BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THOA NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỬ DỤNG KỸ THUẬT
REALTIME-PCR PHÁT HIỆN SACBROOD VIRUS
GÂY BỆNH TRÊN ONG MẬT TẠI HÀ NỘI
LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI



bất cứ công trình nào khác.
Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ trong việc thực hiện luận văn này
ñã ñược cám ơn và thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc.
TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Nguyễn Thị Thoa

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iii

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành bản luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực học hỏi của bản
thân tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ tận tình của các thầy cô giáo, gia ñình, bạn bè và
ñồng nghiệp.
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm
Hồng Thái - Bộ môn Côn trùng - Khoa Nông học - Trường ðại học Nông nghiệp
Hà Nội và TS. Nguyễn Văn Giang - Bộ môn Công nghệ Vi sinh - Khoa Công nghệ

MỞ ðẦU 1
Chương 1 ỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Tầm quan trọng của ngành ong 3
1.1.1 Thế giới 3
1.1.2 Việt Nam 4
1.1.3 Các loài ong ở Việt Nam 5
1.1 Các dịch bệnh chính ñược ghi nhận trên ong mật 6
1.2 Tình hình nghiên cứu về Sacbrood virus 7
1.2.1 Lịch sử phát hiện và tác hại của bệnh virus ấu trùng túi 7
1.2.2 Triệu chứng bệnh ấu trùng túi 8
1.2.3 Cách thức lan truyền của SBV 9
1.2.4 Tác nhân gây bệnh 9
1.3 Các kỹ thuật chẩn ñoán cổ ñiển 11
1.3.1 Kỹ thuật RIA (Radio Immuno Assay) 11
1.3.2 Kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 12
1.3.3 RT – PCR (Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction) 12
1.4 Kỹ thuật Realtime- PCR 13
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1 Thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 21
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
v

2.1.1 Thời gian 21
2.1.2 ðịa ñiểm 21
2.2 ðối tượng và vật liệu nghiên cứu 21
2.2.1 ðối tượng 21
2.2.2 Vật liệu nghiên cứu 21
2.3 Nội dung nghiên cứu 21
2.4 Phương pháp nghiên cứu 22
2.4.1 Thu thập mẫu ong 22

Sacbrood bằng Realtime – PCR 52
3.7.1 Tách chiết RNA mẫu Ong 52
3.7.2 Tiến hành phản ứng One step Reverse Transcription – PCR (RT
– PCR) 53
3.7.3 Tiến hành phản ứng Realtime – PCR 55
KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 56
1 Kết luận 56
2 ðề nghị 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO 57
PHỤ LỤC 60

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CSBV Chinese Sacbrood Virus (Virus gây bệnh ấu trùng túi Trung Quốc)
CP Concentration Point (ðiểm tập trung)
Ct Cycle Threshold (Chu kỳ ngưỡng)
DsRNA Double-stranded RNA (RNA mạch kép)
DWV Deformed Wing Virus ( Virus xoăn cánh ong)
ELISA Enzyme-Linked immunosorbent assay ( Phản ứng ELISA)
EU European Union ( Liên minh Châu Âu)
FAO Food and Agriculture Organization ( Tổ chức Nông lương)
IFA Indirect Fluorescent Antibody ( Kháng thể huỳnh quang gián tiếp)
KBV Kashmir Bee Virus ( Virus Kashmir)
M Marker
MRL Minimum Residue Limits (Dư lượng giới hạn tối thiểu)
ORF Open Reading Frame ( Khung ñọc mở)
OTC Oxytetracycline (Kháng sinh diệt khuẩn Oxytetracycline)

