ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN THỊ VIỆT HÀ
NGHIÊN CỨU ĐỨT ĐOẠN NHỎ NHIỄM SẮC THỂ Y
Ở NGƯỜI BỆNH VÔ SINH DO KHÔNG CÓ TINH TRÙNG
HOẶC ÍT TINH TRÙNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội- 2012
Ở NGƯỜI BỆNH VÔ SINH DO KHÔNG CÓ TINH TRÙNG
HOẶC ÍT TINH TRÙNG Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS.BS. TRẦN VĂN KHOA
Hà Nội- 2012
MỞ ĐẦU 8
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10
1.1. Vấn đề vô sinh và vô sinh ở nam giới 10
1.2. Các nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới 13
1.2.1 Phân loại nguyên nhân gây vô sinh nam giới 13
1.2.2 Nguyên nhân gây vô sinh nam giới do rối loạn di truyền ở mức độ NST14
1.2.3 Nguyên nhân gây vô sinh nam giới do mất đoạn trên vùng AZF của NST Y. 16
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 23
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 23
2.2.1 Phương pháp lập hồ sơ bệnh án 24
2.2.2 Phương pháp phân tích NST và lập nhiễm sắc thể đồ 24
2.2.3 Phương pháp phát hiện những mất đoạn vùng AZF của NSTY 25
2.2.4 Xử lý số liệu: Sử dụng phương pháp thống kê và tính tỷ lệ % 25
AZF 41
Bảng 3.10: Phân bố tỷ lệ bệnh nhân vô sinh nam giới mất đoạn theo từng STS nghiên
cứu 42
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 : Mô hình cấu trúc NST Y [16] 18
Hình 1.2: Phân loại mất đoạn trên vùng AZF [28] 19
Hình 3.1: Phân bố tỷ lệ nhiễm sắc thể đồ ở bệnh nhân vô sinh nam giới 28
Hình 3.2: Chu trình nhiệt chạy Multiplex PCR 38
Hình 3.3: Phân bố tỷ lệ bệnh nhân bị mất đoạn trên vùng AZF 40
Hình 3.4: Ảnh điện di của bệnh nhân không phát hiện mất đoạn ở các STS nghiên cứu
44
Hình 3.5: Ảnh điện di của bệnh nhân phát hiện mất đoạn ở sY84 45
Hình 3.6: Ảnh điện di của bệnh nhân phát hiện mất đoạn ở sY84 và sY86 45
Hình 3.7: Ảnh điện di của bệnh nhân phát hiện mất đoạn ở sY127 và sY134 46
Hình 3.8: Ảnh điện di của bệnh nhân phát hiện mất đoạn ở sY153 46
Hình 3.9: Ảnh điện di của bệnh nhân phát hiện mất đoạn ở sY254 và sY153 47
Hình 3.10: Ảnh điện di của bệnh nhân phát hiện mất đoạn ở sY84, sY134 và sY153
47
Hình 3.11: Ảnh điện di đơn mồi sY84 của bệnh nhân bước đầu xác định mất đoạn ở
sY84. 48
cứu đa trung tâm của Tổ chức y tế thế giới, gần 50% các trường hợp vô sinh có
nguyên nhân do nam giới [25]. Trong các nguyên nhân vô sinh do nam thấy có
khoảng 10%- 15% trường hợp không có tinh trùng (KCTT) và 5 % ít tinh trùng
(ITT) là do bất thường về mặt di truyền [10].
Việc chẩn đoán nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới là một trong những yêu
cầu bắt buộc trước khi tiến hành điều trị và hết sức cần thiết để thực hiện tư vấn di
truyền. Các kỹ thuật xét nghiệm tinh dịch đồ đã giúp phát hiện những trường hợp vô
sinh nam là do KCTT hoặc ITT. Tuy nhiên, nguyên nhân rối loạn vật chất di truyền
gây ra KCTT và ITT ở rất nhiều bệnh nhân vô sinh nam nhiều khi không được phát
hiện để giải quyết định hướng điều trị và tư vấn di truyền. Trong những năm gần đây,
di truyền học người là lĩnh vực phát triển mạnh và có rất nhiều thành tựu. Lĩnh vực
di truyền y học nghiên cứu ở cả hai mức độ tế bào và phân tử đã giúp cho các thầy
thuốc lâm sàng tìm hiểu thêm được những nguyên nhân KCTT hoặc ITT dẫn đến
vô sinh nam giới.
