

 !
…………………
"#$%
&'()*#&+#
,Amorphophallus sp)%-
./ 0.1#2
)3(04#56
,0#&0$7
04&1#8
,07
9( !
(&:#
) (;0;
;<=;
>
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và
kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là hoàn toàn trung thực và chưa
được công bố trong bất kì công trình nào khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2012
Tác giả
Lê Thị Thanh Huệ
2
.?
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn TS.
Nguyễn Văn Dư, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, TS. Lê Xuân Đắc,
Viện Công nghệ sinh học đã luôn tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong
suốt quá trình thực hiện đề tài.
Đồng thời, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công nghệ
Nông - Lâm - Thực phẩm trường Đại học Thành Tây đã dạy dỗ, truyền đạt

ABC=
D*#
=4=4EFGHCIJ
Nưa là một loại cây thường được trồng ở các quốc gia Đông Á như là một
cây lương thực và thực phẩm. Ở nước ta, Nưa mọc hoang rải rác ở khắp các
vùng rừng núi, được người dân nhiều địa phương đem về trồng cũng đã lâu
đời ở trong vườn, quanh bờ ao, dọc hàng rào và trên các đồi để làm thức ăn
cho người và gia súc, gặp nhiều ở các tỉnh Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hoà
Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế Củ Nưa có nhiều
tinh bột mịn ăn ngon hơn sắn nên trước đây nhân dân ta trồng nhiều để lấy
củ làm lương thực ăn thay cơm, bẹ lá nấu canh hay muối để dành làm thức
ăn như dưa trong những tháng thiếu rau xanh cho người hoặc chế biến thức
ăn cho gia súc. Trong củ Nưa có chứa glucomannan, đây là một
polysaccharide hòa tan trong nước. Nó có khả năng làm giảm lượng đường
và cholesterol trong máu, giảm cân, thúc đẩy hoạt động đường ruột và tăng
cường chức năng miễn dịch. Glucomannan cũng được sử dụng trong công
nghiệp thực phẩm và dược phẩm.
Cây Nưa không chỉ có giá trị về mặt thực phẩm mà còn có ý nghĩa trong
việc chống xói mòn đất. Thực trạng hiện nay, diện tích rừng nước ta đang
ngày càng bị thu hẹp, việc khai thác tài nguyên rừng bừa bãi, sự đa dạng
sinh học bị phá vỡ, nhiều nguồn gen thực vật có nguy cơ tuyệt chủng. Cùng
với thực tế là ngày nay đời sống con người ngày càng nâng cao, nhiều người
không còn nghĩ đến một loài cây dân dã nhưng lại có nhiều giá trị to lớn như
cây Nưa. Hơn nữa hiện nay những nghiên cứu về cây Nưa chưa nhiều, chính
vì vậy việc quan tâm đến cây Nưa là một việc làm cần thiết để có thể nhân
giống và bảo tồn giống cây Nưa.
Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những kỹ
thuật rất quan trọng của công nghệ sinh học thực vật. Những thành tựu mà
6
nuôi cấy mô và tế bào thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng

thôn cũng có trồng để lấy củ ăn. Cây Nưa có giá trị thực phẩm rất to lớn.
Cuống lá Nưa có thể dùng để nấu canh hoặc muối dưa ăn. Củ, dọc và lá, bã
bột khoai Nưa là nguồn thức ăn rất tốt để chăn nuôi gia súc, đặc biệt chăn
nuôi lợn. Củ Nưa là phần có giá trị to lớn nhất. Củ Nưa có thể luộc ăn hoặc
gọt vỏ thổi độn với cơm, ăn mát, chắc dạ, không nóng ruột như khoai lang.
Củ khoai Nưa còn dùng để nấu chè. Tuy nhiên, Nưa chủ yếu được trồng để
lấy bột. Bột Nưa trắng mịn như bột sắn nhưng có hàm lượng tinh bột cao
hơn. Trong 100g củ khô có tinh bột là 75,16g; protein 12,5g; lipid 0,98; dẫn
xuất không protein 3,27; cellulose 3,67; tro 4,42. Tỷ lệ tinh bột nhiều gấp
đôi khoai sọ. Bột Nưa từ lâu đã được người Nam Bộ coi như một thứ thực
phẩm giải nhiệt hữu hiệu giống như bột sắn. Dân gian còn có thể dùng bột
Nưa để làm các loại bánh, làm miến và sử dụng trong công nghiệp để hồ vải.
8
Từ xưa người dân miệt duyên hải Tây Nam Bộ xem bột Nưa như một loại
thuốc dân gian. Củ Nưa có thể dùng như một dược liệu để chữa bệnh sốt rét
có báng, đờm trệ, ăn không tiêu, đầy bụng. (Đỗ Tất Lợi, 2005)
Trong củ Nưa có chứa glucomannan - một polysaccharide hòa tan trong
nước. Glucomannan là một chất phụ gia thực phẩm được sử dụng như một
chất chuyển đổi sữa hay chất làm đặc. Trong lịch sử, glucomannan đã được
sử dụng trong thực phẩm truyền thống châu Á như mì, đậu phụ, và các sản
phẩm khác. Ngoài ý nghĩa trong thực phẩm, glucomannan còn đóng vai trò
quan trọng trong một số loại dược phẩm (Tamura và CS, 2005).
Glucomannan là một chất xơ hòa tan, chính vì vậy nó được sử dụng để điều
trị táo bón. Glucomannan có thể làm giảm táo bón bằng cách giảm thời gian
vận chuyển phân (Marzio, 1989). Trong điều trị táo bón mãn tính,
glucomannan cải thiện đáng kể các triệu chứng táo bón (Passaretti, 1991).
Glucomannan cũng có tác dụng giảm colesterol, lipoprotein và chất béo
trung tính, do đó nó cũng được bổ sung vào thành phần của các loại thuốc
chữa béo phì (Walsh, 1984), (Gallaher, 2002). Chất này cũng được chứng
minh là có tác dụng hỗ trợ tích cực trong hỗ trợ điều trị bệnh nhân tiểu

Từ trước đến nay, việc nhân giống cây Nưa chưa được chú trọng, chủ yếu
người dân tự để giống hoặc vào rừng khai khác theo hình thức tự cung tự
cấp. Ở Việt Nam, những nghiên cứu về cây Nưa còn rất hạn chế. Gần đây,
nhóm nghiên cứu về Thực vật dân tộc học thuộc Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật và Trại Thực nghiệm sinh học thuộc Viện Công nghệ sinh
học đã và đang tiến hành thu thập các giống Nưa với mục đích bảo tồn, tiếp
theo là chọn lọc đánh giá các giống Nưa có hàm lượng glucomannan cao,
chất lượng tinh bột tốt để nhân nhanh và sản xuất cây Nưa phục vụ công
nghiệp chế biến thực phẩm và dược phẩm4Ngày 10/3/2011, Sở Khoa học và
Công nghệ Thừa Thiên Huế đã tổ chức hội nghị tuyển chọn đề tài “Nghiên cứu
hàm lượng, chất lượng, tác dụng và xây dựng quy trình sản xuất glucomannan
10
trong củ Nưa-Amorphophallus (họ Ráy-Araceae) trồng tại tỉnh Thừa Thiên
Huế”.( />GiaoDien=11&ChucNang=341&NewsID=20110324153307). Sáng ngày
08/02/2012, tại Hội trường Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ
Việt Nam, NCS. Nguyễn Tiến An, chuyên ngành Hóa Hữu cơ đã bảo vệ
thành công Luận án Tiến sĩ về đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học, quy
trình tách chiết, biến tính hóa học và khả năng ứng dụng của glucomannan
từ củ một số loài nưa (Amorphophallus. sp – Araceae) ở Việt Nam”.
( />;4n4NoPMHUZoFp\_WFAqMGrF
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật quan
trọng của công nghệ sinh học, là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các
công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Trải qua hơn
100 năm phát triển và đã đạt được những thành tựu nhất định trong lĩnh vực
nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng (Nguyễn Đức Thành, 2000).
;4n4=4oPFVKsCOCNoPMHUZotFp\_WFAqMGrF
A_CA`ABCAuTAvM(
Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm
một số thành phần cơ bản sau:
- Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. Vì vậy, đối với từng
môi trường nhất định và từng trường hợp cụ thể của các loài cây phải chỉnh
độ pH của môi trường về mức ổn định ban đầu. Nuôi cấy callus của nhiều
loài cây, pH ban đầu thường là 5,5 - 6,0 sau 4 tuần nuôi cấy pH đạt được giá
trị từ 6,0 - 6,5. Đặc biệt khi sử dụng các loại phụ gia có tính kiềm hoặc tính
acid cao như amino acid, vitamin thì nhất định phải dùng NaOH hoặc HCl
loãng để chỉnh pH môi trường về từ 5,5 - 6,5.
12
Những thí nghiệm nuôi cấy tế bào đơn hay tế bào trần thì việc chỉnh độ pH
là bắt buộc.
Độ pH môi trường thường được điều chỉnh từ 5,8 - 6,0 trước khi khử trùng.
Nhìn chung nếu độ PH cao hơn 6 s‘ làm môi trường bị cứng và nếu thấp hơn
5 thì agar khó đông.
kMFkMCASCi_ZVxCZoPFVKsCO
Các tác nhân làm rắn hoặc tạo gel được sử dụng phổ biến để chuẩn bị các
môi trường nuôi cấy mô dạng rắn (solid) hoặc dạng sệt (semi-solid). Trong
nuôi cấy dịch lỏng mô hoặc tế bào bị ngập trong môi trường và chết do thiếu
oxy. Các gel tạo một giá đỡ cho mô sinh trưởng trong điều kiện tĩnh (static
conditions).
Agar là một loại polysaccharide thu được từ một số loài tảo (ngành tảo đỏ-
Rhodophyta), chúng có ưu điểm hơn các tác nhân tạo gel khác. Trước tiên,
gel của agar không phản ứng với các thành phần của môi trường. Thứ hai,
chúng không bị thủy phân bởi các enzyme thực vật và duy trì sự ổn định ở
tất cả các nhiệt độ nuôi cấy được tiến hành. Bình thường, từ 0,5 - 1% agar
được dùng trong môi trường để tạo gel rắn chắc ở pH đặc trưng cho môi
trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Trong những nghiên cứu về dinh
dưỡng, việc sử dụng agar được tránh bởi vì agar thương phẩm không sạch
do có chứa một số ion Ca, Mg, K, Na và một số nguyên tố khác ở dạng vết.
Tuy nhiên, các chất bẩn nói trên cũng có thể được loại bỏ bằng cách rửa agar
với nước cất hai lần ít nhất là 24 giờ, tráng trong cồn và làm khô ở 60