và SB11f - SB12r với các mẫu ong mật thu tại 11 huyện trên ñịa
bàn Hà Nội 36
3.5 Chất lượng RNA sau khi tách chiết bằng TRIzol-LS 37
3.6 ðỉnh nhiệt ñộ nóng chảy của 14 mẫu kiểm tra và ñối chứng 39
3.7 Ngưỡng chu kỳ sản phẩm RNA của SVB bắt ñầu nhân bản 39
3.8 Kết quả chẩn ñoán của hai phương pháp RT – PCRvà Realtime - PCR 43
3.9 Kết quả chẩn ñoán của Realtime - PCR 45
3.10 Kết quả Realtime – PCR của các mẫu pha loãng 46
3.11 Giá trị bước nhảy của ngưỡng chu kỳ khi pha loãng nông ñộ gốc 48
3.12 Kết quả Realtime – PCR của mẫu M50 pha loãng 48
3.13 Số lượng bản sao DNA/ µl và chu kỳ khuếch ñại (Yoo et al., 2012) 50
3.14 Giá trị ngưỡng chu kỳ của phản ứng Realtime- PCR ñối với các
ấu trùng ở ñàn ong thí nghiệm 51

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
ix

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.1 Biểu ñồ khuếch ñại vẽ lên các ñường biểu diễn khuếch ñại của
các mẫu thử và mẫu chuẩn 16
1.2 Biểu ñồ chuẩn ñường biểu diễn chuẩn mối quan hệ giữa số
lượng bản DNA ñích và chu kỳ ngưỡng tương ứng 17
2.1 Bánh tổ ong nội có biểu hiện bệnh ATT 22
2.2 Bánh tổ ong ngoại có biểu hiện của bệnh ATT 22
2.3 ðuôi ấu trùng hình túi nước 22
2.4 Ấu trùng có biểu hiện nhọn ñầu 22
2.5 Mẫu ong 24

3.12 ðường biểu diễn khuếch ñại của mẫu M50 pha loãng 49
3.13 ðường biểu diễn ñỉnh nóng chảy của mẫu M50 pha loãng 49
3.14 Biểu hiện bệnh tích của ấu trùng sau khi bị nhiễm SBV 50
3.15 Triệu chứng bệnh tích của virus ấu trùng túi 51
3.16 ðường cong khuếch ñại sản phẩm RNA virus 52

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
1

MỞ ðẦU

1. Tính cấp thiết của ñề tài
Việt Nam là quốc gia có khí hậu nhiệt ñới gió mùa, có nguồn hoa và nguồn
mật phong phú rất phù hợp cho phát triển nghề nuôi ong mật. Do ñó, nghề nuôi ong
lấy mật từ lâu ñã và ñang ñóng một vai trò quan trọng bởi nó không những mang lại
lợi nhuận kinh tế to lớn cho người nuôi ong mà còn cung cấp nhiều những ích lợi
trong xã hội cũng như với môi trường.
Tuy nhiên ong mật rất hay bị tấn công bởi một số loại bệnh do vi khuẩn và
nguy hiểm hơn cả là bệnh do virus, bởi vì bệnh do virus không thể ñiều trị bằng
thuốc kháng sinh ñược. Trong các bệnh virus trên ong thì bệnh ấu trùng túi là một
trong những bệnh virus nghiêm trọng nhất trên ong mật hiện nay. Virus này ñều
thuộc chi iflavirus, cùng có mặt ở khắp các lục ñịa và các nơi nuôi ong và gây thiệt
hại rất lớn cho người nuôi ong và ngành nuôi ong.
Sacbrood virus (SBV) gây bệnh chết ấu trùng ong và là 1 virus quan trọng
bậc nhất trên ong khắp thế giới kể cả Việt Nam. SBV nhiễm cả ong Apis mellifera
và Apis cerana (Phùng Hữu Chính 2008, Thái et al., 2011). Ấu trùng túi do
sacbrood virus gây ra, bệnh làm chết ấu trùng chủ yếu ở giai ñoạn sau vít nắp và
tiền nhộng. Khả năng lây nhiễm của virus là rất lớn, một ấu trùng bị chết có thể lây
nhiễm cho 3000 ấu trùng lành.
Mặt khác, việc xác ñịnh loại virus gây bệnh trên ong mật từ trước ñến này

