ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
[\

BÙI HOÀNG BẢO NGỌC

XÂY DỰNG CÁC THỬ NGHIỆM MIỄN DỊCH
PHÁT HIỆN PROTEIN E7 CỦA
HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 18
CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN
MÃ SỐ: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

viii

LỜI MỞ ĐẦU

Nếu như cứ mỗi 3 phút có 1 người trên thế giới chết vì ung thư phổi thì cứ
mỗi 2 phút có 1 phụ nữ chết vì ung thư cổ tử cung. Ở Mỹ, trong năm 2009 ước tính
có khoảng 12.000 phụ nữ mắc ung thư cổ tử cung. Với tỉ lệ 26 ca trên 100.000 phụ
nữ, ung thư cổ tử cung đã trở thành nguyên nhân ung thư gây tử vong hàng đầu cho
phụ nữ ở Việt Nam cũng như
các nước đang phát triển.
Khuyến cáo ung thư cổ tử cung năm 2009 đã xác định phòng ngừa là chìa
khóa then chốt trong cuộc chiến chống căn bệnh này. Do đó, một phương pháp tầm
soát hiệu quả căn bệnh này sẽ giúp ngăn ngừa và giảm tỉ lệ tử vong do nó gây ra.
Khoảng 95 % các trường hợp ung thư cổ tử cung là có liên quan đến Human
papillomavirus (HPV). Nhiều nghiên cứu đã cho thấy có mối liên hệ mật thiế
t giữa
việc nhiễm lâu dài một số chủng “có nguy cơ cao”, đặc biệt là HPV type 16 và HPV
type 18, với khả năng phát triển bệnh ung thư cổ tử cung. Do đó, dựa vào mối quan
hệ này, ta có thể phát triển các phương pháp chẩn đoán để phát hiện sớm khả năng
gây ung thư của HPV, từ đó đưa ra các phương pháp điều trị hiệu quả.
Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành xây dựng các công cụ
miễn dịch dựa trên
kháng thể đơn dòng nhằm phát hiện protein E7 HPV 18, là một protein gây ung thư
(oncoprotein) đóng vai trò quan trọng trong cơ chế phát sinh ung thư của HPV. Các
công cụ chẩn đoán này sẽ góp phần hoàn thiện công tác phòng ngừa và điều trị ung
thư cổ tử cung ở Việt Nam và trên thế giới.

Danh mục các bảng
vii


PCR : Polymerase chain reaction
PFA : Paraformaldehyde
PLL : Poly – L – lysine
pRB : Retinoblastoma tumor suppressor protein
STD : Standard deviation
URR : Upstream regulatory region
UTCTC : Ung thư cổ tử cung

Danh mục các hình và đồ thị
v

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Trang

Hình 1.1. Cấu trúc bộ gene của HPV 3

Hình 1.2. Cấu trúc của protein E7 5
Hình 1.3. Tác động của protein E7 lên các quá trình nội bào 6
Hình 1.4. Hệ thống phát hiện trực tiếp 13
Hình 1.5. Hệ thống avidin-biotin. 13
Hình 1.6. Hệ thống polymer – kháng thể thứ cấp – enzyme 14
Hình 1.7. ELISA và immuno PCR. Nguyên lý và độ nhạy của hai phương pháp 15
Hình 1.8. Immuno-PCR cổ điển, sử dụng protein lai giữa protein A và streptavidin
17

Hình 1.9. Immuno-PCR phổ biến. 18
Hình 1.10. Sơ đồ mô tả đoạn DNA marker được gắn cộng hợp vào kháng thể. 19
Hình 1.11. Immuno-PCR trực tiếp. 20
Hình 1.12. Immuno-PCR sử dụng các hạt từ phủ kháng thể 21
Hình 1.13. Immuno-PCR sử dụng “bio-barcode” 21

xử lý theo phương pháp ly tâm và trải lên. 47

Hình 3.8. Lai hóa tế bào miễn dịch trên các mẫu tế bào dịch phết cổ tử cung 49
Hình 3.9. Mô hình kĩ thuật immuno-PCR và ELISA sử dụng trong đề tài. 50
Hình 3.10. Đồ thị xác định hằng số ái lực của KTĐD 4H5-biotin với kháng nguyên
E7 HPV 18 tái tổ hợp tinh sạch. 53