Bằng phương pháp nuôi cấy tế bào và kỹ thuật nhuộm tiêu bản nhiễm sắc thể
(NST), đặc biệt là kỹ thuật nhuộm băng ngày càng phát triển và cải biến không ngừng
đã giúp cho các nhà di truyền học phát hiện được các biểu hiện rối loạn số lượng và
cấu trúc NST. Với việc áp dụng phương pháp nhuộm NST đã giúp phát hiện hội
chứng Klinefelter là nguyên nhân hàng đầu gây ra vô sinh ở nam giới [53].
Bên cạnh đó, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán
nguyên nhân vô sinh ở nam giới do mất đoạn nhỏ (microdeletion) trên nhánh dài của
NST Y đang trở nên phổ biến trên thế giới. Mất đoạn nhỏ trên NST Y chủ yếu xảy ra
ở vùng AZF (azoospermia factor) trên nhánh dài của NST Y (Yq), là nơi có chứa
nhiều gen liên quan tới quá trình sinh tinh, được coi là nguyên nhân bất thường di
truyền thứ hai sau hội chứng Klinefelter gây vô sinh ở nam giới [53]. Phát hiện được
những mất đoạn trên NST Y sẽ cung cấp thêm bằng chứng và sự hiểu biết đầy đủ về
bất thường di truyền liên quan đến vô sinh nam giới [18]. Những hiểu biết này sẽ trợ
giúp cho việc chẩn đoán chính xác và điều trị, đặc biệt tư vấn cho những bệnh nhân
ITT áp dụng kỹ thuật vi tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (ICSI- Intra Cytoplasmic
Sperm Injection), vì những bệnh nhân có mất đoạn NST Y nếu điều trị ICSI thành
cặp vợ chồng:
-Vô sinh nguyên phát (vô sinh I) là vô sinh xảy ra ở các cặp vợ chồng chưa có
thai lần nào.
-Vô sinh thứ phát (vô sinh II) là vô sinh xảy ra ở các cặp vợ chồng đã có thai,
nhưng nay không thể mang thai trở lại sau một năm chung sống, sinh hoạt tình dục
không sử dụng bất kỳ biện pháp tránh thai nào.
Bên cạnh đó có nhiều nghiên cứu thống kê tỷ lệ vô sinh theo đối tượng gây vô
sinh: vô sinh do nam giới, vô sinh do nữ giới, vô sinh do cả nam và nữ. Nội dung đề
tài chỉ đề cập tới trường hợp vô sinh do nam giới. Vô sinh nam giới là trường hợp của
một cặp vợ chồng vô sinh mà nguyên nhân do người chồng, người vợ hoàn toàn bình
thường.
Theo WHO (1999) trong các nguyên nhân gây vô sinh nam giới thì có đến 90%
là do bất thường tinh trùng tức là có liên quan trực tiếp đến tinh dịch đồ [66]. Cho đến
nay, phương pháp chính xác để chẩn đoán vô sinh nam giới thường dựa trên kết quả
tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn của WHO, bao gồm các chỉ số về thể tích tinh dịch, mật
độ tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng di động, tỷ lệ tinh trùng bình thường Tiêu chuẩn thực
hiện và đánh giá của WHO hiện đang được áp dụng ở hầu hết các cơ sở xét nghiệm
tinh dịch trên thế giới.
Bảng 1.1: Tiêu chuẩn xét nghiệm tinh dịch đồ theo WHO [66]
Chỉ số
Giá trị bình thƣờng
Thể tích tinh dịch
≥ 2.0 ml
pH
≥ 7.2
Mật độ tinh trùng
≥20 x 10
6
tinh trùng/ ml
Tổng số tinh trùng
tinh, thường do tinh hoàn không sản xuất được tinh trùng. ITT (oligospermia) là tình
trạng số lượng tinh trùng ít hơn 20 triệu tinh trùng/ml tinh dịch. ITT mức độ nặng
(severe oligospermia): là tình trạng số lượng tinh trùng ít hơn 5– 6 triệu tinh trùng/ml
tinh dịch.