3.1. Ý nghĩa khoa học
Bước ñầu ứng dụng kỹ thuật Realtime- PCR ñể phát hiện và ñịnh lượng SBV
phục vụ cho chẩn ñoán và theo dõi ñiều trị. ðộ ñặc hiệu của Realtime – PCR cao
hơn rất nhiều so với PCR cổ ñiển, cho ñộ chính xác cao và kết quả ñáng tin cậy.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Có thể phát hiện bệnh khi còn ở giai ñoạn tiềm ẩn, không mất thời gian ñiện
di ñể ñọc kết quả và phản ứng diễn ra trong hệ thống kín nên tránh ñược khả năng
ngoại nhiễm. Chính vì vậy mà rất cần thiết phát triển phương pháp này rộng rãi
trong lĩnh vực nông nghiệp như chẩn ñoán bệnh cây, bệnh côn trùng…

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tầm quan trọng của ngành ong
1.1.1. Thế giới
Ong mật có thể bị tấn công bởi rất nhiều yếu tố. Một vài yếu tố ñóng vai trò
như vector truyền bệnh cho ong mật. Bệnh có thể lây lan rộng rãi do sự nhập cư hay
do những người buôn bán kinh doanh ñàn ong và các thiết bị dùng trong nghề nuôi
ong. Ngày nay, do sự tăng trưởng phát triển về kinh tế mà các ñàn ong có thể ñược
vận chuyển ñến những nơi rất xa thậm chí là từ châu lục này ñến châu lục khác, do
ñó mà bệnh càng có cơ hội lây lan rộng hơn (FAO, 2006).
Virus gây bệnh trên ong mật (Apis mellifera) ñược nghiên cứu mạnh mẽ
trong suốt giai ñoạn cuối thập kỷ. Nhìn chung thì virus trên ong mật thường lây lan
rộng và hầu hết chúng không có biểu hiện bệnh tích rõ ràng (Allen and Ball, 1996;
Ball and Allen, 1991; Ball and Balley, 1997).
Bệnh Sacbrood trên ong ngoại (Apis mellifera) ñược phát hiện từ năm 1964
(Bailey et al., 1964). Tuy nhiên, ở A. cerana virus này ñược báo cáo lần ñầu tiên
vào năm 1976 ở Thailand. Do sự khác biệt về tính chất lý hóa và huyết thanh của

nào ñược thực hiện. Một cuộc ñiều tra dựa trên phương pháp RT – PCR ñược xuất
bản bởi Tentcheva et al. (2004) (ABPV, BQCV, CBPV, DWV, KBV) và
Grabensteiner et al. (2001) (SBV) ñã ñược thực hiện ở ðan Mạch chúng có thể là
những loại virus nguy hiểm bậc nhất châu Âu. Cuộc ñiều tra dựa trên mẫu ong của
những người nuôi ong với tỉ lệ chết cao bất thường vào mùa ñông hay có nghi ngờ
ñã nhiễm virus.
Sự xuất hiện, tỉ lệ lây nhiễm và sự phân bố của ABPV, BQCV, CBPV, DWV,
KBV, SBV ñã ñược ñiều tra ở 90 dòng ong ở Áo bị mắc những triệu chứng suy giảm
các cá thể trong ñàn ñột ngột, bại liệt…bằng cách sử dụng RT – PCR. Sự phá hoại
do ký sinh trùng cũng ñược ghi chép lại.
1.1.2. Việt Nam
Ở Việt Nam, không có nhiều những nghiên cứu về SBV trên A. mellifera
ñược xuất bản. Virus lây nhiễm trên ong mật chưa ñược xác ñịnh. Một vài nhà
nghiên cứu ở Việt Nam ñã có những ñiều tra sơ bộ ñể áp dụng chẩn ñoán bệnh lây
nhiễm trên ong mật như SBV (Lê Thanh Hòa et al., 2004; Phạm Hồng Thái et al.,
2011) bẳng sử dụng chẩn ñoán phân tử. Báo cáo “Chẩn ñoán phân tử của Sacbrood
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
5

