9
Hình 2.2: Vị trí của MrNV trong họ gia đình Nodavirius (Bonami và cộng sự, 2005).

Họ Nodaviridae chia làm hai nhóm: Alphanodavirus gây bệnh chủ yếu cho côn
trùng và Betanodavirus gây nhiễm cho cá. Thể virus này không có màng bao, hình đa
mặt, đƣờng kính 25 - 30 nm, bộ gen gồm hai sợi RNA(+) đơn. Trong đó, RNA - 1 (3,1
kb) mã hoá cho một protein không cấu trúc có kích thƣớc 100 kDa với chức năng nhƣ
là RNA polymerase. RNA - 2 (1,4 kb) mã hoá cho hai phân tử protein vỏ lớn có kích
thƣớc lớn khoảng 43 kDa và 41 kDa đƣợc hình thành do quá trình đồng sao chép một
chuỗi polypeptide. Một RNA - 3 cũng đƣợc phát hiện trong các tế bào bị nhiễm nhƣng
không tồn tại trong thể virus. Hiện nay, sản phẩm của RNA phụ này (0,4 kb) vẫn chƣa
xác định chức năng (Mori và cộng sự, 1992).
XSV là một satellite virus có kích thƣớc nhỏ hơn virus MrNV với đƣờng kính
15 nm, có vật liệu di truyền là RNA với chiều dài khoảng 0,8 - 0,9 kb (Qian và cộng

sinh mầm bệnh. Theo Widada và Bonami (2004) giả thuyết rằng XSV không có gen
mã hoá cho RNA polymerase. Vậy yếu tố nào cung cấp và cần cho XSV cộng hƣởng.
Hay XSV cộng hƣởng và làm giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh. Sự cộng hƣởng
này ít thấy trong những virus. Những virus cộng hƣởng (dependovirus) này vừa đƣợc
biết trong khoảng thời gian gần đây (Van Regenmortel và cộng sự, 2000), và chúng
phụ thuộc vào hiệu quả sự sao chép của những virus giúp đỡ (helper virus) nhƣ
adenovirus hoặc herpes virus. Những virus giúp đỡ này có đƣờng kính 20 nm, có vật
liệu di truyền là ss - DNA (4,7 kb), chứa một gen DNA polymerase. Một nhóm virus
khác là thể satellite virus, nhóm virus này thì sống sót khi thiếu một gen polymerase
cần cho sự sao chép của chúng (Van Regenmortel và cộng sự, 2000). Điều này cho
thấy là XSV sử dụng enzym RNA polymerase của MrNV nhƣng XSV sẽ mã hoá một
chức năng cần thiết cho sự phát triển của MrNV hay làm phát sinh thêm mầm bệnh
của MrNV thì không biết đƣợc (Widada và Bonami, 2004). Nhƣng XSV thiếu một
enzym sao chép thì XSV thật sự là một satellite virus (Widada và Bonami, 2004).
XSV liên quan gần phân nhóm 2 (tobacoo nercrosis satellite virus - like) hơn là phân
nhóm 1 (chronic bee - paralysis associated satellite virus - like) của satellite virus. Đến
bây giờ các nhà khoa học chỉ quan sát đƣợc những satellite virus trong những ký chủ
là thực vật. XSV là kiểu virus satellite đầu tiên đƣợc báo cáo là gây bệnh trong động
vật. XSV cũng đƣợc ghi nhận là satellite-nodavirus cộng hƣởng đầu tiên (Widada và
Bonami, 2004).

2.3. NHỮNG PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐUÔI
TRẮNG DO VIRUS GÂY RA TRÊN TÔM CÀNG XANH
2.3.1. Phƣơng pháp mô học.
Mẫu phải đƣợc cố định trong Davidson trong 24 giờ. Cắt thành từng lát mỏng
rồi đặt trên lam kính, nhuộm bằng Pryonin methyl green, đậy lam và quan sát tiêu bản
trên kính hiển vi thấy thể vùi của virus có hình mắt lƣới trong mô tế bào kế cận của tất
cả các cơ quan và các mô (Tung và cộng sự, 1999). Thể vùi của virus MrNV nằm
trong nhân tế bào hồng cầu bắt màu xanh với thuốc nhuộm Pryonin methyl green
(Tung và cộng sự, 1999).