được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Môi trường
MS thích hợp cho cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm (Murashige, 1962).
Tới nay, có rất nhiều công thức cải tiến môi trường MS trên cơ sở công thức
gốc do Murashige và Skoog công bố năm 1962. Môi trường B5 được thiết
kế đầu tiên cho nuôi cấy callus hoặc nuôi cấy dịch huyền phù tế bào, sau đó
được cải tiến và trở thành môi trường thích hợp cho nuôi cấy protoplast. Môi
trường này cũng được sử dụng để tái sinh cây từ protoplast. Môi trường Chu
(N6) là loại môi trường rất hiệu quả trong nuôi cấy bao phấn của lúa, được
phát triển đặc biệt cho nuôi cấy bao phấn các loài hòa thảo, mặc dù trong các
thí nghiệm nuôi cấy bao phấn môi trường được phát minh bởi Nitsch (1969)
vẫn được dùng phổ biến hơn. Môi trường Nitsch ngày càng thích hợp và phổ
biến trong nuôi cấy cây đậu tương, cỏ ba lá đỏ (red clover) và các loài
legume khác. Thành phần dinh dưỡng của môi trường này đã giúp tăng sinh
trưởng của tế bào trong quá trinh phát sinh phôi và nuôi cấy protoplast.
14
Thành phần hoá học của môi trường đóng vai trò quyết định đối với thành
công của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi loài cây, thậm chí mỗi kiểu
gen, các kiểu nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy mô sẹo, huyền phù tế bào, tế bào
trần, bao phấn, hạt phấn…) có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi
trường. Khi bắt đầu nuôi cấy mô một loài mới hoặc một giống mới, cần phải
lựa chọn cho đối tượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp.
Cho đến nay, các nhà khoa học đã tạo ra một số lượng rất lớn các môi
trường thích hợp với từng đối tượng và mục tiêu nghiên cứu.
;4n4;4+CO|aCOMlTCNoPMHUZoFp\_WFAqMGrF
Hiện nay, từ những thành tựu của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô tế
bào có thể ứng dụng rất nhiều vào lĩnh vực trồng trọt, như:
- Nhân nhanh vô tính các giống cây quý: từ một mẫu nuôi cấy người ta có
thể tạo ra hàng triệu cây con như nhau nếu đủ thời gian cấy chuyển. Tuy
nhiên, hệ số cấy chuyển phụ thuộc tuỳ giống, càng cấy chuyển nhiều lần
càng tạo nhiều biến dị. Ví dụ, các nhà khoa học đã kết luận từ một chồi dứa