Dựa trên tiêu chuẩn của WHO (1999), nếu tinh dịch đồ bất thường phải xét
nghiệm lại lần thứ hai cách lần thứ nhất ít nhất hai tuần và xa nhất dưới ba tháng. Tuy
nhiên các chỉ số này có thể thay đổi tùy thời điểm lấy mẫu, kỹ thuật và tiêu chuẩn
đánh giá. Ngoài ra có những trường hợp các chỉ số cơ bản của tinh dịch đồ nằm trong
giới hạn bình thường nhưng người này vẫn vô sinh do suy giảm chức năng tinh trùng,
hoặc có những trường hợp không bình thường nhưng bệnh nhân nam vẫn có con bình
thường [66].
Vô sinh nam giới là một vấn đề sức khỏe sinh sản nghiêm trọng trên toàn thế
giới, theo nghiên cứu ở các nước phương Tây thì vô sinh nam giới chiếm tới 20%
[65]. Tại Pháp, tỷ lệ vô sinh chiếm 13,5% các cặp vợ chồng. Tại Mỹ (1995) có khoảng
10% số cặp vợ chồng vô sinh khi đang ở trong độ tuổi sinh đẻ [12].
Theo nghiên cứu của Ali Hellani, có khoảng 10- 15% cặp vợ chồng vô sinh,
nguyên nhân do nam giới chiếm 50% và khoảng 30-40% vô sinh nam giới không rõ
nguyên nhân [15].
Ở một nghiên cứu khác, Krauz và cộng sự cho rằng nguyên nhân gây vô sinh
nam giới chiếm khoảng 50%. Trong đó, khoảng 40-50% nam giới này vô sinh là do
bất thường về số lượng và chất lượng tinh trùng [33].
Theo nghiên cứu của D. Stewart Irvine (2002) thì vô sinh là một vấn đề phổ
biến thế giới, chiếm 14%- 17% ở các cặp vợ chồng, trong đó vấn đề vô sinh ở nam
giới khó được xác định [29]
Nhìn chung, theo các tác giả ở tùy từng nước, tỷ lệ vô sinh dao động từ 10%-
20% trong tổng số các cặp vợ chồng trong tuổi sinh đẻ.
Tại Việt Nam, theo một số công trình nghiên cứu thì tỷ lệ vô sinh có xu hướng
tăng. Điều tra dân số năm 1980, tỷ lệ này chỉ ở mức 7%-10%, năm 1982, tỷ lệ vô sinh
lên đến 13%, trong đó vô sinh nữ chiếm 54%, vô sinh nam chiếm 36%, và 10% vô
sinh không rõ nguyên nhân [8].
phụ, do miễn dịch,
Theo WHO (1999) [66] các nhóm nguyên nhân gây vô sinh nam giới gồm: rối
loạn về tình dục và phóng tinh, miễn dịch, bất thường tinh dịch, bệnh lí toàn thân, tổn
thương tinh hoàn mắc phải, do tắc nghẽn, không rõ nguyên nhân.
Dựa vào đặc điểm các nguyên nhân gây vô sinh ở nam có thể chia thành các
nhóm nguyên nhân chính sau:
-Nguyên nhân không di truyền:
+ Liên quan đến bất thường của cơ quan sinh dục: Giảm khả năng cung cấp
tinh trùng, xuất tinh trào ngược bàng quang, nghẽn tắc ở mào hay ống dẫn tinh, xơ hóa
nang, không thể xuất tinh, lỗ niệu đạo lạc chỗ, tinh trùng vận động kém, tinh trùng có
cấu trúc không bình thường, ảnh hưởng đến khả năng thụ tinh cho noãn, giãn tĩnh
mạch, không có tinh hoàn, suy tuyến sinh dục, tinh hoàn lạc chỗ.
+ Không liên quan tới bất thường cơ quan sinh dục. Do bệnh tật: Ung thư đang
được điều trị, tình trạng chấn thương, các bệnh tiểu đường, bệnh ở tuyến giáp trạng,
HIV/AIDS, hội chứng Cushing, thiếu máu, nhồi máu cơ tim, suy gan, suy thận… đều
ảnh hưởng xấu đến khả năng sinh sản, bệnh tự miễn dịch, nhiễm khuẩn, Stress, béo
phì, nghiện rượu, ma túy, thuốc lá hay tác động xấu của các yếu tố môi trường như
nhiệt độ, hóa chất
-Nguyên nhân di truyền:
+ Do rối loạn mức độ NST: hội chứng Klinefelter (47,XXY); 45,OY; nam giới
46,XX; rối loạn cấu trúc NST do chuyển đoạn Robertson,
+ Do rối loạn ở mức độ phân tử: mất đoạn nhỏ trên vùng AZF của NST Y.
