1
ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh vi nấm sâu (La Sporotrichose) là một bệnh nhiễm nấm bán cấp
hay mãn tính ở da, do vi nấm Sporothrix Schenckii gây ra xâm nhập chủ yếu
qua đường da lan theo đường mạch bạch huyết nông dưới dạng cục nhỏ, sau
đó vỡ thành các vết loét ít đau.
Sporothrix Schenckii là nấm nhị độ lưỡng hình (dimorphique) sống
hoại sinh ở đất, lá cây, thực vật sống hoặc chết, gai, chất bài tiết của súc vật
… xâm nhập cơ thể qua vết trầy xướt da, vết thương do gai đâm. Vì vậy dể
gây bệnh cho người làm vườn, làm ruộng, trồng hoa, thợ hầm mỏ… bệnh còn
được gọi là bệnh gardener’s .Triệu chứng lâm sàng có thể gặp 4 thể: Thể da –
bạch huyết (Formes Cutanées – lymphangitique Sporochose), Thể đơn thuần
khu trú ở da (Formes cutanées), Thể bệnh lan tỏa (Formes généralisées),Thể
phổi nguyên phát (Formes pulmonaire primitive), Ở Việt Nam bệnh gặp rải
rác và rất hiếm ở các tỉnh miền Bắc, ở miền nam chỉ gặp ở Đà Lạt có một số
vùng nội dịch, bệnh nhân hầu hết là nông dân làm vườn rẫy, trồng rau quả và
hoa, buôn bán hoa [2][5][7] Hàng năm phòng khám TT.PCBXH tỉnh Lâm
đồng tiếp nhận và điều trị khoảng40-50bệnh nhân mỗi năm, phần lớn bệnh
nhân cư trú ở phường 7, 8, 9, 12 Thành phố Đà Lạt, thị trấn Lạc Dương và Xã
Lát Huyện Lạc Dương, qua kết quả nghiên cứu của TTPC. Bệnh Xã Hội tỉnh
Lâm đồng năm 2006 [6].
Mặt khác thường bệnh nhân khi mắc bệnh thường tự mua thuốc chữa trị,
hoặc đến các phòng khám không chuyên, điều trị không đúng phác đồ bệnh
vẫn không thuyên giảm, một số trường hợp còn nhầm với lao da, ung thư
da…. Phần lớn bệnh nhân và cộng đồng thiếu kiến thức về bệnh lý này không
biết cách phòng tránh và xử lý vết thương. Bệnh đã ảnh hưởng đến sức khỏe
3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Tình hình bệnh Sporotrichose trên thế giới và Việt Nam
Sporothrix Schenckii là nấm lưỡng dạng (dimorphique) sống hoại sinh
ở đất, lá cây, thực vật sống hoặc chết (thực vật mục nát, vỏ cây có gai, gai
thực vất, chất bài tiết của súc vật … xâm nhập cơ thể qua vết trầy xước da, vết
thương do gai đâm, … Vì vậy dể gây bệnh cho người làm vườn, làm ruộng,
trồng hoa, thợ hầm mỏ… bệnh còn được gọi là bệnh gardener’s (bệnh người
làm vườn) được Schenk mô tả lần đầu tiên ở Mỹ năm 1898, sau đó Beumann
và Ramoud (1903) phát hiện ở Châu Âu. Năm 1912 Beumann và Gougerot
mô tả chi tiết hình dạng của nấm. Theo Findley, Sporothrix Schenkii phát
triển tốt nhất ở nhiệt độ 25 – 27 độ C, do đó bệnh thường gặp ở vùng cao
nguyên, ôn đới hay nhiệt đới, nhiều nhất là ở Châu Mỹ La Tinh (Amérique
Latine) như: Mexique, Costarica, Venezuela, Bresil, Guatemala, ở Nam Phi
(grotte du Tranvaal) và cũng tìm thấy ở Nhật Bản (Japon). Bệnh hiếm gặp ở
Châu Âu, mặc dù người ta đã chẩn đoán nhiều trường hợp ở Pháp vào khoảng
năm 1905-1920 [20],[21],[23][43].