virus và Deformed wing virus lây nhiễm trên ong mật ở miền Bắc Việt Nam” là báo
cáo ñầu tiên về bệnh SBV và DWV sử dụng RT – PCR làm công cụ chẩn ñoán dùng
mồi ñặc hiệu của ong mật ở một số tỉnh miền Bắc Việt Nam vào năm 2010.
Các kỹ thuật chẩn ñoán bằng sinh học phân tử hầu như ñược sử dụng còn rất
khiêm tốn trong công tác phát hiện sớm bệnh virus hại ong mật. Trong ñó Realtime
- PCR là kỹ thuật chẩn ñoán nhanh, chính xác và ñịnh lượng ñược nồng ñộ virus
vẫn chưa có nhiều công bố ở nước ta. Chính vì thiếu sự chẩn ñoán sớm nên không
ñưa ra ñược cách phòng trị tốt. Người nuôi ong thường không phân biệt ñược
nguyên nhân gây bệnh cho ong là gì nên ñã lạm dụng kháng sinh và gây tồn dư
kháng sinh trong mật ong.
1.1.3. Các loài ong ở Việt Nam

Một số loài chim ăn ong như chim xanh (Merops apiaster), chim én
(Cypselus spp), chim chèo bẻo (Dicurunus spp), nhện, thạch sùng, thằn lằn thường
bắt ong khi chúng ñi làm về. Vào mùa mưa thì các loài cóc, nhái thường xuất hiện
trước cửa tổ ong bắt ong. Các loài vật hại này với số lượng lớn thì sẽ làm giảm số
ong trong ñàn nhanh chóng.
Các côn trùng hại ong như sâu ăn sáp còn gọi là sâu phá bánh tổ (Galleria
mellonenlla, Achroia griselle), trưởng thành của sâu là một loài ngài thuộc họ ngài
ñêm (Noctuidae). Các loài kiến vồng (Oecophylla smaradina), kiến lửa (Solemy
spp), kiến ñen (Monomorium indicum)…. thường gây hại cho ong ở các vùng nhiệt
ñới, khi tấn công ñàn ong chúng ăn cả ấu trùng, nhộng, ong và mật. Ong bò vẽ (Vespa
orientalis) là loài phá ong cũng rất mạnh. Ngoài ra còn có chuồn chuồn cũng là côn
trùng ăn thịt phá hại ong. Khi bị tấn công mạnh thì ñàn ong có thể bốc bay bỏ tổ.
Một số trường hợp ñàn ong bị bệnh ngộ ñộc hóa học. Chất hóa học có thể là
thuốc bảo vệ thực vật, thuốc trừ cỏ, thuốc diệt côn trùng… mà ong bị dính phải khi
ñi làm hoặc thuốc ñược phun gần nơi ñặt ong. Khi bị ngộ ñộc ong chết với số lượng
lớn ngoài cửa tổ, một số bò dưới ñất, một số vừa nhảy vừa xoay. ðàn càng ñông thì
số lượng ong chết càng nhiều.
Các loài ve khí sinh của ong có chí lớn (Varroa jacobsoni) thuộc họ
Varroidac chủ yếu ký sinh trên nhông ong ñực, chí nhỏ (Tropilaelaps clareaes) chỉ
ký sinh trên ấu trùng, ve Neocypholaelaps indica Evans ăn phấn hoa …
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
7

