49  gi|12744677|gb|AF319491.1|AF319491 Papaya ringspot virus isolate QrFC-1
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744675|gb|AF319490.1|AF319490 Papaya ringspot virus isolate OxT-80
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744673|gb|AF319489.1|AF319489 Papaya ringspot virus isolate OxT-66
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744671|gb|AF319488.1|AF319488 Papaya ringspot virus isolate OxT-27
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744667|gb|AF319486.1|AF319486 Papaya ringspot virus isolate McFJ-57
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744665|gb|AF319485.1|AF319485 Papaya ringspot virus isolate McFJ-18
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12744659|gb|AF319482.1|AF319482 Papaya ringspot virus isolate JlPV-13
coat protein (CP) gene, partial cds
 gi|12584306|gb|AY017190.1| Papaya ringspot virus clone CpT-30 polyprotein
gene, partial cds
 gi|12584304|gb|AY017189.1| Papaya ringspot virus clone GrCy-9 polyprotein
gene, partial cds
 gi|11141739|gb|AF309968.1|AF309968 Papaya ringspot virus isolate Colima
coat protein (CP) mRNA, partial cds
 gi|63034424|gb|DQ008449.1| Papaya ringspot virus P isolate VER75-pr.8-5
coat protein gene, partial cds
 gi|63034422|gb|DQ008448.1| Papaya ringspot virus P isolate VER74-pr.8-12
coat protein gene, partial cds
 gi|63034420|gb|DQ008447.1| Papaya ringspot virus P isolate VER73-pr.8-8
coat protein gene, partial cds

đƣợc giữ nguyên nhƣ cũ).

Hình 4.5 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 trên
sản phẩm thu đƣợc từ cặp mồi 1 51 Nhận xét:
Kết quả phản ứng PCR trên cặp mồi P7-M30 chỉ cho 1 band duy nhất với kích
thƣớc 429 bp, điều này đã giải tỏa đƣợc nghi ngờ về sản phẩm 900 bp thu đƣợc từ cặp
mồi 1. Chứng tỏ sản phẩm 900 bp này đúng là đã đƣợc khếch đại từ trình tự gene CP
của PRSV.
- Để kiểm chứng lại độ tin cậy của thí nghiệm Nested-PCR trên hai cặp mồi 1 và
P7-M30, chúng tôi tiến hành thí nghiệm Nested-PCR một lần nữa trên hai cặp mồi P7-
M30 và P14-M31 (trình bày ở phần Vật liệu và phƣơng pháp).
Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi P14-M31 trên khuôn mẫu là sản phẩm cDNA
thu đƣợc từ phản ứng sao chép ngƣợc RNA tổng số từ kit ly trích (với quy trình và hóa
chất PCR đƣợc giữ nguyên nhƣ chuẩn ban đầu). Hình 4.6 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P14-M31
Nhận xét:
Sản phẩm khuếch đại chỉ gồm một band duy nhất với kích thƣớc 658 bp, chứng tỏ
cặp mồi P14-M31 là đặc hiệu.
Từ sản phẩm 658 bp này, ta lấy 1μl sản phẩm để sử dụng làm khuôn cho phản ứng
PCR tiếp theo với cặp mồi trong là P7-M30 (với quy trình chuẩn ban đầu).
658 bp