Hình 3.11. PCR tạo DNA đánh dấu biotin. 54
Hình 3.12. Đồ thị khảo sát nồng độ kháng thể “bắt giữ” 1D5 55
Hình 3.13. Đồ thị khảo sát nồng độ kháng thể “phát hiện” 4H5-biotin 56
Hình 3.14. Đồ thị khảo sát nồng độ STV-AP 57
Hình 3.15. Tối ưu hóa nồng độ DNA đánh dấu biotin sử dụng cho immuno-PCR. . 58
Hình 3.16. Tối ưu hóa nồng độ streptavidin sử dụng cho immuno-PCR. 59
Hình 3.17. Tối ưu hóa tác nhân khóa giếng. 60
Hình 3.18. Kết quả immuno-PCR với protein E7 HPV 18 tái tổ hợp 61
Phần 1: Tổng quan tài liệu

1

1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. UNG THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMAVIRUS
1.1.1. Ung thư cổ tử cung
Trên thế giới, ung thư cổ tử cung (UTCTC) chiếm khoảng 12 % các ca ung
thư ở phụ nữ, trở thành căn bệnh phổ biến thứ hai ở phụ nữ sau ung thư vú và phổ
biến nhất ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam [67]. Theo thống kê của
tổ chức Y tế
thế giới (WHO), năm 2005 toàn cầu có khoảng 260.000 phụ nữ chết vì
căn bệnh này, 95 % trong số đó là ở các nước đang phát triển [68]. Tỉ lệ mắc bệnh
cao nhất là ở các vùng cận Sahara Châu Phi, quần đảo Melanesia, Mỹ Latinh,
Caribê, Nam Á và Đông Nam Á [49]. Việt Nam là một nước đang phát triển nên tỉ

1.1.2.2. Phân loại HPV
Human papillomavirus (HPV) thuộc họ Papillomaviridae, là nhóm virus gây
ra nhiều dạng tổn thương biểu mô khác nhau ở người. Hiện đã có hơn 200 type
HPV được xác định dựa trên phân tích trình tự DNA. Trong đó có hơn 96 type đã
được giải trình tự đầy đủ và ít nhất 100 type được giải trình t
ự một phần [23], [31].
Dựa vào sự liên quan của type HPV với mức độ tổn thương cổ tử cung và
khả năng phát triển thành ung thư người ta chia các type xâm nhiễm vào biểu mô cổ
tử cung thành ba nhóm nhỏ [14], [62], [69]:
- Nhóm “có nguy cơ thấp” (low risk HPV): gồm các type 6, 11, 40, 42, 43, 44,
54, 61, 70, 72, 81, 89; trong đó phổ biến nhất là HPV 6 và HPV 11. Nhóm HPV có
nguy cơ thấp thường liên quan tới các mụn nhọt sinh dục hoặc các tổn thương biểu
mô tế bào vảy mức độ nhẹ, nhưng hiếm khi gây ra ung thư xâm lấn.
- Nhóm “có nguy cơ cao” (high risk HPV): gồm các type 16, 18, 31, 33, 35,
39, 45, 51, 52, 56, 58, 59; lây truyền qua đường tiếp xúc tình dục. Nếu nhiễm lâu
dài các type HPV thuộc nhóm này sẽ có nguy cơ mắc UTCTC rất cao. HPV 16 và
HPV 18 chịu trách nhiệm cho hơn 70 % các ca UTCTC trên toàn thế giới.
- Nhóm “có nguy cơ trung gian” (intermediate HPV): gồm các type 26, 53, 66,
68, 73, 82. Nhóm này có liên quan đến các tổn thương biểu mô mức độ cao nhưng
hiếm khi tìm thấy trong các trường hợp ung thư xâm lấn. Trường hợp HPV 53 lại
thường xuyên được tìm thấ
y trong các phụ nữ không mắc ung thư.

1.1.2.3. Đặc điểm của HPV
HPV là dạng virus cổ, không có màng bao, đường kính khoảng 55 nm, có
DNA mạch đôi dạng vòng, kích thước khoảng 8.000 cặp base. HPV có 8 gene – hay
là khung đọc mở (open reading frame – ORF) – mã hóa cho các protein chức năng
Phần 1: Tổng quan tài liệu