đen, màu này cho biết sự hiện diện tƣơng ứng RNA của MrNV, mẫu âm tính có màu
vàng cam sau quá trình lai. Việc kết tủa đã đƣợc quan sát trong tế bào chất, vài phản
ứng dƣơng thì cũng đƣợc quan sát xung quanh vùng cơ hoại tử. Không có dấu hiệu của
virus đƣợc quan sát trong mang, gan, tụy tạng hoặc biểu mô ống tiêu hoá và biểu bì cơ
(Widada và cộng sự, 2003). 12
Hình 2.3: Lai tại chỗ bằng cách sử dụng probes MrNV (Widada và cộng sự, 2003).
Hình a: tổng thể phần đầu ngực của tôm postlarvae bị nhiễm MrNV.
Phần 1a: vùng mang không bị nhiễm có màu vàng cam.
Phần 2a: vùng đầu ngực bị nhiễm MrNV có màu tím đen.
Phần 3a: vùng tụy tạng không bị nhiễm có màu vàng cam
Hình b: lai dƣơng tính với những sợi cơ.
phần 1b: vùng cơ bị nhiễm MrNV có màu tím đen.

2.3.4. Phƣơng pháp Sandwich - ELISA (A sandwich enzyme linked immunosorbent
assay)


2.3.5.2. Phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc:
Bƣớc 1: giai đoạn biến tính (denaturation), trong một dung dịch phản ứng bao
gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính cao hơn Tm
của phân tử; thƣờng là 94 - 95
0
C trong 30 - 60 giây. Mạch đôi DNA tách thành mạch
đơn.
Bƣớc 2: giai đoạn lai (anealation) nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn Tm của các mồi,
cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động
trong khoảng 40 - 70
0
C, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 - 60 giây.
Bƣớc 3: giai đoạn tổng hợp (elongation), nhiệt độ đƣợc tăng lên 72
0
C giúp
cho DNA polymerase (polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian
của bƣớc này tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30
giây đến nhiều phút.
Một phản ứng PCR không vƣợt quá 50 chu kỳ. Vì phản ứng PCR diễn tiến qua
hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với
lƣợng mẫu ban đầu, sau đó kết quả khuếch đại giảm hẳn nên số chu kỳ cho một phản
ứng tuỳ thuộc vào số lƣợng bản mẫu ban đầu.

2.3.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 14
DNA mẫu:

2.3.5.4. Các thành phần khác của phản ứng PCR
Bốn loại nucleotide thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 20 - 200 M/mỗi
nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong
các thành phần trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của
polymerase. 15
Mg
2+
là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA
polymerase chịu nhiệt. Nồng độ Mg
2+
ảnh hƣởng mạnh tới quá trình chạy PCR. Nồng
độ Mg
2+
quá thấp (< 0,5 mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động
của Taq polymerase bị ức chế. Nồng độ Mg
2+
quá cao tuy ổn định mạch kép DNA
nhƣng lại hạn chế sự biến tính hoàn toàn sản phẩm trong mỗi chu kỳ dẫn đến giảm sản
phẩm cuối cùng. Quá thừa Mg
2+
dẫn đến sự bắt cặp sai giữa mồi và khuôn, kết quả là
tạo ra nhiều sản phẩm không đặc hiệu. Nồng độ tối ƣu Mg
2+
phải đƣợc xác định cho
từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm.

2.3.5.5. Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR.

Bespalova và cộng sự, 1998).
 Sự tổng hợp sợi cDNA đầu tiên có thể đƣợc thực hiện bằng một đoạn mồi
oligonucleotide bắt cặp đặc hiệu (gene - specific priming, GSP) với vùng đã đƣợc
chọn trên sợi RNA hoặc mRNA đặc trƣng GSP đƣợc gọi là mồi ngƣợc, sự khuếch đại
sau đó sẽ đƣợc bổ sung thêm một mồi xuôi tƣơng thích với trình tự đặc hiệu trên
cDNA (Frohman, 1995 ; Schaefer, 1995 ; Bespalova và cộng sự, 1998).
 Một đoạn gồm 6 nucleotide ngẫu nhiên có thể dùng làm mồi để tổng hợp
cDNA tại nhiều điểm dọc theo sợi RNA mẫu, tạo ra nhiều đoạn bản sao khác nhau trên
toàn bộ phân tử RNA. Phƣơng pháp này rất hữu dụng để khuếch đại sợi RNA quá dài
hoặc chứa nhiều cấu trúc bậc hai không thể tổng hợp bằng oligo (T) hoặc GSP (Lee và
Caskey, 1990).