+ Do một số nguyên nhân chưa xác định.
1.2.2 Nguyên nhân gây vô sinh nam giới do rối loạn di truyền ở mức độ NST
Bất thường di truyền nói chung và bất thường NST nói riêng được coi là một
trong những nguyên nhân gây ITT hoặc KCTT, đôi khi do không được chẩn đoán xác
định nên thường được xếp vào nhóm KCTT không rõ nguyên nhân.
Một loạt các bất thường về di truyền gây bất thường quá trình sinh tinh hậu quả
làm suy giảm khả năng sinh sản của nam giới. Theo 9 cuộc khảo sát trên 9.448 trường
hợp vô sinh nam không tinh trùng hoặc thiểu tinh cho thấy 5,75% trường hợp có bất
(%)
số các
trƣờng hợp
bất thƣờng
nst (%)
Koulischer L
[32]
1.00
0
27
(2,7)
6
(0,06)
33
(3,3)
Chandley
AC [21]
2.37
2
33
(1,4)
18
(0,7)
51
(2,1)
Abyholm T
[14]
356
24
(6,7)
Retief AE
[49]
496
25
(5,0)
10
(2,8)
35
(7,0)
Bourrouillou
G [20]
952
65
(6,8)
33
(3,4)
98
(10,3)
Bonduelle M
[60]
568
2
(0,35)
12
(2,1)
14
(2,4)
Tổng số
9.44
8
sản ở nam giới. Gen SRY nằm trên nhánh ngắn của NST Y đóng vai trò quan trọng
trong hình thành tuyến sinh dục thời kỳ phôi thai, bên cạnh đó NST Y còn chứa những
vùng điều hòa sự sinh tinh. Nhánh dài của NST Y là một bộ phận đặc biệt trên NST Y
mang gen có vai trò này.
Quá trình sinh tinh là một quá trình phức tạp kéo dài khoảng 70 ngày bao gồm
sự phát triển và biệt hóa liên tục của các tế bào dòng tinh. Trong giai đoạn đầu tiên,
các tinh nguyên bào phân chia gián phân liên tục để tạo ra các tinh bào một. Các tinh
bào một tiếp tục phân chia giảm phân lần thứ nhất để tạo ra tinh bào hai. Đến lượt
mình, các tinh bào hai phân chia giảm phân lần thứ hai để tạo ra các tinh tử dạng tròn. Sau
khi giảm phân hoàn thành, tinh tử sẽ được biệt hóa thành các tinh trùng với các đặc trưng:
thân được kéo dài ra, NST được nén gọn lại, histone được thay thế bằng protamine, bào
tương được loại bớt, đuôi được hình thành [5]. Việc phát hiện ra các gen điều khiển quá trình
sinh tinh trên NST Y đã mở ra một lĩnh vực nghiên cứu mới về quá trình sinh tinh.
Ngày nay, cấu trúc NST Y, trình tự cũng như số lượng gen trên NST Y đã được
làm sáng tỏ. Theo đó, NST Y có tổng kích thước là 60Mp, phần gen giả chiếm 3Mp,
còn lại 57Mp của vùng dị nhiễm sắc là nhiễm sắc thực, hầu hết các gen thuộc vùng
nhiễm sắc thực. Vùng nhiễm sắc thực có kích thước 23Mp bao gồm 8Mp phần vai
ngắn và 14.5Mp ở phần vai dài. Các trình tự thuộc vùng nhiễm sắc thực gồm có 3
nhóm: Nhóm thứ nhất là nhóm được chuyển vị từ NST X trong quá trình tiến hóa (X-
transposoned), nhóm thứ 2 là nhóm có trình tự tương đồng trên NST X (X –
degenrate) và nhóm thứ 3 là nhóm bao gồm các trình tự lặp lại phần đầu gần thuộc vai
ngắn của NST Y (Yp) và hầu hết phần vai dài Yq.