Ở Việt Nam gặp rải rác ở một số tỉnh miền Bắc, theo thống kê bệnh
lý tại Bệnh viện Da liễu Trung ương thì hàng năm chỉ có khoảng từ 3-5 cas.
Ở miền nam chỉ gặp nhiều tại Đà Lạt có một số vùng nội dịch với suất độ
mắc bệnh cao, bệnh nhân hầu hết là nông dân làm vườn rẫy, trồng rau quả
và hoa, buôn bán hoa. Theo kết quả điều tra trước đây của GS.TS Trần
Xuân Mai Trường Đại Học Y – Dược Thành Phố Hồ Chí Minh năm 1984
đã tìm thấy sự hiện diện của Sporothrix Schenckii trong đất và rau ở khu
vực phường 3,4 cũ (tức là phường 7,8 hiện tại) [5],[8], kết quả điều tra của
Thể này rất hiếm, gặp ở người có sức đề kháng tốt. Sang thương
thường dưới dạng bướu gai và mụn cóc, không lan theo mạch bạch huyết.
1.2.3 Thể bệnh lan tỏa ( Formes généralisées )
Thể này rất hiếm, dạng này tiếp theo dạng da – mạch bạch huyết hay
thể nguyên phát ở phổi, triệu chứng giống như một sự nhiễm nấm huyết gặp ở
những người có tình trạng sức khỏe xấu, suy giảm miễn dịch, nghiện rượu,
bệnh lý về máu, ung thư, AIDS … Trên bề mặt da của cơ thể có rất nhiều cục
u nhỏ, cứng, ít khi loét (rạch có thể thấy một mũ đặc, vết rạch loét và lâu
lành) vi nấm xâm nhập vào máu và lan tỏa khắp cơ thể : bề mặt các khớp
xương, tủy xương, hệ thống thần kinh trung ương, phổi thận, và cơ quan sinh
dục – dịch hoàn, vú.
1.2.4 Thể phổi nguyên phát (Formes pulmonaire primitive)
Xẩy ra ở những người sống trong vùng dịch tể, do hít bào tử vi nấm
vào phổi. Thể bệnh này khó chẩn đoán nên dể bỏ qua. Biểu hiện bệnh về lâm
sàng và X-Quang khá giống bệnh lao, bệnh nhân có thể ho ra máu giống lao
phổi, dần tạo thành hang ở phổi, triệu chứng toàn thân mệt mỏi sốt nhẹ.
* Tiêu chuẩn chẩn đoán Sporotrichose:
Triệu chứng lâm sàng đặc trưng.
Xét nghiệm nuôi cấy (+) tính (nuôi cấy-phân lập,PCR…)
Giải phẩu bệnh (hình ảnh đặc trưng)
*Tiêu chuẩn lành bệnh:các thương tổn lành và hóa sẹo hoàn toàn
* Thuốc điều trị: [1],[2],[6],[7],[9],[12],[24] 6
Thuốc cổ điển KI: 1-5g/ngày dùng liều tăng dần, uống với nước hoa
quả hoặc sữa
Kháng sinh diệt nấm:
- Ketoconazole 200mg/ngày x vài tháng
Sau 3 – 5 ngày ở nhiệt độ phòng, vi nấm mọc thành khúm nhỏ, phẳng,
màu kem bề mặt khô và có tính chất dai. Để thêm một tuần khúm nấm sẽ trở
nên nhăn nheo và có màu đen. Quan sát một mảnh khúm nấm dưới kính hiển
vi, thấy những sợi tơ nấm mảnh mai, thanh tú, có bào đài ngắn, trên đầu có 8
các bào tử đính kích thước (2 – 4um) x (2 – 6um); ngoài ra còn có những bào
tử đính mọc trực tiếp từ những sợi tơ nấm.
- Hình ảnh nấm S .schenkii trên môi trường thạch BHI có Chloramphenicol Sau 2 – 4 ngày ở 28
0
C vi nấm mọc thành khúm nhỏ, bề mặt khô trắng
và mịn như bông gòn. Quan sát dưới kính hiển vi , ta thấy những tế bào hạt
men kích thước (1 – 3) x (4 – 10um), đôi khi tế bào có hình tròn hay hình 9
trứng. Chúng sinh sản bằng cách nảy búp có hình dáng như điếu cigar, nên
còn được gọi là thể cigar.