Trong việc chẩn đoán bệnh trắng đuôi, phƣơng pháp Single - Step RT - PCR
dùng để khuếch đại RNA của hai virus ở trong cùng dung dịch tách chiết (Widada ,
2003, 2004 ; Sahul Hameed, 2004a và cộng sự). Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành
bằng cách phiên mã ngƣợc và khuếch đại đoạn gen mong muốn trong một ống phản
ứng đơn cho mỗi virus (single reaction tube) bằng một chu kỳ nhiệt không liên tục. Kỹ
thuật này phát hiện MrNV bằng cách sử dụng một cặp mồi MrNV - RNA2 - F và
MrNV - RNA2 - R đặc hiệu cho RNA - 2 của MrNV đƣợc thiết kế từ trình tự của bộ
gen MrNV (Genbank accession no. AY222840) (Widada, 2003; Sahul Hameed và
cộng sự, 2004a). Phát hiện XSV bằng cách cặp mồi XSV - F và XSV - R đƣợc công
bố (Widada và cộng sự, 2004). Nguyên tắc phản ứng giống (hình 2.4) sử dụng hai mồi
MrNV - RNA2 - R và XSV - R là hai mồi ngƣợc sẽ bắt cặp với tƣơng ứng với RNA
của từng virus, sau đó sẽ tạo cDNA trong một thời gian, rồi gia nhiệt để bất hoạt
enzym phiên mã ngƣợc, chu kỳ tiếp tục đƣợc thực hiện cùng với hai mồi MrNV -
RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R và XSV - F và XSV - R cho từng virus. Kích thƣớc
sản phẩm khuếch đại 681 bp là MrNV và 500 bp là XSV. 17

Tổng hợp cDNA
MrNV
XSV
Tạo
cDNA
Bất hoạt
enzym RT

Khuếch đại
Tạo
cDNA
Bất hoạt
enzym RT

Khuếch đại
Tiếp tục chu kỳ
Tiếp tục chu kỳ
681 bp
500 bp 19
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 NỘI DUNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
3.1.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
 Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR (Widada, 2003, 2004; Sahul
Hameed và cộng sự, 2004a) trên mẫu tôm càng xanh bệnh trắng đuôi đƣợc cung cấp từ Ấn
Độ.
 Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT - PCR nhƣ
phƣơng pháp tách chiết, nồng độ mồi, nhiệt độ lai của mồi.

681 bp
MrNV-RNA2-R
5’-GACGATAGCTCTGATAATCC-3’
XSV
XSV-F
5’-GGAGAACCATGAGATCACG-3’
500 bp
XSV-R
5’-CTGCTCATTACTGTTCGGAGTC-3’ 20

3.2.3. Hạt bead RT - PCR: READY - TO - GO (Chế phẩm sử dụng ngay)
Sản phẩm này do công ty Amersham pharmacia biotech, Mỹ sản xuất. Đây là
chế phẩm có sẵn các thành phần để thực hiện phản ứng RT - PCR, khi sử dụng ta chỉ
cần thêm bản mẫu và mồi sử dụng . Mỗi loại hạt Bead đƣợc thiết kế cho một phản ứng
với thể tích cuối 50 µl.
Thành phần của hạt bead gồm:
 2 đơn vị Taq DNA polymerase
 10 nM Tris - HCL (pH 9, nhiệt độ phòng)
 60 nM KCl
 1.5 mM MgCl
2

 20 M mỗi loại dNTP
 M - MulV Reverse Transcriptase
 RNA guard
TM


8
234
9
194
10
118
11
72

3.2.6. Hoá chất khác
Trizol
Phenol (pH 4)
Guanidine thiocyanate 0,8 M
Ammonium thiocyanate 0,4 M
Sodium acetate, pH 5, 0,1 M
Glycerol 5%
 Ethanol 75%
 Isopropanol 100%
 Chloroform
 DEPC (Diethyl Prycacbonat)
 Ethidium bromide
 Dung dịch đặt mẫu (bromophenol blue 0,25%, glycerol 40%, Tris
HCL 200 mM, EDTA 200 mM)
 Agarose.
 TBE 1X (Tris - boric acid 40 nM, EDTA 0,1 mM). 22
 Nƣớc cất 2 lần có sử lý DEPC 1% (DEPC - H
2

ml khác (hút khoảng 600 l cho mỗi ống).Thêm vào mỗi ống 600 l Isopropanol lạnh.
Ủ nhiệt độ phòng trong 10 phút (qua đêm - 20
0
C hay để - 70
0
C trong 1 giờ). Ly tâm
12000 vòng trong 10 phút. Loại bỏ dung dịch nổi. Rửa cặn RNA bằng 1 ml Ethanol
70%. Vortex, ly tâm 7500 vòng trong 5 phút. Loại bỏ dung dịch nổi. Làm khô cặn
RNA ở 55
0
C. Hòa cặn RNA trong 50 l H
2
0 - DEPC. Sau đó bảo quản - 20
0
C.

