BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
PHÙNG TÔN QUYỀN
NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA KHÁNG RẦY
NÂU VỚI SỰ TRỢ GIÚP CỦA CHỈ THỊ PHÂN TỬ


NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA KHÁNG RẦY
NÂU VỚI SỰ TRỢ GIÚP CỦA CHỈ THỊ PHÂN TỬ

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số : 62.62.01.11

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS. Vũ Đức Quang
TS Lưu Thị Ngọc Huyền Hà nội - 2014

i
L()I CAM DOAN
'I6i

Vu Du'c
Quang, rS. Lu'u I'hi Ngoc Iluyen,
Vien
Di Iruycn Nong nghicp, da tan tinh
hu'o'ng dan
giiip
da va tao dicu
kicn
thuan
Igi dc loi hoan
thanh
cong trinh
nghicn cu'u nay.
loi
xin chan
thanh
cam an tap the lanh dao va can bg Ban dao tao sau
dai
hgc,
Vicn
Khoa
hgc Nong nghicp
Vict
Nam, Ban giam hieu nha
truang
va
Khoa
CNSI
l&M
T, lYuang Dai hgc Phuang Dong, da tao mgi dicu kien

be va nguoi
than.
Ha noi,
ngay
22
thdng
5 nam 2014
Phung Ion Quyen
iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii
DANH MỤC CÁC BẢNG x
DANH MỤC CÁC HÌNH xii
MỞ ĐẦU…………………………………………………………………… 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1
2. Mục tiêu của đề tài : 2
3. Thời gian và địa điểm thực hịên đề tài: 3
4. Tính mới và những đóng góp của đề tài: 3
5. Ý nghĩa của đề tài: 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Rầy nâu và đặc tính kháng rấy nâu ở lúa 4
1.1.1. Đặc tính sinh học của rầy nâu 4
1.1.1.1. Phân bố và ký chủ 5
1.1.1.2. Đặc điểm sinh học của rầy nâu 5
1.1.1.3. Tình hình và mức độ gây hại 9

2.2.2. Phương pháp lai hồi giao, qui tụ gen kháng rầy 63
2.2.3. Phương pháp thu thập thông tin các chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu. 65
2.2.4. Phương pháp chọn tạo dòng lúa kháng rầy nâu bằng chỉ thị phân tử 65
2.2.4.1. Chọn tạo dòng lúa ưu tú từ quần thể phân ly (F
2
trở đi đến F
6
) 65
2.2.4.2. Chọn tạo các dòng lúa ưu việt trên cơ sở hồi giao . 65
2.2.5. Một số kỹ thuật dùng trong phòng thí nghiệm 65
2.2.5.1.Tách chiết ADN và tinh sạch theo phương pháp CTAB 65
2.2.5.2. Kiểm tra ADN bằng điện di trên gel agorose 0.8% 68
2.2.5.3. Kỹ thuật PCR……………………………………………………… 69
2.2.5.4. Kỹ thuật làm gel và điện di kiểm tra sản phẩm Gel Agarose… ….70
2.2.6. Chọn giống truyền thống: 72
2.2.6.1. Cơ sở lý luận: 72
v

2.2.6.2. Phương pháp thí nghiệm đồng ruộng 74
2.3. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 77
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 78
3.1. Nghiên cứu nguồn vật liệu và tập đoàn dòng/giống lúa kháng rầy nâu 78
3.1.1. Nghiên cứu đánh giá nguồn vật liệu bố mẹ cho các tổ hợp lai 78
3.1.2.
Đánh giá phản ứng của một số dòng/giống, năm 2008. 79
3.1.3.
Đánh giá phản ứng của các dòng/giống Long An và Hà Nội,
2011.
80
3.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng rầy nâu 86


