PHÁT HIỆN MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY Ô NHIỄM THỰC
PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR

TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Ứng dụng kỹ thuật PCR để phân tích vi sinh vật thực
phẩm hiện nay chưa được áp dụng nhiều trong các labo vi sinh.
Mục tiêu: so sánh phương pháp PCR và nuôi cấy trong kiểm nghiệm
vi sinh vật thực phẩm.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 270 loại mẫu thực phẩm thuộc
các nhóm thịt, thủy hải sản, sữa, và các loại bánh đã được thu thập và phân
tích so sánh bằng phương pháp nuôi cấy và phương pháp PCR với các bộ kit
do Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP. HCM cung cấp.
Kết quả: 100 mẫu thực phẩm kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật theo phương
pháp nuôi cấy và PCR cho thấy tỷ lệ mẫu dương tính đối với Salmonella là
8% và 20%; đối với E. coli là 44 và 88%; đối với S. aureus là 32 và 46%;
đối với Listeria monocytogenes là 8 và 13%. 70 mẫu thủy hải sản kiểm tra
V. parahaemolyticus cho kết quả nuôi cấy là 11,4% và PCR 17,1%. So sánh
về độ nhạy cho thấy phương pháp PCR cho kết quả tốt hơn (100%).
Kết luận: Sử dụng PCR giám sát mẫu thực phẩm nhằm phát hiện và
chọn nhanh các mẫu đạt yêu cầu (cho kết quả âm tính) khi kiểm tra chất
lượng vệ sinh thực phẩm sẽ tiết kiệm được thời gian trả lời kết quả so vớI
phương pháp nuôi cấy.
SUMMARY
Background: Nowadays, Applying PCR method to analyse bacterial
contamination in food is not popular in Viet Nam.
Objectives: Comparing of PCR method and traditional culture-based
method for control of food microbiology.
Method: 270 food samples including meats, sea products, milks, and
cakes were collected and comparatively analyzed by traditional culture-
based technique and PCR technique with kits supplied by the University of
Natural Sciences in HCMC.

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
- 270 mẫu thực phẩm: thịt, thủy hải sản, sữa và các loại bánh được thu
thập từ các chợ và các hàng quán trên đường phố tại TP. Hồ Chí Minh.
- Hóa chất và môi trường để phát hiện các vi sinh vật bằng phương
pháp nuôi cấy.
- Hóa chất dùng để phát hiện vi sinh vật bằng kỹ thuật PCR: hóa chất
tách chiết DNA, điện di và các bộ kit PCR để phát hiện cho các chỉ tiêu:
Salmonella spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Vibrio
parahaemolyticus và Listeria monocytogenes được cung cấp bởi Phòng thí
nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử Trường ĐH Khoa học Tự nhiên (thuộc
ĐH Quốc gia TP. HCM).
Phương pháp
- Mẫu thực phẩm được phân tích các chỉ tiêu vi sinh dựa trên qui định
của Bộ Y tế (QĐ 867/1998)(9) bằng cả hai phương pháp PCR và nuôi cấy.
- Phân tích mẫu bằng phương pháp nuôi cấy được thực hiện theo các
tiêu chuẩn như sau: Salmonella (TCVN 4829:2001), E. coli (TCVN
5155:90), S. aureus (TCVN 5156:1990), V. parahaemolyticus (QĐ
3349/QĐ-BYT) và Listeria monocytogenes (AOAC 2000 - 993.12)
- Phân tích mẫu bằng kỹ thuật PCR(7,8):
+ Xử lý mẫu: đồng nhất 25g mẫu trong 225ml môi trường tăng sinh
thích hợp, ủ từ 16 - 22h. Hút 1ml mẫu sau khi tăng sinh, xử lý .
+ Thu nhận DNA bản mẫu từ 1ml dịch sau tăng sinh, ly tâm
800vòng/phút, loại bỏ mảnh vụn thực phẩm, thu dịch nổi. Ly tâm
5000vòng/5phút, lấy cặn. Rửa cặn 2 lần bằng nước cất vô trùng. Ly tâm và
huyền phù cặn trong 200ml TE, đun ở 100oC/10phút. Ly tâm 12.000 vòng/5
phút. Hút 3ml dịch nổi là DNA khuôn cho vào tube chứa 21,5ml PCR mix
và 0,5ml Taq DNA polymerase (tổng thể tích là 25ml).
+ Thực hiện phản ứng PCR trên máy luân nhiệt (thermal cycler) của
hãng Bio-Rad theo chương trình đã cài đặt, gồm các bước sau:


-

+

-
Tần suất

8

92

19

81

20

80
Tỉ lệ %

8,00

92,00

19,00

81,00

20,00


56,00

88,00

12,00
Hình 2: Hình ảnh PCR phát hiện vi khuẩn E. coli
Ghi chú: Các mẫu từ D1 đến D14 (14 mẫu) E. coli đều dương tính,
vạch 299bp.
Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện S. aureus
Bảng 3: Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện S. aureus (n=100)
Mẫu thực phẩm

Nuôi cấy

PCR
+

-

+

-
Tần suất

32

68

46

-
Tần suất

8

92

13

87
Tỉ lệ %

8,00

92,00

13,00

87,00

Kết quả nuôi cấy và PCR phát hiện V. parahaemolyticus (hình 5)
Bảng 5: Kết quả nuôi cấy và PCR V. parahaemolyticus (n=70)
Mẫu thực phẩm

Nuôi cấy

PCR
+

-

Bảng 1 cho thấy kết quả kiểm tra định tính Salmonella trong thực
phẩm bằng 3 phương pháp: nuôi cấy, PCR-ELISA và PCR như sau: nuôi cấy
cho kết quả dương tính là 8 mẫu (8%), PCR-ELISA (bộ kit của hãng Bio-
Rad) cho số mẫu dương tính là 19 (19%) và PCR (bộ kit của trường Ðại học
KHTN) cho số mẫu dương tính là 20 (20%).
Như vậy, hai phương pháp PCR-ELISA và PCR cho kết quả tương
đương (19% và 20%) khi phát hiện Salmonella, nhưng cho tỉ lệ phát hiện
cao hơn hẳn phương pháp nuôi cấy (8%), sự khác bệt có ý nghĩa thống kê
(p<0,05). Điều này có thể lý giải như sau: trong các thực phẩm qua chế biến
có Salmonella bị chết, không thể phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy
nhưng vẫn phát hiện được bằng phương pháp PCR, nguồn thực phẩm ban
đầu đưa vào chế biến chưa đảm bảo vệ sinh vì theo chỉ tiêu đã qui định:
Salmonella không được hiện diện trong nguyên liệu chưa chế biến. ngoài ra,
phương pháp PCR có độ nhạy cao hơn phương pháp nuôi cấy nên cho kết
quả phát hiện cao hơn.
Bảng 2 thể hiện kết quả kiểm tra vi khuẩn E. coli trong thực phẩm
bằng 2 phương pháp nuôi cấy và PCR: nuôi cấy cho số mẫu dương tính là 44
(44%), PCR (bộ kit của trường Ðại học KHTN) cho 88 mẫu dương tính
(88%). Như vậy, phương pháp PCR có độ nhạy cao hơn hẳn phương pháp
nuôi cấy (88% so với 44%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Để
ứng dụng bộ kit này trong công tác giám sát vệ sinh thực phẩm, cần thực
hiện kỹ thuật bán định lượng cho qui trình PCR, nghĩa là đối với từng chủng
loại thực phẩm cho phép sự có mặt của E. coli bao nhiêu thì chúng ta sẽ pha
loãng mẫu đến đậm độ cho phép rồi sau đó mới tăng sinh và kiểm nghiệm
bằng PCR, nếu mẫu điện di dương tính có nghĩa mẫu là vượt quá giới hạn
cho phép.
Bảng 3 cho thấy kết quả kiểm tra S. aureus trong thực phẩm bằng 2
phương pháp nuôi cấy và PCR: nuôi cấy cho 32 mẫu dương tính (32%),
PCR (bộ kít của trường Ðại học KHTN) cho 46 mẫu dương tính (46%).
Phương pháp PCR cho kết quả dương tính cao hơn phương pháp nuôi cấy

như phương pháp nuôi cấy.
3. Tuy nhiên, phương pháp PCR phát hiện cả những mầm bệnh đã
chết (vẫn cho kết quả PCR dương). Do đó, phương pháp PCR phát hiện vi
khuẩn gây ô nhiễm thực phẩm có giá trị thực tiễn nhất trong việc chọn được
nhanh các mẫu cho kết quả âm tính – các mẫu thực phẩm đạt chất lượng tốt
qua giám sát.