23
3.3.1.2. Tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation kit (Bio - Rad)
Lấy 5 - 10 mg mô tƣơi. Nghiền mẫu trong eppendorf với 300 l RNA Lysis.
Thêm vào 100 l dung dịch Protein - DNA để phá vỡ tế bào. Đảo ngƣợc ống 10 lần và ủ
trên nƣớc đá 5 phút. Ly tâm lạnh (4
0
C) ở 13000 vòng trong 6 phút, kết tủa protein và
DNA sẽ có màu trắng. Hút dung dịch nổi chứa RNA (loại bỏ lớp dƣới) vào eppendorf 1,5
ml sạch chứa 300 l 100% Isopropanol (trên đá). Đảo ngƣợc ống 20 - 25 lần. Ly tâm
13000 vòng trong 6 phút (4
0

2
0 – DEPC
43 l
MrNV -RNA2-F (20 pmol/ l)
1 l
MrNV-RNA2-R (20 pmol/ l)
1 l
Bản mẫu
5 l
XSV
H
2
0 – DEPC
43 l
XSV - F (20 pmol/ l)
1 l
XSV - R (20 pmol/ l)
1 l 24
Bản mẫu
5 l

Kết thúc quá trình phiên mã ngƣợc, dung dịch phản ứng đƣợc biến tính ở 94
0
C
trong 2 phút nhằm ức chế enzym phiên mã ngƣợc. Sau đó thực hiện quá trình khuếch
đại acid nucleic bằng phƣơng pháp PCR hai mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2
- R cho MrNV, XSV - F và XSV - R cho XSV trong 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm:

sánh vị trí của các phân tử trên gel với thang chuẩn để xác định kích thƣớc các phân tử
mục tiêu.
Cách tiến hành:
 Đổ gel: 25
Cân 1g agarose cho vào bình tam giác 250 ml, thêm vừa đủ 100 ml TBE 1X
vào, đun nóng cho tan agarose. Để nguội khoảng 50 - 55
0
C, cho vào 2 l ethidium
bromide (10 mg/ml). Trong thời gian chờ nguội ta lắp lƣợc vào khay, đổ gel vào khay,
đợi 15 - 30 phút cho gel đông lại. Đổ TBE 1X vào bồn điện di cho ngập (cao hơn gel
khoảng 5 mm). Khi gel đã khô, rút lƣợc ra khỏi giếng, đặt gel vào bồn điện di.
 Nạp mẫu:
Cho vào eppendorf (0,2 ml) 10 l mẫu và 2 l dung dịch nạp mẫu (bromophenol
blue). Trộn đều, hút khoảng 10 - 12 l mẫu đặt vào giếng. Tƣơng tự đối với DNA chuẩn
chạy điện di ở hiệu điện thế 100 V, cƣờng độ dòng điện 2 Ampe, trong thời gian 40 phút.
 Phát hiện vạch DNA sản phẩm:
Sau khi chạy điện di, các phân tử DNA (sản phẩm của PCR và của thang chuẩn)
đƣợc nhuộm bởi ethidium bromide sẽ tập trung tại nơi có DNA, xen vào giữa hai sợi
DNA xoắn kép. Gel đã nhuộm này đƣợc xem dƣới tia tử ngoại. Phức DNA - ethidium
bromide hấp thụ tia tử ngoại ở 300 nm, còn lại một ít năng lƣợng và phát ra ở dạng tia
sáng nhìn thấy đƣợc 590 nm. Dƣới tia tử ngoại, các đoạn DNA (sản phẩm của PCR)
hiện ra có màu đỏ cam trên gel.

3.4. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.4.1. Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện MrNV,
XSV từ mẫu tôm bệnh (chứng dƣơng) đƣợc cung cấp từ Ấn Độ.
Trong thử nghiệm này chúng tôi đã sử dụng đúng qui trình của tác giả đƣa ra.

0
C cho cả hai virus theo bảng sau:
Bảng 3.4: Bảng khảo sát nhiệt độ lai của các mồi
Thí Nghiệm
1
2
3
4
5
Tm (MrNV)
54
0
C
55
0
C
56
0
C
57
0
C
58
0
C
Tm (XSV)
54
0
C
55