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Nghĩa của chữ viết tắt

ANP Anaerobic protein
ADN Deoxyribonucleic Axit
ARN Ribonucleic Axit
Bp Cặp bazơ nitơ
Bph Brown plant hopper
Gen kháng rầy nâu
BVTV Bảo vệ thực vật
Ctv Cộng tác viên
CTPT Chỉ thị phân tử
Chr Nhiễm sắc thể
CS Cộng sự
CTAB Cetyltrimethyl amonium bromide
CTPT Chỉ thị phân tử
CV% Hệ số biến động
DTNN Di truyền nông nghiệp
Đ/C Đối chứng
ĐBSH Đồng bằng sông Hồng
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu long
EDTA Ethylenediaminetetra acetic acid
IRRI Viện nghiên cứu lúa Quốc tế
Kb Kilo base
KD18 Khang dân 18
KL Khối lượng
KL1000 hạt Khối lượng nghìn hạt
KHNN Khoa học nông nghiệp ix

DANH MỤC CÁC BẢNG

TT BẢNG TÊN BẢNG TRANG

1.1. Các gen kháng rầy nâu và giống chỉ thị mang gen kháng………… …17
1.2. Mối liên hệ giữa biotype rầy nâu và gen kháng rầy ở lúa 17
1.3. Sự tương quan giữa số thế hệ BCnF
1
với tỷ lệ kiểu gen của dòng ưu tú
nhận gen kháng được chuyển vào con lai BCnF
1
46

2.1. Danh sách các chỉ thị sử dụng trong chọn giống 60

2.2. Trình tự các mồi liên kết với gen kháng Bph3 và BphZ(t) 60

2.3. Thang điểm đánh giá rầy nâu theo IRRI 62

2.4. Thang điểm đánh giá rầy nâu theo viện BVTV 63

2.5. Thành phần dung dịch EB (Extraction buffer) 66

2.6. Thành phần dung dịch CTAB Buffer và dung dịch TE (10 : 0,1) 66

x

3.7. Một số đặc điểm sinh trưởng của các dòng/giống lúa, vụ xuân năm
2011, 2012, 118

3.8. Mức độ nhiễm sâu bệnh của các dòng/giống lúa, vụ xuân năm 2011,
2012 119

3.9. Độ thuần đồng ruộng và các chỉ tiêu cấu thành năng suất của các
dòng/giống vụ xuân năm 2011, 2012

tại Hà Nội 120

3.10. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng/giống, vụ
xuân năm 2011, 2012 120

3.11. Một số đặc điểm sinh trưởng của các dòng/giống lúa vụ mùa năm
2011, 2012 tại Hà Nội (mật độ 50 khóm/m2)… ………………………….122
3.12. Mức độ nhiễm sâu bệnh của các dòng/giống lúa, vụ mùa năm 2011,
2012 tại Hà Nội (mật độ 50 khóm/m2)………………… ….123
3.13. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng/giống vụ
mùa năm 2011, 2012 126

3.14. Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các dòng/giống vụ
mùa năm 2011, 2012 126

3.15. Đặc điểm sinh trưởng của dòng DTR64, vụ xuân năm 2011 131

3.16. Độ thuần đồng ruộng và các yếu tố cấu thành năng suất của dòng
DTR64, vụ xuân năm 2011 131

1
F
1
. 47

1.4. Sơ đồ Quy trình 49

2.1. Bản đồ phân tử chi tiết gen kháng rầy nâu Bph3 57

2.2. Bản đồ phân tử chi tiết gen kháng rầy nâu BphZ(t) 58

2.3. Cấu tạo hoa lúa 64

3.1 Ảnh thí nghiệm đánh giá phản ứng kháng rầy của một số dòng lúa được
chọn lọc của Viện Di truyền trong nhà lưới, năm 2007 78

3.2. Sơ đồ chọn tạo giống lúa KR8 bằng chỉ thị phân tử 88

3.3. Ảnh thí nghiệm kiểm tra nồng độ và chất lượng ADN 89
3.4. Kiểm tra kết quả sản phẩm PCR trên gel agarose 1% 90
3.5. Kết quả xác định chỉ thị phân tử cho đa hình giữa cây bố mẹ (Chỉ thị
RM588 liên kết gen Bph3)…………………………………………………91
3.6. Kết quả xác định chỉ thị phân tử cho đa hình giữa cây bố mẹ (Chỉ thị
RM190 liên kết gen Bph3)……………………………………………… 91