Tổn thương trên NST Y có thể gặp các loại: mất đoạn lớn, mất đoạn nhỏ và mất đoạn
một phần. Tổn thương mất đoạn lớn của NST Y liên quan tới nhiều gen. Ngoài ra, một kiểu
hình có thể gây ra bởi nhiều mất đoạn hoặc đột biến khác nhau, do đó khó xác định chính xác
nguyên nhân của một số kiểu hình vô sinh [10]
Tổn thương mất đoạn nhỏ trên NST Y là một nguyên nhân hay gặp của vô sinh
nam. Tổn thương mất đoạn nhỏ được định nghĩa là những mất đoạn NST trên vài gen
nhưng không đủ lớn để có thể phát hiện bằng phương pháp di truyền tế bào thông
thường [54].
chính xảy ra ở vùng AZF trên NST Y và kiểu hình tương ứng.
Hình 1.2: Phân loại mất đoạn trên vùng AZF [28]
Mất đoạn trên AZFa
Vùng AZFa nằm ở vị trí khoảng 5, nhánh dài và ở gần tâm NST Y, kích thước
của nó từ 1 đến 3Mp. Nhiều nhóm gen đã được xác định ở vùng này: DFFRY,
USP9Y, DBY, UTY, TB4Y, [33]. Mất đoạn nhỏ ở những gen riêng rẽ trên phân
vùng AZFa chủ yếu liên quan tới gen USP9Y (ubiquitin- specific protease 9 Y
chromosome) và gen DBY (Dead box on the Y) liên quan đến kiểu hình thay đổi của
tinh hoàn. Tổn thương cả hai gen sẽ dẫn tới hội chứng chỉ có tế bào Sertoli (SCOS),
biểu hiện bằng sự có mặt của tế bào Sertoli mà không có các tế bào dòng tinh trong
các ống sinh tinh và không có tinh trùng trong tinh dịch. Gen DBY được coi là có vai
trò đáng kể trong vô sinh vì nó có liên quan tới sự phát triển của tế bào dòng tinh
trước phân bào giảm nhiễm [63]. Lardone và cộng sự (2007) khi nghiên cứu hoạt động
sao mã của một số gen trên AZFa nhận thấy ở những bệnh nhân bị hội chứng SCO
hoạt động sao mã của gen DBY giảm trong khi các gen khác vẫn hoạt động bình
thường [37]. Gen USP9Y cũng liên quan đến quá trình sinh tinh. Gen USP9Y bị cắt
ngắn hoặc bị mất đoạn gây ra vô tinh, thiểu tinh nặng và tinh trùng giảm vận động
hoặc thiểu tinh. Nhưng dường như gen này chỉ liên quan tới hiệu quả quá trình sinh
tinh vì nó có thể được truyền cho thế hệ sau [43]. Tuy nhiên cần nhiều nghiên cứu hơn
nữa để làm sáng tỏ vai trò của mỗi gen trong quá trình sinh tinh.
Mất đoạn trên AZFb
Phân vùng AZFb nằm giữa khoảng 5 và 6, kích thước của nó từ 1 đến 3 Mp.
Có 5 nhóm gen được xác định ở vùng AZFb như: CDY, XKRY, SMCY, E1F- 1AY
và RBMY1Y [33].
Phân vùng AZFb có vai trò rất quan trọng đối với sự sinh sản, mất đoạn của
vùng này gây dừng quá trình sinh tinh tại giai đoạn tinh bào 1. Gen chủ yếu trên AZFb
là RBMY (RNA binding motif on the Y) có 6 bản sao. Đáng chú ý nhất là RBMY1,
gen này mã hóa cho một protein gắn RNA. Theo nghiên cứu của Lavery và cộng sự
(2007) biểu hiện của gen RBMY1 giảm ở các bệnh nhân vô tinh [38].
thiểu tinh tới vô tinh [48]. Thêm vào đó, một số nghiên cứu khác chỉ ra rằng sự biểu
hiện ở gen DAZ giảm ở những bệnh nhân vô tinh [38].