Nhƣợc điểm
- Phƣơng pháp RT-PCR do cần phải có giai đoạn tách chiết RNA nên tốn nhiều thời
gian hơn; mẫu RNA sau đó phải đƣợc bảo quản ở điều kiện lạnh, sạch, an toàn. Nếu
không, mẫu để lâu sẽ không đảm bảo, dễ nhiễm RNase từ môi trƣờng làm phân hủy
RNA mẫu, gây hiện tƣợng âm tính giả; hoặc dễ nhiễm RNA lạ từ môi trƣờng làm
nhiễu kết quả thí nghiệm, đôi khi còn gây hiện tƣợng dƣơng tính giả.
- So với ELISA, RT-PCR đòi hỏi điều kiện thực hiện thí nghiệm nghiêm ngặt hơn,
phải có hóa chất và dụng cụ chuyên dùng khi thao tác với RNA. Điều kiện thí ngiệm
phải luôn đảm bảo ở nhiệt độ lạnh hoặc mát; luôn đeo găng tay để tránh Rnase trên
đầu ngón tay dính vào mẫu, eppendoff…
- Hóa chất sử dụng cho tách chiết và thực hiện RT-PCR phải có độ tinh khiết cao,
do đó giá thành cũng cao hơn so với ELISA. Vì vậy, việc chẩn đoán bệnh bằng kĩ
thuật RT-PCR khó thực hiện và phổ biến rộng rãi đối với các nƣớc có nền kinh tế còn
khó khăn, đang phát triển. Từ đó nó cản trở khả năng phổ biến, ứng dụng vào thực tiễn
của phƣơng pháp RT-PCR.
Nhìn chung ELISA có độ nhạy thấp hơn song xét về mặt kinh tế và tính dễ thực
hiện nó có nhiều ƣu điểm hơn so với kĩ thuật RT-PCR.
4.4. Kết quả giải trình tự một số mẫu
Các mẫu đƣợc chọn giải trình tự bao gồm:
- Mẫu thu tại xã Mỹ Hiệp (khuếch đại với cặp mồi P14-M31, có kích thƣớc sản phẩm
là 658 bp)
- Mẫu thu tại xã Mỹ Hiệp (khuếch đại với cặp mồi P7-M30, có kích thƣớc sản phẩm
là 429 bp)
- Mẫu thu tại huyện Định Quán (khuếch đại với cặp mồi P7-M30, có kích thƣớc sản
phẩm là 429 bp)
Kết quả giải trình tự cho thấy
Mỹ Hiệp (658 bp)
Chỉ giải trình tự đƣợc với mồi P14, mồi M31 bị nhiễu nhiều. Song kết quả đọc của
mồi P14 khá tốt, đoạn thu nhận có kích thƣớc 619 bp (xem phần Phụ lục 8).

3
AJ012649 TCGACTAGCACAAGAACTGGAGAGAAAGATAGAGATGTCAATGTCGGGACCAGTGGAACT 180

3 1 CCGAGAATAAAATCATTTACTGACAAGATGATTTTACCGAAAATTAAAGGA 51
AJ012649 181 TTCACGGTTCCGAGAATTAAATCATTCACTGATAAGATGATTCTACCAAGAATTAAGGGA 240
190******** ******** ***** ********* **** * ****** ***

3 AAAACTGTCCTTAATTTTAAATCATCTTCTTCAGTATAATCCGCAACAAATTGATATCTC 111
AJ012649 AAGACTGTCCTTAATTT-AAATCATCTTCTTCAGTATAATCCGCAACAAATTGACATTTC 299
** ************** ************************************ ** **

3 AAACACTCGTGCCACTCAAACTCAATTCGAAAAGTGGTATGAGGGAGTGAGGAATGATTA 171
AJ012649 TAACACTCGTGCCACTCAGTCACAATTTGAGAAATGGTATGAGGGAGTGAGGAATGATTA 359
***************** * ***** ** ** **************************

3 CGGTCTCAACGATAACGAAATGCAAGTG-ATGTTAAACGGTTTGATGGTTTGGTGTATTG 230
AJ012649 TGGTCTGAATGATAATGAAATGCAAGTG-ATGCTGAATGGCTTGATGGTTTGGTGTATCG 418
***** ** ***** ************ *** * ** ** ***************** *

3 AAAATGGTACATCTCCAGACTTATCTGGTGTTTGGGTAATGATGGATGGGGAAACACAAG 290
AJ012649 AGAATGGTACATCTCCAGACATATCTGGTGTTTGGGTTATGATGGATGGGGAAATTCAAG 478
* ****************** **************** **************** ****

3 TTGATTATCCCATTAAGCCTTTAATTGAACATGCAACTCCTTCGTTTAGGCAAATCATGG 350
AJ012649 TTGACTATCCAATCAAGCCTTTAATTGAGCATGCTACCCCGTCATTTAGGCAGATTATGG 538
**** ***** ** ************** ***** ** ** ** ******** ** ****