Kết quả chạy giá đường API20 CAUX
12
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu:
2.1.1. Bệnh nhân nghiên cứu:
Tất cả BN Sporotrichose nội trú và ngoại trú tại Bệnh viện Da liễu
Trung Ương và phòng Khám Da liễu TT.PCBXH Lâm đồng từ tháng 01 năm
2010 đến tháng 6 năm 2011
* Tiêu chuẩn chẩn đoán:
- Triệu chứng lâm sàng đặc trưng của Sporotrichose:
Thể da – bạch huyết: thể thường gặp nhất, bệnh bắt đầu từ 1 chi thường
là tay phải dưới dạng cục sẩn gồ trên mặt da không đau, mọc trên đường bạch
huyết, lúc đầu cứng di động sau đó trở nên dính, màu đỏ rồi tím đen, sau đó
loét có mũ sệt vàng, mạch bạch huyết bị sưng như một sợi dây nhỏ dưới da có
thể sờ thấy, đôi lúc như chuổi hạt trai,BN không đau không sốt.
Thể đơn thuần khu trú ở da: rất hiếm gặp, ở người có sức đề kháng tốt.
Thương tổn dưới dạng bướu gai và mụn cóc, không lan theo mạch bạch huyết.
Thể bệnh lan tỏa : rất hiếm, triệu chứng như nhiễm nấm huyết gặp ở
những người có tình trạng sức khỏe xấu, nghiện rượu, bệnh lý về máu, ung
thư, AIDS… nấm xâm nhập vào máu và lan tỏa khắp cơ thể : bề mặt các khớp
xương, tủy, thần kinh trung ương, phổi thận, sinh dục – dịch hoàn, vú.
Thể phổi nguyên phát :Xẩy ra ở những người sống trong vùng dịch tể,
do hít bào tử vi nấm vào phổi. Thể bệnh này khó chẩn đoán nên dể bỏ qua.
14
2.2.2 Cỡ mẫu:
Mẫu tất cả bệnh nhân Sporotrichose đến khám tại Bệnh viện Da liễu
Trung Ương và phòng Khám Da liễu TTPCBXH Lâm đồng
2.2.3 Các kỷ thuật áp dụng trong nghiên cứu:
2.2.3.1 Nghiên cứu lâm sàng:
- Lập phiếu nghiên cứu và làm bệnh án điều trị (xem phụ lục)
- Chọn bệnh nhân theo các tiêu chuẩn đề ra
- Phỏng vấn bệnh nhân, các thông tin cần thu thập:
+ Thông tin cá nhân: tên, tuổi, giới, dân tộc, trình độ học vấn, nơi cư
trú, nghề nghiệp.
+ Điều kiện môi trường làm việc lao động của bệnh nhân: cây trồng,
vật nuôi, phân bón, nguồn nước tưới, bảo hộ lao động …
+ Khảo sát quá trình nhiễm nấm: vị trí vết thương, thời gian ủ bệnh,
cach xử trí vết thương, những nơi đã đến khám và điều trị, kết quả …
+ Triệu chứng lâm sàng và diễn biến của bệnh: triệu chứng cơ năng,
triệu chứng thực thể, tỷ lệ các thể, diễn biến, quá trình lành bệnh, làm sẹo.
+ Tình trạng khám bệnh và điều tri trước đó: điều trị ở đâu? thuốc gì?
- Các bệnh nhân đều được giải thích và đồng ý tham gia.
2.2.3.2 Quy trình kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
Thu thập mẫu
- Lập phiếu điều tra cá nhân, giải thích cho bệnh nhân trước khi tiến
hành kỹ thuật rạch da.