Bệnh ỉa chảy nosema do một loài nguyên sinh ñộng vật gây ra có tên là
Nosema apis, bệnh này có thể chữa ñược bằng thay chúa và cho ong ăn kháng sinh.
Các bệnh gây hại trên ấu trùng do vi khuẩn có bệnh thối ấu trùng châu Âu và
thối ấu trùng châu Mỹ. Thối ấu trùng châu Âu (European floubrood) ñược phát hiện
ở châu Âu, do liên cầu khuẩn Melissococus pluton gây ra, và còn ñược gọi là thối ấu
trùng tuổi nhỏ. Bệnh xuất hiện cả ở A.mellifera và A.cerana. Biện pháp chữa trị là
thay chúa và sử dụng kháng sinh. Bệnh thối ấu trùng châu Mỹ do trực khuẩn

Chính và Vũ Văn Luyên, 1999). Năm 1981, Bailey ñã phân lập ñược chủng virus
gây bệnh trên ong A.cerana ở Thái Lan có ñặc tính sinh lý sinh hóa khác với
sacbrood trên A.mellifera và ông ñặt tên là Thai sacbrood virus (TSBV). Sau ñó,
TSBV lại gây dịch ở bang Bihar của Ấn ðộ vào năm 1979 và trong năm 1980 nó
ñã lan rộng từ ðông sang Tây ở miền Bắc nước này. Nepal từ năm 1981 tới
1984, TSBV ñã lây nhiễm ra khắp cả nước và làm thiệt hại tới 89% tổng số ñàn
ong Apis cerana của nước này. Ở Ấn ðộ, hàng triệu ñàn ong ñã bị mất do SBV chỉ
tính riêng năm1990 (Lê Quang Trung et al., 2009).
Ở Việt Nam, dịch bệnh do SBV gây nên sảy ra năm 1974 khi một số ñàn ong
cao sản của Viện ong Bắc Kinh ñược nhập về Hà Nội sau ñó ñã lan tràn ra toàn
miền Bắc và tiêu diệt 90% số ñàn ong. Dựa trên các triệu chứng lâm sàng, các kỹ thuật
viên của công ty ong, các chuyên gia bệnh trong nước và nước ngoài kết luận là bệnh ấu
trùng túi. Phải tới năm 1989 mới xác ñịnh chính xác sự có mặt của Thai sacbrood virus ở
nước ta (Phùng Hữu Chính 2008, Vũ Văn Luyện. 1999; Phạm Hồng Thái. 2004). Những
năm gần ñây, bệnh virus ấu trùng túi ñã làm giảm 40-80% năng suất mật ở A.mellifera
(Phùng Hữu Chính, 2008).
Chinese sacbrood là một virus phổ biến gây thiệt hại nghiêm trọng với nghề
nuôi ong Trung Quốc. ðây là bệnh gây hại lớn nhất cho ấu trùng ong nhưng cũng
có thể ảnh hưởng tới sức khỏe và hành vi của ong mật trưởng thành. Nó ñược quan
sát ñầu tiên ở tỉnh Guangdong năm 1972 và nhanh chóng lan ra toàn Trung Quốc và
các nước ðông nam á, dẫn ñầu phá hoại ngành công nghiệp ong ở các vùng này.
Các nhà khoa học Trung Quốc ñã xác ñịnh nguyên nhân gây bệnh là virus có tên
China sacbroodvirus, thuộc họ virus RNA nhỏ, picornaviridea (Zhang et al.2001)
1.2.2. Triệu chứng bệnh ấu trùng túi
Triệu chứng ñầu tiên là sự xuất hiện của các ấu trùng yếu hoặc chết. Ấu
trùng chết sớm sau khi ñạy nắp nhưng trước khi hóa nhộng. Ấu trùng chết có thể
ñược tìm thấy ở lỗ tổ ñã vít nắp và chưa vít nắp khi bệnh nặng. Bánh tổ bị bệnh, nắp
vít lỗ tổ lõm xuống, bị ong thợ cắn thủng, có ấu trùng nhọn ñầu nhô lên miệng lỗ tổ.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
9