Mất đoạn tại AZFc gây ra nhiều kiểu hình, trong đó chủ yếu là kiểu hình có
liên quan tới lượng tinh trùng thấp do giảm quá trình sinh tinh. Theo Kudora-
Kawaguchi và cs (2001), mất đoạn tại AZFc là nguyên nhân gây ra khoảng 12% các
trường hợp vô tinh không do tắc nghẽn và 6% thiểu tinh nặng [34]. Nhiều bệnh nhân
nam bị mất đoạn AZFc vẫn có thể thụ tinh được nhờ kỹ thuật hỗ trợ sinh sản. Một số
nghiên cứu đã chứng minh rằng chỉ có vùng AZFa, AZFb là cần thiết cho quá trình
khởi động quá trình sinh tinh, nhưng nếu không có vùng AZFc thì quá trình sinh tinh
sẽ không thể kết thúc bình thường [26].
Hopp và cs đã chứng minh, đối với những mất đoạn trên AZFa, AZFb, AZFb/c
không có khả năng tách tinh trùng khi sử dụng kỹ thuật TESE. Trong khi đó, đối với
những mất đoạn trên AZFc khả năng tách tinh trùng từ tinh hoàn thành công lên đến
75% [27]. Tương đồng với những kết quả nghiên cứu trên, Krausz đã phát hiện 50%
xuất hiện tinh trùng ở trường hợp mất đoạn thuộc vùng AZFc và những mất đoạn
thuộc vùng AZFa, AZFb hiếm khi tách được tinh trùng từ tinh hoàn [33].
Những nghiên cứu chỉ ra, ICSI kết hợp cùng với kỹ thuật TESE có thể sử dụng
được ở những bệnh nhân KCTT nguyên nhân do mất đoạn nhỏ trên NST Y. Tuy nhiên
trước khi tiến hành kỹ thuật hỗ trợ sinh sản, các bệnh nhân vô tinh và thiểu tinh nặng
cần phải được kiểm tra mất đoạn nhỏ để có được các tư vấn di truyền phù hợp.
Trên thế giới có rất nhiều công trình khoa học và nghiên cứu về ảnh hướng của
vi mất đoạn NST Y và vô sinh ở nam giới từ những thập niên 70 của thế kỷ XX.
Tiepolo & Zuffardi (1976) đã công bố hình ảnh NST của 6 bệnh nhân nam bị tổn
thương, sự thiểu tinh nặng được chẩn đoán bằng sinh thiết tinh hoàn. Cả 6 bệnh nhân
nam giới vô sinh do bị mất đoạn ở nhánh dài của NST Y [58].
Sarah Girardi (1997) nghiên cứu ở Mỹ phát hiện tỷ lệ mất đoạn nhỏ NST Y là
7% ở những nam KCTT, 10% ở những nam giới có số lượng tinh trùng dưới 1
triệu/ml tinh dịch, 8% ở những nam giới có số lượng tinh trùng từ 1 đến dưới 5
triệu/ml tinh dịch [53].
Năm 2003, các kết quả nghiên cứu của F. Akbari Asbagh (Iran), Rima (Ấn
nghiên cứu mất đoạn nhỏ NST Y trên các trường hợp thiểu tinh và KCTT (từ đầu năm
2005). Kết quả, phát hiện 6 trường hợp mất đoạn trên tổng số 144 trường hợp khảo sát
[11].
Ở nghiên cứu của Nguyễn Đức Nhự (2009), bằng kỹ thuật PCR đơn mồi, với 3
cặp mồi đã phát hiện được 2/40 trường hợp (5%) có mất đoạn gen vùng AZFc: 1 ở
sY159, 1 ở sY277, không phát hiện trường hợp mất đoạn ở sY153 [9].
Các nghiên cứu về mất đoạn trên vùng AZF và ảnh hưởng của chúng tới các
bệnh nhân vô sinh nam giới sẽ góp phần nâng cao chất lượng, hiệu quả điều trị vô sinh
nam giới, vì vậy cần có nhiều nghiên cứu hơn nữa về vấn đề này.
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận văn là: 264 bệnh nhân vô sinh nam giới điều trị
tại Trung tâm công nghệ phôi- Học viện Quân y, Bệnh viện Nam học và hiếm muộn
Hà Nội trong thời gian từ 09/2010 đến 12/2011.