3.7. Kết quả xác định chỉ thị phân tử cho đa hình giữa cây bố mẹ (Chỉ thị
RM5757 liên kết gen BphZ(t))………………………………………………92

3.8. Kết quả xác định chỉ thị phân tử cho đa hình giữa cây bố mẹ (Chỉ thị RM
3367 liên kết gen BphZ(t))……………………………………………… …92

3
F
3
mang chỉ thị RM588 liên kết gen Bph3
của tổ hợp IR64/IS1.2 .99

3.18. Ảnh sử dụng chỉ thị phân tử SSR (RM5757) liên kết với gen BphZ(t)
xác định con lai BC
1
F
1
mang gen kháng 101

3.19. Kết quả sử dụng chỉ thị RM3367 liên kết BphZ(t) trong chọn lọc các cá
thể mang gen kháng của dòng BC 102

3.20. Kết quả sử dụng chỉ thị RM3735 liên kết BphZ(t) trong chọn lọc các
cá thể mang gen kháng của dòng BC 102

3.21.
Kết quả sử dụng chỉ thị RM190 liên kết Bph3

trong chọn lọc các cá thể
mang gen kháng của dòng 64R8-1 (KR8) của tổ hợp IR64/IS1.2 ………103
3.22. Kết quả sử dụng chỉ thị RM588 liên kết gen Bph3 của tổ hợp IR64/IS,
trong chọn lọc các cá thể dòng 64R8-2 (KR8a) mang gen kháng. 104

3.23. Kết quả sử dụng chỉ thị RM190 liên kết gen Bph3, trong chọn lọc các
cá thể của dòng DTR64 mang gen kháng 104


Nam và cũng là nguồn thức ăn chính của 90 triệu dân số trong nước. Đồng
bằng Sông Hồng và đồng bằng sông Cửu Long có sản lượng gạo lần lượt là
17% và 50%. Diện tích đất dành cho canh tác lúa hầu như không tăng trong
khi dân số thế giới liên tục tăng. Do vậy, vấn đề lương thực được đặt ra như
một mối đe dọa đến sự an ninh và ổn định của thế giới nói chung và nước ta
nói riêng trong tương lai. Theo dự đoán của các chuyên gia về dân số học, nếu
dân số thế giới tiếp tục tăng trong vòng 20 năm tới thì sản lượng lúa gạo phải
tăng 80% mới đáp ứng đủ nhu cầu. Vì thế, năng suất lúa luôn là điều quan
tâm hàng đầu. Để đảm bảo năng suất lúa vượt trần, một trong những chiến
lược quan trọng là ứng dụng công nghệ sinh học vào việc chọn tạo giống mới
đảm bảo nhu cầu lương thực của con người.
Trong thực tế, việc trồng lúa luôn bị đe dọa bởi thiên tai, dịch bệnh như
đạo ôn, bạc lá, rầy nâu… Theo ước tính thì sản lượng lúa hiện nay chỉ bằng
53,6% sản lượng có khả năng đạt được nếu không bị dịch bệnh.
Rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) là một trong số các côn trùng gây hại
trên lúa làm giảm nghiêm trọng sản lượng lúa trồng ở hầu hết các nước trồng
lúa trên thế giới, nhất là các nước nhiệt đới. Từ những năm 70 của thế kỷ XX,
rầy nâu đã nổi lên như một vấn đề thời sự trong nghề trồng lúa ở châu Á (Bộ
NN&PTNT, 2010)[3]. Những thiệt hại do rầy nâu gây ra hàng năm làm giảm
khoảng 10% sản lượng lúa, đôi khi tới 30% hoặc hơn nữa tại vùng dịch, có
khi “cháy rầy” làm mất trắng như ở Bắc Bộ năm 1986-1987, 1992-1993, năm
2000 hơn 2000 ha lúa bị nhiễm rầy.
2 Sự thay đổi độc tính của các quần thể rầy nâu diễn ra thường xuyên để
thích nghi với ký chủ mới, hoặc tạo ra các dạng “biotype mới” do sức ép chọn
lọc từ việc độc canh một giống lúa trồng. Sử dụng giống lúa kháng là biện
pháp ưu việt, một mặt giảm chi phí phòng trừ, hạn chế dùng thuốc hoá học
gây ô nhiễm môi trường, mặt khác góp phần ổn định môi trường sinh thái.

- Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Bảo vệ Thực vật, Trung tâm
CGCN&KN Thanh Trì - Hà Nội
- Tại Tỉnh Nam Định, Thái Bình, Hà Nam, Hà Nội.
4. Tính mới và những đóng góp của đề tài:
- ĐÒ tµi ®· cã nh÷ng ®ãng gãp tÝch cùc trong viÖc nghiên cứu chọn
t¹o giống lúa kháng rầy nâu b»ng chỉ thị phân tử ở Việt Nam.
- Trong đề tài này đã qui tụ được 2 gen kháng rầy nâu vào 1 giống lúa,
có sử dụng chỉ thị phân tử SSR liên kết với gen kháng.
- §Ò tµi ®· phối hợp chọn t¹o giống lúa kháng rầy nâu b»ng chỉ thị
phân tử với chọn giống truyền thống vµ đã chọn tạo được giống lúa thuần
kháng rày nâu KR8 để đưa vào sản xuất.
- §Æc ®iÓm cña gièng lóa KR8: Điểm kháng rầy nâu trong nhà lưới
của giống từ 1-3 với quần thể rầy nâu của ĐBSH và ĐBSCL; thuéc nhãm
gièng có thời gian sinh trưởng ng¾n; năng suất trung bình cao h¬n giống
Khang Dân 18, thích hợp với nhiều vùng sinh thái khác nhau của các tỉnh phía
Bắc nước ta.
5. Ý nghĩa của đề tài:
- Ý nghĩa khoa học: Sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo ra 2 dòng
lúa mang 2 gen kháng rầy nâu.
- Ý nghĩa thực tiễn: Dòng lúa KR8 thu được như kết quả của đề tài là
dòng triển vọng có thể đưa ra sản xuất. 4

những năm 1980, 1990; những giống trồng phổ biến năng suất và chất lượng
thì khả năng kháng rầy nâu lại thấp (Bộ NN&PTNT, 2012) [2].
5 Theo Ikeda R (1985)[75] cho rng ry nõu hin nay cú 4 loại hình sinh
học (BPH): BPH 1 phõn b rng éụng v éụng Nam ; BPH 2 cú ngun
gc Philippines phỏt sinh sau khi s dng rng rói cỏc ging cú gen Bph 1;
BPH 3 phỏt sinh ti cỏc phũng thớ nghim Nht Bn v Philippines; biotype 4
chỉ thy vựng Nam . Theo cụng b mi õy ca Jena KK v cs (2010) [82]
ti IRRI ó phỏt hin ra gen khỏng ry Bph18 có phổ kháng rộng từ quần thể
lỳa hoang Oryza australiensis. Theo nhiu nghiờn cu cho thy, qun th ry
nõu ng bng sụng Cu Long cú th l s pha trn gia hai loi BPH 2 v
BPH 3.
1.1.1.1. Phõn b v ký ch
Ry nõu cú mt trờn khp cỏc nc trng lỳa. Dch ry bựng phỏt mnh
t nm 1977 n nay gõy thit hi trm trng ti Philippines, Thỏi Lan,
Indonesia, n , Mó Lai, i Loan, Trung Quc, Srilanka v Vit Nam.
(Lu Thị ngọc Huyền và cs, 2001,2003) [19]; [20]
Ngoi cõy lỳa, ry nõu cũn tỏc hi trờn cỏc cõy trng khỏc ngụ, lỳa mỡ,
lỳa mch, kờ, c gu, c lng vc (Huyen LTN, 2012) [72].
1.1.1.2. c im sinh hc ca ry nõu
* Thnh trựng
Cú 2 dng cỏnh di v cỏnh ngn.
Dng cỏnh di: con cỏi di 4,5-5,0 mm, bng mu nõu vng, nh u
nhụ ra phớa trc. Cỏnh trong sut, gia cnh sau ca mi cỏnh cú mt m
en, khi hai cỏnh ny xp li hai m chng lờn nhau to thnh mt m en
to trờn lng. Mt kộp mu nõu nht, mt n mu nõu . Gc rõu cú hai t
phỡnh to, con c di 3,6-4,0 mm, mu nõu m bộ hn con cỏi, cui bng
dng loa kốn.