chúng ăn hoặc gắp bỏ các ấu trùng bệnh, hàm, chân và lông dính virus, khi cho các
ấu trùng khoe ăn thì bệnh sẽ lan truyền. Bệnh lây nhiễm giữa các ñàn là do ong ăn
cướp mật, lấy chung nguồn thức ăn, ñặc biệt là nguồn phấn hoa, do người nuôi ong
nhập cầu ong từ ñàn bệnh vào ñàn khỏe….
1.2.4. Tác nhân gây bệnh
1.2.4.1. ðặc ñiểm của Sacbrood virus
Bộ gen của SBV ñược Ghosh và các cộng sự giải mã và công bố năm 1999. ðây
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
10

là bộ gen ñược giải trình tự hoàn thành ñầu tiên trong số các virus côn trùng.
Bộ gen của SBV gồm 8832 nucleotid là tập hợp của 8 over lapping ñã ñược
gửi ở Ngân hàng gen với mã AF092024. Bộ gen của SBV dài hơn bộ gen của
picornavirus của ñộng vật có vú ñiển hình (khoảng 7500 nucleotid) . Thành phần bazơ
là A (29.79%), C (16,35%), G (24,36%) và U (29,48%), như vậy SBV giống với các
picornavirus khác. Bộ gen bao gồm 1 sợi ñơn, cựu dương, cấu trúc dọc mở lớn (ORF)
mã hóa 1 polyprotein có 2858 amino axit, khối lượng phân tử 320698 Da. Vị trí bắt
ñầu dịch mã là mã AUG mã hóa ở nucleotid 179, và kết thúc ORF với 1 codon dừng
UAG ở nucleotide 8775. Sự phân tích này dự ñoán một vùng không dịch mã (UTR)-
5’- SBV của 178 nucleotide, ngắn hơn nhiều ñoạn ñược tìm thấy picornavirus ñộng
vật có vú ñiển hình (600-1250N). Trong khi ñó, UTR- 3 - SBV (80N) là vị trí tương
ñồng với nhiều picornavirus của ñộng vật có vú ñiển hình (40- 126 N).
So sánh trình tự với các polyprotein virus khác cho thấy các vùng tương
ñồng với helicase, protease và RNA-dependent RNA polymerase(RdRp= RNA –
phụ thuộc RNA polymerase) ñặc trưng. SBV cũng giống với các picornavirus ñiển
hình về cấu trúc mã hóa ở ñầu 5 và cấu trúc không mã hóa ở ñầu 3. Trong số nhiều
tác nhân picornavirus- like côn trùng, SBV giống với Infectious flacherie virus
(IFV), cả về chiều dài bộ gen và trật tự gen và cho thấy ñồng nhất 23.2% toàn bộ,
tương ñồng 45.4% trong chuỗi amino axit với virus này và tương ñồng ở vỏ protein.
Từ so sánh trình tự cấu trúc của IFV ñã phát hiện vị trí phân tách của chúng từ tiền

lượng miễn dịch phóng xạ RIA dựa trên tính ñặc hiệu cao của phản ứng miễn dịch,
trong ñó chất cần ñịnh lượng ñóng vai trò là kháng nguyên (KN) cùng với kháng
nguyên ñồng nhất về miễn dịch nhưng ñược ñánh dấu bằng ñồng vị phóng xạ
(KN*) liên kết với một kháng thể (KT) ñặc hiệu ñể tạo thành các phức hợp (KN*-
KT) và (KN-KT). Phương pháp ñịnh lượng miễn dịch phóng xạ là kỹ thuật có ñộ
nhạy và ñộ chính xác cao, có thể ñịnh lượng ñược các phân tử sinh học ở miền
nồng ñộ rất thấp cỡ 10
-9
nanogram, thậm chí tới 10
-12
picogram). Kỹ thuật ñánh dấu
phóng xạ tương ñối ñơn giản. Máy ño tia gamma không quá ñắt. Nhưng phương
pháp này sử dụng hoá chất phóng xạ nên phòng thí nghiệm cần phải ñược thiết kế
phù hợp ñể ñảm bảo các qui ñịnh về an toàn phóng xạ. Bên cạnh ñó ñồng vị phóng
xạ bị phân rã nên thời gian sử dụng thường bị hạn chế.
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
12