- Bệnh phẩm là mủ hoặc chất hoại tử tại thương tổn. Loại bỏ bớt chất
hoại tử hoặc mủ ở bề mặt thương tổn, dùng tăm bông lấy chất dịch ở nền
Lý tưởng nhất, mẫu mô cần lấy bao gồm cả các mô lấy tại vị trí bình
thường, trung tâm và rìa của tổn thương. mẫu mô cần được giữ ẩm với nước
muối hoặc nước dùng BHI và được vận chuyển đến phòng thí nghiệm càng
sớm càng tốt.
Mẫu mô cần được giữ trong một đĩa petri vô trùng. Nếu bệnh phẩm có
mủ và chất hoại tử, cấy trực tiếp lên môi trường nuôi cấy. Ngoài ra thực hiện
thêm một tiêu bản để kiểm tra trực tiếp. Cắt mẫu thành từng miếng nhỏ với
một lưỡi dao vô trùng, Cấy mẫu bệnh phẩm đã cắt nhỏ lên môi trường.
- Cấy vào Sabouraud dextrose agar có chứa chloramphenicol và
gentamicin và nuôi cấy ở 26
o
C và 35
o
C,
- Hoặc cấy vào thach dinh dưỡng (BHIA), bổ sung máu cừu 5% và ủ
tại 35
o
C. Duy trì nuôi cấy trong 4 tuần.
Lưu ý: Tránh nhiễm khuẩn cho đĩa cấy vào túi nilon vô trùng hoặc dán kín
nắp đĩa petri, duy trì ở 26
0
C quan sát trong 4 tuần, một số nấm phát triển chậm.
Xét nghiệm soi tươi quan sát trực tiếp vảy da, tóc và móng tay hoặc cho các
thành phần khác của nấm
Chuẩn bị Kali Hydroxide - Dimethyl Sulfoxide (KOH-DMSO)
Phương pháp:
Sử dụng một pipette an toàn, thêm DMSO với nước cất và sau đó hòa
tan trong dung dịch KOH.
Dimethyl sulfoxide (DMSO) 40 ml
Nước cất 60 ml
18
8. Nhẹ nhàng nhỏ một giọt nhỏ Lactophenol Coton màu xanh trên
một slide thủy tinh sạch.
9. Âp nhẹ nhàng lamen lên giọt Lactophenol cotton để lại qua đêm
cho khô và sau đó gắn lamen vào lam thủy tinh bằng sơn bóng.
10. Quan sát dưới kính hiển vi
Mô tả khúm nấm và bào tử của S.schenckii
Tại 25oC, khuẩn lạc nấm chậm phát triển, mắt khuẩn lạc trông ẩm và
nhẵn , bề mặt nhăn nheo nhiều nếp gấp. Một số chủng có thể sinh sợi nấm
ngắn trên không và sắc tố có thể thay đổi từ trắng đến kem sang màu đen. Các
bào tử đính phát sinh ở các góc từ vách mỏng của sợi nấm và thường chỉ có
một, mọc thẳng và nhỏ dần về phía đỉnh (như điếu xì gà). Bào tử nấm được
phát triển thành cụm có nhiều mấu nhỏ, với nhiều gố nhỏ chứa bào tử đính
trông như một bông hoa (hoa đào). Tùy vào thời gian nuôi cấy, bào tử nấm
được hình thành bào tử đính và sợi nấm không khác biệt. Bào tử nấm có hình
trứng 3-6 x 2-3 um, trong suốt, có một vách ngăn và rất mỏng. Trên thạch
máu BHI ở 37 oC, khúm nấm nhẵn, trắng xám vàng và giống khúm nấm men,
có các tế bào nấm men hình cầu hay hình bầu dục vừa chớm nở. 19 Tách chiết DNA và phản ứng PCR
Kỹ thuật tách chiết DNA:
Chuẩn bị dụng cụ, hóa chất
- Chuyển cột lọc trên sang ống nghiệm có nắp, ghi mã số mẫu, thêm vào
cột lọc 100l dung dịch thôi DNA, để ở nhiệt độ phòng 1 phút. Ly tâm 8000rpm/1
phút. Phần dịch li tâm là dung dịch có chứa DNA.
- Giữ mẫu DNA trong tủ lạnh -20
o
C, cho đến khi sử dụng.
Phản ứng PCR và Nested PCR
Gen đích:
- M85053 18S rRNA gene of S. schenckii
Trình tự các mồi
SS1, 5’-CTC GTT CGG CAC CTT ACA CG-3’, (1007-1026)
SS2, 5’-CGC TGC AGC CAA AAC GCG GG-3’, (1311-1292)
Sản phẩm PCR: 305-nucleotide.
SS3, 5-ACT CAC CAG GTC CAG ACA CGA TG-3’; (1146-1168)
SS4, 5’-CGC TTT GGG AGG TTA AGC AG-3’, (1297-1275)
Sản phẩm PCR 152-nucleotide.
21
Thành phần phản ứng PCR:
PCR1:
- Nước tinh khiết 30,5 l
- Buffer 5 l
- dNTP (A-T-G-C) 5 l
- Primers SS1 2 l
- Primers SS2 2 l
- Taq-polimerase ( Takara) 0,5 l
Điện di phát hiện:
1. Pha dung dịch TAE 1 X bằng cách cho thêm 960 ml nước cất vào với 40
ml TAE 25X được cung cấp, lắc đều.
2. Đun thạch Agarose 2% bằng cách trộn 2gram Agarose được cung cấp
trong 100 ml TAE 1X. Đun tan thạch trong lò viba hay đun cách thủy
cho đến khi tan hòan toàn, trong lúc đun thỉnh thoảng lắc dung dịch
agarose để đảm bảo tan hết. Đừng để dung dịch agarose sôi trào ra ngoài.
3. Để thạch nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút, cho vào thạch 4 l
Ethidium bromide 10mg/ml (hóa chất độc nên cẩn thận khi thao tác,
mang găng tay, tránh hít vào mũi, và tránh dính vào da), trộn hòa tan đều
Ethidium bromide vào trong thạch, tránh làm thạch có bọt khí khi trộn.
4. Chuẩn bị khuôn đổ thạch, đặt lược vào khuôn, rồi đổ thạch vào khuôn
cho đạt bề dày mong muốn (khoảng 4-5mm). Để thạch nguội và đặc
trong nhiệt độ phòng.
5. Khi thạch đặc, gỡ lược. Đặt thạch vào trong máng điện di, đổ dung dịch
TAE 1X cho ngập mặt thạch.
6. Chuẩn bị mẫu thử bằng cách cho 12 l Loading buffer vào trong mỗi
mẫu thử (50l), thay đầu cone sau mỗi lần nhỏ, vortex nhẹ để trộn đều.
7. Dùng micropipette cho mẫu vào giếng theo thứ tự, nếu cần cho 1 giếng
chứa DNA marker để so chuẩn DNA. Chạy điện di trong 20- 30 phút ở
dòng điện 100V.
8. Sau khi chạy xong (khi thấy vệt màu xanh cách giếng khoảng 2-2.5 cm)
lấy khuôn ra khỏi máng và đẩy gel lên hộp UV. Xem các band DNA
dưới tia sáng của đèn UV. 23
.
Các xét nghiệm khác: XQ xương, phổi thẳng và nghiêng, công thức máu,
- Các kỷ thuật nghiên cứu không gây ra bất cứ một tác hại nào trên
bệnh nhân.
- Bệnh nhân được giải thích về mục tiêu nghiên cứu và đồng ý tham gia
- Mọi thông tin về bệnh nhân được giữ bí mật.
- Đề cương nghiên cứu sẽ được Hội đồng chấm đề cương luận văn
chuyên khoa cấp II Trường đại học Y Hà nội xét duyệt thông qua. 25
CHƯƠNG 3
DỰ KIẾN KẾT QUẢ
3.1. Phân tích tình hình, đặc điểm hình thái lâm sàng bệnh Sporotrichose
và các yếu tố liên quan :
Đặc điểm BN: tuổi, giới, dân tộc, địa chỉ,trình độ học vấn, nghề nhiệp.
B¶ng 3.1: Ph©n bè tuæi (n=50)
Nhóm tuổi
Số bệnh nhân
Tỷ lệ%
n
%
< 20
20 - 29
Tổng
Copyright: Tài liệu đại học ©