Rầy cái đẻ từ 300-715 trứng trong suốt một chu kỳ sống. Trứng được
đẻ thành từng đám gồm từ 4-10 trứng. Trứng nở sau 21 ngày ở nhiệt độ 20
o
C
và sau 18 ngày ở 30
o
C. Trứng có thể ngủ nghỉ ở nhiệt độ 10-30
o
C. Rầy cái
cánh dài có thể sống lâu hơn rầy đực ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Rầy
trưởng thành thường sống 10-20 ngày ở mùa hè và 30-50 ngày ở mùa thu vì
thế rầy nâu thường phát triển ở vụ khô hơn là vụ mưa.
(b)
(d)
(a)
(c)
7 Rầy có thể phổ biến ở vùng lúa nước tưới tiêu và lúa nước trời trong
suốt chu kỳ sinh trưởng và phát triển của cây lúa. Thường có 3 lứa rầy trong
một vụ lúa ngắn ngày (100-110 ngày). Ở ®ồng bằng sông Cửu Long mỗi năm
có từ 10-12 lứa rầy nâu, cây lúa bị hại nặng vào tháng 1, 2 và tháng 6, 7, 8
dương lịch.
Trong vùng nhiệt đới nóng ẩm, rầy nâu sống quanh năm và biến động
mật số tuỳ vào giống lúa, hệ thiên địch và điều kiện môi trường. Sau khi lúa
gặt xong rầy nâu di chuyển lên cỏ dại nhưng không sống tiềm sinh ở đó. Tuy
nhiên chúng chỉ qua đông ở dạng trứng và rầy non tuổi 5 trong vùng ôn đới
như Nhật Bản. Sau khi lúa mới sạ hay cấy, rầy nâu di chuyển từ cỏ dại sang
ruộng lúa. Như vậy, sự xuất hiện theo mùa xảy ra ở vùng có giai đoạn hưu