(Geoge, 1993).
EMFeCAMlTNcPC
Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên
trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt ch‘ với các thành
phần khác của môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô
sẹo, huyền phù tế bào và sự điều hòa sự phát sinh hình thái đặc biệt là khi nó
được sử dụng với cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi
trường nuôi cấy phụ thuộc vào: kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên
cứu, hàm lượng auxin nội sinh của mẫu nuôi cấy, sự tác động qua lại giữa
auxin ngoại sinh và auxin nội sinh.
Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Cùng với
cytokinin các nhóm auxin kích thích sự phân chia tế bào. Các hormone của
16
nhóm này có hoạt tính như: tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng
(sáng, đất), tính ưu thế ngọn, kích thích ra rễ và phân hóa mạch dẫn. Tác
động của các auxin thường liên quan đến độ dài của thân, đốt, chồi chính,
rễ… Đối với nuối cấy mô và tế bào thực vật, auxin được sử dụng để kích
thích phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những auxin thường dùng là: IBA
(Indoly Butyric Acid), IAA (Indoly Acetic Acid), NAA (α - Naptalen Acetic
Acid), 2,4 - D (Dichlorphenoxy Acetic Acid) (Đỗ Năng Vịnh, 2005)
EMFeCAMlTMUFW~PCPC
Cytokinin là dẫn xuất của adenine, hormone liên quan chủ yếu đến sự phân
chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô và
tế bào thực vật. Các cytokinin thường xuyên được sử dụng nhất là BAP (6 -
Benzyl Amino Purin), kinetin (N - (2 - furfurylamin) - 1 - H - 6 - amin),
zeatin (6 - (4 - hydroxyl - 3 metyl - trans - 2 butanylamin) purin). Hàm
lượng sử dụng các loại cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình
thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy.
Ngoài 2 nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy mô và tế bào thực
vật người ta còn sử dụng thêm gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào,

nhiều giống lan như: Thanh đạm một hoa, Thủy tiên hường, Ngọc vạn sáp,
Mỹ dung dạ lan… ( />cay-quy/79/3777758.epi)
Cây Ba kích là một cây dược liệu quý, có tác dụng bổ thận âm, bổ thận
dương, tăng cường gân cốt, khử phong thấp (Ning-Zhen Huang, 2007). Dịch
chiết cồn từ củ cây Ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh đối
với các tuyến cơ năng, bổ trí não, giúp ăn và ngủ ngon (Wei, 2006). Ngày
nay nhu cầu sử dụng loài cây này làm dược liệu đang gia tăng nên nó bị khai
thác kiệt quệ. Năm 2010, các tác giả Võ Châu Tuấn, Huỳnh Minh Tư đã
nghiên cứu và nhân giống thành công giống cây quý này bằng phương pháp
nuôi cấy mô và tế bào thực vật (Võ Châu Tuấn và Huỳnh Minh Tư, 2010).
ApOPLP
18
Các nhà khoa học Ấn Độ đã xây dựng thành công quy trình tái sinh một số
giống tre quý như Dendrocalamus asper (tre mạnh tông), Bambusa
multiplex (cây Hóp) thông qua nuôi cấy hạt hoặc chồi bên (Nandi, 2002)
Các tác giả Balaraju và cộng sự (2008) đã nhân giống và tái sinh in vitro
thành công cây thuốc Vitex agnus-castus (Verbenaceae) bằng kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào thực vật từ mô phân sinh đỉnh trên môi trường 1/2 MS có bổ
sung 0,1 mg/l IBA. Cây thuốc Vitex agnus-castus cũng đang bị đe dọa
nghiêm trọng (Balaraju, 2008)
Năm 2008, các tác giả Nishritha, Sanjay cũng đã nhân giống in vitro thành
công loài Asparagus racemosus Willd, đem lại nhiều giá trị kinh tế lớn.
Cùng năm đó, Mukherjee và RoyChowdhury cũng đã nhân giống in vitro
loài Aloe Vera sp. (Mukherjee, 2008), (Nishritha, 2008)
Bên cạnh đó, tác giả Park và cộng sự (2009) cũng đã tái sinh thành công loài
Rehmannia glutinosan L.Journal quý hiếm, đang bị khai thác quá mức (Park,
2009)
Ngoài ra cũng còn nhiều loài cây quý khác cũng đã được nhân giống và bảo
tồn nguồn gen trong ống nghiệm như: Lawsonia inermis Linn (Lythraceae),
Sausurea lappa C.B.Clarke… (Arora, 1989), (Rout, 2001)

- Làm tăng số lượng mẫu thu thập được (Havens, 1999)
Bảo tồn ex situ được áp dụng cho các loại cây trồng chủ yếu, các loài cây đó
biết rõ giá trị của chúng hoặc khi các quần thể tự nhiên không được bảo vệ
an toàn do tác động của sâu bệnh, lửa rừng và sự phá hoại rừng của súc vật
hoặc con người hoặc do bị tạp giao với các quần thể ngoại lai khác.
Khó khăn lớn nhất của bảo tồn ex situ là chi phí cao vì diện tích của quần thụ
bảo tồn được đề xuất là 10ha cho mỗi loài hoặc xuất xứ và được lượng biến
20
dị đủ lớn, nghĩa là thu hạt càng nhiều kiểu gen càng tốt (Nguyễn Hoàng
Nghĩa, 1997).
21
ABCn
# ?  &+#
n4=4XPFKzCOG_GrFiPYNCOAPQCMRN
XPFKzCOCOAPQCMRN(
Cây Nưa
rFiPYNCOAPQCMRN(
Nguyên liệu thực vật:
Hạt chín cây Nưa do Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cung cấp.
- Dụng cụ: Dụng cụ nghiên cứu là các trang thiết bị như: box cấy vô trùng,
panh, kéo, dao cắt, đèn UV, cân kỹ thuật, cân phân tích, tủ sấy, hệ thống
giàn đèn, nồi hấp tiệt trùng, máy đo pH (của các hãng chuyên dụng như:
Sanyo, Metler Toledo, Satorius )
- Hóa chất: Môi trường MS sử dụng trong nghiên cứu gồm các muối đa
lượng và vi lượng, các chất hữu cơ và vitamin theo Murashige và Skoog
(1962), đường saccharose, agar, các chất kích thích sinh trưởng như BAP,
IAA, IBA (của các hãng chuyên dụng như: Sigma, Merck, Invitrogen )
Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25 - 27
o
C và chế độ chiếu sáng 12h/12h

4. Rửa bằng nước cất khử trùng 3 lần;
5. Khử trùng trong dung dịch javen 70%, lắc trong 10 phút;
6. Rửa 4 lần bằng nước cất vô trùng;
7. Thấm khô bằng giấy thấm đã khử trùng;
23
AKyCO`Ak`GoFV„CO\…CO|NCO|hMAOi
;
1. Rửa mẫu bằng nước xà phòng loãng;
2. Rửa 2 lần bằng nước cất dưới vô trùng;
3. Rửa trong cồn 70
0
C (trong 1 phút );
4. Rửa bằng nước cất khử trùng 3 lần;
5. Khử trùng trong dung dịch HgCl
2
0,1%, lắc trong 10 phút;
6. Rửa 4 lần bằng nước cất vô trùng;
7. Thấm khô bằng giấy thấm đã khử trùng;
- Thu mẫu: Mẫu sau khi khử trùng được cấy vào môi trường MS. Sau
khoảng 30 ngày chồi non phát sinh in vitro, các chồi non này được sử dụng
làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo.
n4€4;4jWITMA^Pin vitro
Môi trường sử dụng trong các thí nghiệm là môi trường MS + 30mg/l đường
saccharose + 8g/l agar và bổ sung các chất kích thích sinh trưởng (KTST)
với nồng độ khác nhau tùy theo mục đích của từng thí nghiệm với pH = 5,8.
Các chồi Nưa có kích thước 0,3 - 0,5 cm được cấy thẳng đứng trên môi
trường thạch.
Chỉ tiêu quan sát: số chồi phát sinh/mẫu.
Công thức thích hợp s‘ được chọn để áp dụng cho các lần tạo đa chồi tiếp
theo.

nồng độ nào thì mẫu cấy s‘ phát sinh nhiều chồi nhất, hiệu quả nhất.
Thí nghiệm 3(Ảnh hưởng của nồng độ BAP và IAA đến khả năng tạo chồi
Mục đích thí nghiệm: khảo sát sự tác động đồng thời của BAP và IAA đến
khả năng tạo chồi
CT môi trường
Chất KTST
BAP (mg/l) IAA (mg/l)
ĐC 0 0
AMIA1 2 0,1
25