3 351 CTCACTTCAGTAACGCGGCAGAGGCATACATCGCAAAGAGGAATG 396
AJ012649 CTCACTTTAGTAACGCGGCAGAAGCATATATTGCAAAGAGAAATGCCACTGAGAGGTACA 598
******* ************** ***** ** ******** ****

AY231130 GATGGGGAAATTCAAGTTGACTATCCAATCAAGCCTTTAATTGAGCATGCTACCCCGTCA 9778
********** ******** ***** ** ************** ***** ** ** **

3 TTTAGGCAAATCATGGCTCACTTCAGTAACGCGGCAGAGGCATACATCGCAAAGAGGAAT 394
AY231130 TTTAGGCAGATTATGGCTCACTTTAGTAACGCGGCAGAAGCATATATTGCAAAGAGAAAT 9838
******** ** *********** ************** ***** ** ******** ***
3 395 G
AY2311309839 GCCACTGAGAGGTACATGCCGCGGTATGGAATCAAGAGAAATTTGACTGACATTAGCCTC 9898
583
Nhận xét
Khi đem so sánh đoạn chung nhất của cả 3 mẫu đƣợc giải trình tự, nhận thấy sự
tƣơng đồng của nó với genome cũng nhƣ trình tự gene CP của PRSV là tƣơng đối cao
(chi tiết xem Phụ lục 12 và 13). Chứng tỏ mẫu bệnh dƣơng tính từ phản ứng PCR
chính là gene CP của PRSV. Vậy kết quả PCR thu đƣợc là đúng với sản phẩm lý
thuyết của cặp mồi tƣơng ứng. Điều này khẳng định quy trình RT-PCR đã thiết lập với
các cặp mồi P7-M30, P14-M31 là hoàn toàn đáng tin cậy. 56 PHẦN V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Dựa trên các kết quả thu đƣợc, chúng tôi đi đến kết luận nhƣ sau:
Kết quả từ thí nghiệm với bộ kit DAS ELISA:
- Tỉ lệ nhiễm bệnh ở các địa điểm: Xã Mỹ Hiệp: 92,68 %
Xã Bình Thạnh: 77,42 %
Xã Phú Tân: 47,37 %
Xã Phú Lộc: 47,37 %

mong muốn.
- Quy trình RT-PCR để chẩn đoán PRSV là hoàn toàn đáng tin cậy mặc dù vẫn cần
phải tiếp tục hoàn thiện một số thông số.
5.2. Đề nghị
Một số việc chúng tôi vẫn chƣa thực hiện đƣợc do điều kiện thời gian và hóa chất
không cho phép, chúng tôi đề nghị:
- Với mỗi bộ kit PLANTEST
®
ELISA (gồm 5 dĩa ELISA), chỉ nên thực hiện với
một chỉ tiêu cần đánh giá (chỉ xem xét về địa điểm hoặc giống hoặc độ tuổi). Mỗi chỉ
tiêu sẽ đƣợc thống kê trên số lƣợng 135 mẫu/kit, nhƣ vậy mới đảm bảo độ tin cậy của
những thống kê trên chỉ tiêu mong muốn.
- Quy trình phản ứng Nested-PCR vẫn chƣa thật hoàn chỉnh, kết quả thu nhận qua
điện di còn nhiều khuyết điểm (band điện di bị smear nhiều). Do đó chúng tôi đề nghị
cần có thêm thời gian và hóa chất để cải thiện quy trình nhƣ: thay đổi các thông số về
nhiệt độ, thời gian, số chu kì, hóa chất (Taq polymerase, MgCl
2
, lƣợng khuôn mẫu….).
- Tăng số lƣợng mẫu đƣợc giải trình tự để có thể so sánh đƣợc mối quan hệ dòng,
giống giữa các mẫu thu thập ở các địa bàn khác nhau. 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT



11. Nguyễn Xuân Thành, 1996. Sâu hại Bông, Đay và thiên địch của chúng ở Việt
Nam. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 159 trang.

12. Phạm Văn Ty, 2001. Miễn dịch học. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia, Hà Nội.
Trang 23 – 47; 149 – 166.

13. Cục Bảo vệ Thực vật, 2003. Phương pháp điều tra phát hiện sinh vật hại cây
trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 45 trang.