Quá trình phát sinh của rầy như sau: đầu vụ dạng cánh dài di cư từ lúa
chét, cỏ dại, mạ bay vào ruộng lúa, đại đa số chúng là dạng cánh dài. Gặp lúa
đẻ nhánh chúng sinh ra rầy non mà đa số sau này hình thành rầy cánh ngắn
(Normile D và cs, 2008) [113]. Sự thay đổi tỷ lệ hai loại hình trong quá trình
phát triển của cây lúa như sau: đầu vụ 90-100% cánh dài, bắt đầu đẻ rộ 15-
20% cánh ngắn, ngậm sữa 70-80% cánh ngắn và tới khi lúa chín tỷ lệ rầy
cánh ngắn chỉ còn 20-25% (Goh HG và cs,1993a); Saxena RC và cs, 1991;
Zhang H và cs, 2008) [60], [127], [163].
Thời gian phát dục các giai đoạn của rầy nâu biến động phụ thuộc vào
các yếu tố ngoại cảnh. Rầy nâu có vòng đời ngắn trung bình từ 20-30 ngày.
Trong vụ xuân vòng đời là 25-30 ngày, trong vụ mùa vòng đời là 20-25 ngày.
Rầy trưởng thành có thể sống từ 20-50 ngày. Trung bình thời gian phát dục
các giai đoạn của rầy nâu biến động như sau: trứng 6-8 ngày, rầy non từ 12-14
ngày (mỗi tuổi 2-3 ngày) (Lê Thị Ánh Hồng, 2002; Lê Duy Thành, 2000; Mei
HW và cs, 2003) [17], [41], [103].
Rầy nâu phát sinh, gây hại đầu tiên thành từng vạt giữa ruộng, sau đó
lan dần ra quanh ruộng. Những ruộng trũng, đất tốt rầy thường phát sinh
mạnh. Khi mật độ rầy cao, trong ruộng thường xuất hiện “váng rầy” là váng
mỏng lan toả trong ruộng. Do rầy tiết ra chất đường mật nên nấm muội đen
phát triển và bám vào thân lúa (Lưu Minh Cúc và cs, 2010; Lê Thị Muội và
cs, 2004; LiRB và cs, 2006) [8], [32], [96]. Qui luật phát sinh và mức độ gây
9 hại liên quan đến nhiều yếu tố sinh cảnh. Thường khi nhiệt độ không khí cao,
ẩm độ cao, lượng mưa nhiều trong một thời gian, sau đó trời hửng nắng thì
rầy nâu dễ phát sinh thành dịch. Thông thường nhiệt độ từ 20-30
o
C và ẩm độ
từ 80-85% là điều kiện thích hợp cho rầy nâu sinh sống và phát triển (

bùng phát trên diện tích 150 nghìn hecta lúa; vụ đông xuân 2005-2006 hơn
200 nghìn hecta lúa bị nhiễm rầy; vụ hè thu 2006 gần 100 nghìn hecta; vụ thu
đông 2006: gần 150 nghìn hecta (Bộ NN và PTNT, 2010) [3].

* Mức độ gây hại
- Cháy rầy (hopper burn)
Rầy trưởng thành và rầy non dùng miệng chích vào thân cây lúa để
hút dịch cây. Vị trí gây hại và đẻ trứng của rầy nâu còn là cửa ngỏ cho nấm và
vi khuẩn xâm nhập. Rầy nâu tiết mật từ việc chích hút nhựa cây còn làm nấm
mốc dễ phát triển.
Bị hại nhẹ các lá dưới có thể bị héo. Bị hại nặng chúng gây nên hiện
tượng "cháy rầy", cháy rầy xảy ra khi có mật độ rầy cao, rầy hút nhựa làm cây
lúa bị héo vàng rồi chết, năng suất có thể giảm 50% thậm chí có thể bị mất
trắng. Thông thường khi bị hại nặng chúng tạo nên các vết hại màu nâu đậm.
Nếu bị rầy hại nặng thì phần dưới thân cây lúa có màu nâu đen, do tổ chức
dẫn nhựa cây bị rầy phá hoại nghiêm trọng làm cho cây lúa bị khô héo và
chết. Lúa ở thời kỳ làm đòng và trổ nếu bị rầy hại nặng thì tác hại càng
nghiêm trọng hơn. Rầy có thể hút nhựa ở cuống đòng non, đồng thời rầy cái
chích rách mô thân cây để đẻ trứng. Các vết thương cơ giới đó tạo điều kiện
cho nấm bệnh xâm nhập tạo điều kiện làm cho cây lúa bị thối nhũn, đỗ rạp,
gây nên hiện tượng bông lúa bị lép một nữa hoặc toàn bộ. Hiện tượng cháy
rầy đầu tiên mang tính cục bộ một vài m
2
, nhưng nếu gặp điều kiện thuận lợi
vết cháy rầy lan toả rất nhanh tới một vài ha hoặc cả cánh đồng trong vòng
một đến hai tuần.
- Truyền bệnh virus
Rầy nâu có thể lấy được cả hai loại virus gây bệnh Vàng lùn và bệnh
Lùn xoắn lá vào cơ thể và có thể truyền được đồng thời cả 2 triệu chứng của
bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá.