Nghiên cứu đứt đoạn nhỏ nhiễm sắc thể Y ở
người bệnh vô sinh do không có tinh trùng
hoặc ít tinh trùng

Nguyễn Thị Việt Hà

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Khoa Sinh học
Luận văn Thạc sĩ ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70
Người hướng dẫn: PGS.TS. Trần Văn Khoa
Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Tổng quan về bệnh vô sinh và vô sinh ở nam giới. Nghiên cứu và đánh
giá tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể ở bệnh nhân vô sinh nam không có tinh trùng
hoặc ít tinh trùng. Hoàn thiện quy trình phát hiện mất đoạn vùng AZF trên nhiễm sắc
thể Y bằng kỹ thuật Multiplex PCR và phân bố mất đoạn vùng AZF trên nhiễm sắc
thể Y ở người bệnh vô sinh do không costinh trùng hoặc ít tinh trùng.

Keywords. Di truyền học; Bệnh vô sinh; Nhiễm sắc thể y; Bệnh tật; Tinh trùng

Content

Trong những năm gần đây, vô sinh đã trở thành một trong những vấn đề sức khỏe
sinh sản gây ảnh hưởng tới cuộc sống hạnh phúc của rất nhiều cặp vợ chồng và là một vấn đề
lớn của toàn xã hội. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy khoảng 10%- 15% các cặp vợ
chồng trong độ tuổi sinh đẻ bị vô sinh. Theo một nghiên cứu đa trung tâm của Tổ chức y tế
thế giới, gần 50% các trường hợp vô sinh có nguyên nhân do nam giới. Trong các nguyên
nhân vô sinh do nam thấy có khoảng 10%- 15% trường hợp không có tinh trùng (KCTT)
và 5 % ít tinh trùng (ITT) là do bất thường về mặt di truyền.
Việc chẩn đoán nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới là một trong những yêu cầu bắt

hiện những mất đoạn nhỏ trên vùng AZF của NST Y.
Phương pháp chọn mẫu của đề tài là chọn mẫu không xác suất.
Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 264 bệnh nhân vô sinh nam giới do KCTT hoặc ITT được
xét nghiệm NST, lập nhiễm sắc thể đồ tại Bộ môn Y sinh học- Di truyền, trường Đại học Y
Hà Nội, Bộ môn Sinh học- Di truyền y học, Học viện Quân y. Trong số 264 bệnh nhân được
xét nghiệm chọn ra 248 bệnh nhân có kết luận nhiễm sắc thể đồ bình thường 46,XY và không
có bất thường về cơ quan sinh dục ngoài để tiến hành xét nghiệm ADN nhằm kiểm tra và
phát hiện các mất đoạn nhỏ trên vùng AZF của NST giới tính Y.
Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp lâm sàng: Lập hồ sơ bệnh án
Các bệnh nhân nam giới được lập hồ sơ bệnh án và chẩn đoán vô sinh được thăm
khám lâm sàng, khai thác tiền sử gia đình, tiền sử bản thân, tuổi, nghề nghiệp, môi
trường làm việc, tiền sử mắc bệnh, nhiễm độc, quai bị, chấn thương bộ phận sinh dục,...
kết quả xét nghiệm tinh dịch đồ, nội tiết, siêu âm và các xét nghiệm khác.
- Phương pháp cận lâm sàng:
+Phương pháp phân tích NST và lập nhiễm sắc thể đồ
Nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi theo phương pháp của Hungerford D.A
(1965) có cải biên.
Nuôi cấy tế bào sau 72 giờ tiến hành thu hoạch.
Tiến hành nhỏ tiêu bản
Tiến hành nhuộm băng NST
Phân tích tiêu bản NST trên kính hiển vi và lập nhiễm sắc thể đồ bằng phần mềm Ikaros.
+Phương pháp phát hiện những mất đoạn vùng AZF của NSTY
Quy trình tách chiết ADN
Tiến hành đo nồng độ ADN mỗi mẫu bằng máy Nanodrop USA.
Sử dụng mẫu ADN thu được của từng bệnh nhân để chạy Multiplex PCR nhằm phát hiện
mất đoạn trên vùng AZF của NST Y.
Sản phẩn sau khi chạy Multiplex PCR xong được tiến hành điện di trên agarose, có sử dụng
Marker 100bp của hãng Invitrogen.
Đánh giá kết quả thu được bằng cách nhuộm bản và đọc kết quả thu được và kết luận.

Bất thường NST
Bất thường về
số lượng NST
Bất thường về
cấu trúc NST
Tổng số (%)
NST thường
1 4 5 (31,25%)
NST giới tính
10 1 11 (68,75%)
Tổng số 11 5 16 (100%)
Bảng 3: Phân bố các kiểu nhiễm sắc thể đồ bất thường ở bệnh nhân vô sinh nam giới:
Kiểu bất
thường
Nhiễm sắc thể đồ Số lượng
Bất thường số
lượng NST
NST giới tính
47,XXY 9

46,XX 1

NST thường
45,XY, der(13:14)(q10:q10) 1
Bất thường
cấu trúc NST
NST giới tính
46,XY, t(14;X) 1

NST thường

Trong nghiên cứu này, các STS được khuyến cáo bởi Học viện nam học Châu Âu
được sử dụng với một sự thay đổi nhỏ. Các STS cho AZFa và AZFb được giữ nguyên. Để
chẩn đoán mất đoạn nhỏ vùng AZFc, sY255 được thay thế bằng sY153. Một lý do cho sự
thay thế này là sY255 nằm rất gần sY254 trên vùng DAZ và chúng hay bị tổn thương cùng
nhau. Việc chọn sY153 có thể giúp phát hiện những mất đoạn nhỏ trên AZFc ở ngoài vùng
DAZ.
Như vậy, đề tài sử dụng 6 cặp mồi: sY86, sY127, sY254, sY84, sY134, sY153 nhằm
phát hiện mất đoạn trên các vùng AZFa, AZFb, AZFc. Cùng với đó, tiến hành chạy thêm với
cặp mồi SRY với vai trò là đối chứng dương nội tại.
Bảng 4: Trình tự 7 cặp mồi chạy Multiplex PCR [16]
STT
Kích
thước
STS Vị trí

Trình tự mồi
a1 472 bp SRY SRY F 5′-GAATATTCCCGCTCTCCGGA-3′

R
5′-GCTGGTGCTCCATTCTTGAG-3′
a2 320 bp sY86 AZFa
F
5-GTGACACACAGACTATGCTTC-3′

R
5′-ACACACAGAGGGACAACCCT-3
a3 274 bp sY127 AZFb
F
5′-GGCTCACAAACGAAAAGAAA-3′