nhà máy xay
xát thu hồi và bán như là một sản phẩm chính chỉ sau gạo. Cám được thu hồi dưới hai dạng
là cám khô và cám ướt. Cám khô sẽ được sấy thêm lần nữa để bảo quản được lâu hơn, còn
cám ướt thường được bán cho các cơ sở nuôi cá da trơn sữ dụng ngay.
+ Cấu tạo và thành phần cám gạo:
Hình: Sơ đồ lớp cám trong hạt lúa
Cám gạo thường có dạng bột, mềm và mịn. Cám gạo chiếm khoảng 10-12% khối lượng lúa
chưa xay xát. Cám là hỗn hợp của lớp vỏ ngoài của hạt gạo và lớp aloron. Những thành

lại cân đối và có nhiều xơ dễ tiêu có thể xem là rất tốt cho cả con người.
Tuy nhiên cám thường được cho các loại gia súc và thủy sản ăn chứ không cho người.
Nguyên nhân là do cám có một số enzym (chất men) nội tại hoạt động rất mạnh sẽ oxy hóa
các nhóm béo chưa no của cám rất nhanh chỉ vài giờ sau khi chế biến tạo mùi hôi khó chịu.
Thêm vào đó do công nghệ xay xát gạo chưa cao lại ít được đầu tư theo hướng thu cám
sạch nên cám thường lẫn rất nhiều loại tạp chất (vỏ trấu, sạn đá….) Do lý do đó mà hầu hết
lượng cám thu được thường được bà con nông dân dùng nuôi các loại gia súc, gia cầm.
Hàng năm trên thế giới có khỏang 40 – 45 triệu tấn cám đưọc sản suất và 90% là nằm ở
châu Á ( xử lý cám gạo để thay thế ngũ cốc”)
No???? Phương pháp.ko tìm thấy
CÂU 10.QUANG PHỔ HẤP THU UV_VIS
Giới thiệu chung máy UV – Vis
Máy UV-Vis là một thiết bị được sử dụng phổ biến trong phòng phân tích. Các máy phổ
hiện thường được nối với máy vi tính, do đó việc ghi phổ hết sức thuận lợi nhờ có những
chương trình đo tự động theo các chế độ khác nhau. Ngoài ra, còn có thể lưu giữ phổ đối
chiếu và so sánh khi cần thiết.
Nhờ sử dụng máy vi tính, bộ tự ghi còn thể ghi ra những số liệu cần thiết như giá trị bước
sóng (λ), độ hấp phụ ( Abs) và ta cũng có thể xác định hệ số hấp thụ mol (ε) nhờ vào định
luật Bouguer – Lamber – Beer:
A = =ε.l.c
Trong đó :
A là độ hấp thụ.
c là nồng độ chất tan(mol/L)
l là bề dày của cell chứa mẫu (cm).
là hệ số hấp thụ mol (Lmol-1cm-1).ε
:εÝ nghĩa của hệ số hấp thụ mol
Hệ số hấp thụ mol đặc trưng cho cường độ hấp thụ của chất nghiên cứu ở bước sóng đã
cho.
Hệ số hấp thụ Mol không phụ thuộc vào nồng độ và bề dày của lớp chất hấp chỉ phụ thuộc
vào bản chất chất hấp thụ và bước sóng của bức xạεthụ . đặc trưng cho cường độ hấp thụ

Muốn kích thích electron cần phải có năng lượng lớn hơn nhiều, vào khoảng hàng chục
đến hàng trăm kcal/mol. Năng lượng đó ứng với các bức xạ thuộc vùng khả kiến hay tử
ngoại.
Nếu phân tử hấp thụ các bức xạ có năng lượng lớn hơn như bức xạ khả kiến hoặc tử ngoại
thì năng lượng electron của chúng bị thay đổi. Nếu chỉ có trạng thái electron thay đổi thì
vạch hấp thụ tương ứng sẽ có tần số:
E/hc.∆Vel =
Sự thay đổi trạng thái electron đồng thời có cả sự thay đổi trạng thái dao động và trạng
quay nên ta không thu được các vạch với tần số vel = vdd + vqy. Phổ thu được trong
trường hợp này được gọi là phổ hấp thụ electron. Hay gọn hơn là phổ electron. Vì phổ
electron thể hiện ở vùng tử ngoại – khả kiến (UV-Vis) nên cũng được gọi là phổ tử ngoại –
khả kiến.
Từ phổ UV-Vis và hệ số hấp thụ mol, ta có thể suy ra tính chất của sản phẩm là:
Khái niệm đậm màu, nhạt màu của dung dịch trong thực tế liên quan tới giá trị của chất
hấp thụ và cả nồng độ của nó.ε
- Hiệu ứng đậm màu của dung dịch được đo bằng độ hấp thụ. Sự chuyển dịch tăng.εcực
đại hấp thụ về bước sóng dài (hiệu ứng Batocrom) thì
.ε- Hiệu ứng nhạt màu là hiệu ứng làm giảm cường độ hấp thụ là giảm
Dựa vào phổ ta biết được bước sóng, độ hấp thụ, hệ số hấp thụ mol từ đó ta có thể so sánh
với mẫu chuấn để xác định sản phẩm có đạt được những yêu cầu hay không (ví dụ như là
về nhóm chức, về độ tinh khiết của sản phẩm…)
Dựa vào độ hấp thụ của mẫu, ta có thể xác định nhóm chức đặc trưng của sản phẩm. Ví dụ
như những hộp chất hấp thụ trong vùng 220-800 nm thường là các hydrocacbon hoặc là
dẫn xuất đơn gián của chúng như(CH3Cl, C2H5Cl…). Hoặc nếu như là hydrocacbon loại
anken, ankin thì nối đôi, nối ba trong phân tử ở vị trí cô lập.
Cái Labomed UVD3500 là máy đo quang 2 chùm tia, độ chính xác thì ổn, nhưng mừ nếu
làm xác định hàm lượng ion kim loại trong nước, hàm lượng amoni thì tốt quá
Nhưng bên dược mà làm cái này thì hơi mệt rùi, vì mỗi lần đọc có 01 mẫu à, nếu làm vài
chục mẫu chắc mất mấy ngày, hic hic
Thứ nữa loại máy này thường là đọc phổ quyét thôi, mà muốn xác định động học protein,