Tiêu chuẩn chọn mẫu nghiên cứu: chọn những bệnh nhân vô sinh nam giới đã
được xét nghiệm tinh dịch đồ và xác định là KCTT hoặc ITT, không thuộc nhóm tắc
nghẽn, dị dạng ống dẫn tinh. Các bệnh nhân này được xét nghiệm NST, lập nhiễm sắc
thể đồ. Bệnh nhân nào có kết luận nhiễm sắc thể đồ bình thường 46,XY sẽ được xét
nghiệm ADN để phát hiện những mất đoạn nhỏ trên vùng AZF của NST Y.
Phương pháp chọn mẫu của đề tài là chọn mẫu không xác suất.
Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 264 bệnh nhân vô sinh nam giới do KCTT hoặc ITT
được xét nghiệm NST, lập nhiễm sắc thể đồ tại Bộ môn Y sinh học- Di truyền, trường
Đại học Y Hà Nội, Bộ môn Sinh học- Di truyền y học, Học viện Quân y. Trong số 264
bệnh nhân được xét nghiệm chọn ra 248 bệnh nhân có kết luận nhiễm sắc thể đồ bình
thường 46,XY và không có bất thường về cơ quan sinh dục ngoài để tiến hành xét
nghiệm ADN nhằm kiểm tra và phát hiện các mất đoạn nhỏ trên vùng AZF của NST
giới tính Y.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
cuối chỉ giữ lại khoảng 0,5ml đối với mỗi mẫu.
Tiến hành nhỏ tiêu bản: Chuẩn bị lam kính sạch cho vào tủ lạnh 15 tới 30 giây
trước khi dùng. Yêu cầu nhỏ cao tay, lam kính để nghiêng một góc 45
0
. Nhỏ lần lượt
từng mẫu tránh nhầm lẫn.
Trước khi nhuộm yêu cầu tiêu bản phải được đặt trong tủ ấm 60
0
qua đêm.
Nhúng toàn bộ vùng tiêu bản có mẫu trong Trypsin 1:250 1X/PBS từ 30 giây tới 1
phút (chỉnh thời gian cho phù hợp với từng tiêu bản). Sau đó rửa ngay tiêu bản lại
bằng nước lạnh. Nhuộm bằng Giemsa từ 10 tới 20 phút. Rửa tiêu bản sau khi nhuộm
bằng nước cất và để khô.
Phân tích tiêu bản NST trên kính hiển vi và lập nhiễm sắc thể đồ bằng phần
mềm Ikaros.
2.2.3 Phương pháp phát hiện những mất đoạn vùng AZF của NSTY
Quy trình tách chiết ADN bao gồm các bước như sau:
Bước ly giải máu:
Tiến hành lấy 200µl mẫu máu ngoại vi của mỗi bệnh nhân vào từng tube 1,5ml
có đánh số thứ tự để tránh nhầm lẫn. Thêm 20µl proteinase K, 1µl RNase A và trộn
đều nhẹ nhàng. Sau đó thêm 200µl đệm BG trộn kĩ bằng mấy vortex và ủ mẫu ở nhiệt
độ 65
0
C trong thời gian 10 phút.
Bước gắn ADN:
Sử dụng máy ly tâm để Spin down dung dịch trong tube. Thêm 200µl đệm BB
và trộn nhẹ nhàng bằng pipet. Tiến hành spin down lần nữa. Sau đó chuyển toàn bộ
dịch sang cột lọc. Tiến hành ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Sau đó
bỏ dịch bên dưới cột lọc.
Bước rửa ADN:
nhất là 18 tuổi, cao nhất là 51 tuổi, tuổi trung bình của các bệnh nhân này là: 31,77 ±
5,96.
Bảng 3.1: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi
Tuổi
Số bệnh nhân
Tỷ lệ
≤ 24
19
7.20%
25- 29
93
35.23%
30- 34
85
32.20%
35- 39
33
12.50%
≥ 40
34
12.88%
Tổng
264
100%
Kết quả nghiên cứu cho thấy nhóm bệnh nhân vô sinh nam giới ở độ tuổi 25
đến 29 chiếm tỷ lệ cao nhất (35,23%), sau đó là nhóm tuổi 30 đến 34 (32,2%), nhóm
tuổi trên 40 đứng thứ 3, tiếp ngay sau đó là nhóm tuổi 35 đến 39, ít nhất là bệnh nhân
ở nhóm tuổi dưới 24.
Copyright: Tài liệu đại học ©