1.3.2. Kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) hay còn gọi là “Xét nghiệm
hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme”. Dựa trên sự kết hợp ñặc hiệu giữa kháng
nguyên và kháng thể, trong ñó kháng thể ñược gắn với một enzyme. Khi cho thêm
cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy
phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ ñã xảy ra phản
ứng ñặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường ñộ màu mà biết
ñược nồng ñộ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Phương pháp này ñược
thiết kế cho việc phát hiện và ñịnh lượng vật chất như peptides, protein, antibodies,
hormone,… Kỹ thuật này khá nhạy và ñơn giản, cho phép ta xác ñịnh kháng
nguyên hoặc kháng thể ở một nồng ñộ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kỹ thuật
miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn

nghiệm ñể ñọc và phân tích kết quả ñể xác ñịnh có sản phẩm khuếch ñại ñích hay
không vì kết quả cuối cùng của phản ứng khuếch ñại ñược hiển thị ngay sau khi
hoàn tất phản ứng khuếch ñại. ðây cũng chính là ưu ñiểm vượt trội hơn của
Realtime – PCR so với kỹ thuật PCR cổ ñiển, người làm thí nghiệm bỏ qua ñược
bước ñiện di ñọc kết quả, tiết kiệm ñược thời gian và tránh ñộc hại. Trong phản
ứng, khi có sự hiện diện của các sản phẩm DNA mạch ñôi do quá trình nhân bản thì
các tác nhân liên kết với DNA mạch ñôi như SYBR Green sẽ liên kết với các sản
phẩm vừa ñược tạo ra này và phát tín hiệu huỳnh quang mạnh mẽ hơn. Loại tác
nhân huỳnh quang này có thể sử dụng ñược cho mọi trình tự ñích nên chi phí sẽ
thấp nhưng ñộ ñặc hiệu của sản phẩm phải ñược kiểm tra chặt chẽ thông qua một
bước phân tích bổ sung sau khi phản ứng nhân bản kết thúc – phân tích ñường cong
nóng chảy (Melting curve analysis).
Trong Realtime – PCR, hiển thị cơ bản ñể người làm thí nghiệm có thể quan
sát ñược trong quá trình nhân bản DNA của các ống phản ứng là một biểu ñồ
khuếch ñại (Amlification…). Trên biểu ñồ khuếch ñại này người làm thí nghiệm sẽ
thấy từng ống phản ứng cường ñộ huỳnh quang mà máy ghi nhận ñược trong những
chu kỳ ñầu sẽ rất thấp và hầu như không thay ñổi. Nhưng khi số lượng bản sao của
DNA ñích ñạt ñến một ngưỡng nhất ñịnh thì ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ ñủ
cường ñộ ñể ñược máy ghi nhận và lúc này ñường biểu diễn khuếch ñại bắt ñầu
ngóc lên. Cường ñộ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này trở ñi sẽ tăng gấp
ñôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lượng bản sao của DNA ñích tăng gấp ñôi sau mỗi
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
14

chu kỳ. Cường ñộ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽ tăng trưởng ñến một mức ñộ
nào ñó rồi ñạt ñến mức “bình nguyên”.
Một thông số hết sức quan trọng khi phân tích một ñường biểu diễn khuếch
ñại ñó là chu kỳ ngưỡng (Cycle threshold – Ct). Chu kỳ ngưỡng (Ct) là chu kỳ nhiệt
mà ở tại thời ñiểm này thiết bị real-time ghi nhận ñược tín hiệu huỳnh quang phát ra
từ ống phản ứng bắt ñầu vượt qua cường ñộ huỳnh quang nền. Trong thí nghiệm sẽ