3

với DNA của tế bào chủ và nhân đôi như dạng episome hoặc plasmid. Ngược lại,
trong các tổn thương ác tính liên quan tới HPV 16 và HPV 18 thì DNA virus lại
thường sát nhập vào bộ gene của tế bào chủ.
Để có thể sáp nhập vào bộ gene tế bào ch
ủ thì phải xảy ra một sự đứt gãy
trên bộ gene virus, thường là ở vùng E1/E2. Sự đứt gãy này dẫn tới việc mất chức
năng của gene E1 và E2, từ đó mất kiểm soát sự biểu hiện của E6 và E7, làm cho tế
bào bị biến đổi. Vị trí sát nhập vào bộ gene tế bào chủ khá ngẫu nhiên và dường như
không có vai trò nhiều trong quá trình phát sinh ung thư.
Hoạt tính gây ung thư của E6 và E7 chủ yếu là do khả năng tương tác v
ới các
protein nội bào có vai trò điều hòa kiểm soát chu trình tế bào như p53 và pRB. Hai
protein này được biết như là các protein ức chế khối u vì nó ức chế sự phân chia và
tăng trưởng của tế bào. Việc E6 gắn lên p53 và E7 gắn lên pRB dẫn đến sự phân
hủy hai protein này, làm mất chức năng kiểm soát sự tăng trưởng tế bào của chúng
và gây phát sinh ung thư [11].

1.2. PROTEIN E7 CỦA HPV VÀ UTCTC
1.2.1. Cấu trúc
Protein E7 là một polypeptid nhỏ, có tính acid, gồm khoảng 100 amino acid.
E7 có 3 vùng bả
o tồn (CR) là vùng CR1 ở đầu NH
2
, vùng CR2 ở giữa và vùng CR3
ở đầu COOH [13].
Vùng CR1 và CR2 của E7 cho thấy sự tương đồng trình tự với một phần
vùng CR1 và toàn bộ vùng CR2 của adenovirus E1A. Cũng giống như ở E1A, hai
vùng bảo tồn này đóng vai trò rất quan trọng trong hoạt động gây ung thư của E7 ở
các type HPV có nguy cơ cao [40]. Vùng CR1 cần thiết cho hoạt động biến đổi tế
bào và phân hủy pRB (retinoblastoma tumor suppressor protein) nhưng lại không


CR3
Hình 1.2. Cấu trúc của protein E7 [40]
Phần 1: Tổng quan tài liệu

6

và p130 thông qua motif LXCLE trên CR2, để kích thích tế bào tiến vào pha S.
Trong tế bào bình thường, các pRB được phosphoryl hóa vào giai đoạn sớm của pha
G1 và gắn với nhân tố phiên mã E2F - một tác nhân điều hòa quan trọng cho quá
trình tế bào thóat khỏi pha G1 và tiến vào pha S – hình thành một phức hợp ức chế
phiên mã. Bằng cách gắn vào và cảm ứng sự phân hủy pRB thông qua cơ chế hình
thành các phức hợp ly giải protein (proteosomal), E7 ngăn cản pRB liên kết với
E2F. E2F tự do sẽ hoạt động như một nhân tố
tăng cường phiên mã, kích thích tế
bào vượt qua pha G1 và tiến vào pha S, từ đó tăng sinh một cách không kiểm soát.
Protein E7 của các type HPV có nguy cơ thấp có khả năng gắn với pRB giảm gấp
10 lần so với E7 của các type HPV có nguy cơ cao. Điều này là do sai khác một
amino acid (ví dụ như aspartate ở vị trí thứ 21 trên E7 HPV 16 thay vì glycine ở vị
trí 22 trên E7 HPV 6) và amino acid này là vị trí quyết định cho việc gắn pRB và
khả năng làm biến đổi tế bào của E7 [13], [40].
Ngoài khả năng gắn và phân hủy pRB, các protein E7 của các type HPV có
nguy cơ cao còn can thiệp vào chu trình phân bào bình thường bằng nhiều cơ chế
khác như tương tác và làm dừng hoạt tính ức chế tăng trưởng của các chất ức chế
kinase phụ thuộc cyclin (cyclin-dependent kinase inhibitors – CKI) p21 và p27. Các
tương tác này làm gia tăng lượng cyclin E và A, từ đó dẫn đến tình trạng duy trì
tổng hợp DNA trong các tế bào biểu mô đã biệt hóa [40].
Hình 1.3. Tác động của protein E7 lên các quá trình nội bào [42]
Phần 1: Tổng quan tài liệu



1.2.2.3. Gây mất tính ổn định của bộ gene
Việc biểu hiện E7 trong tế bào chủ làm cho bộ gene bị mất tính bền vững.
Bằng cách gia tăng lượng trung thể, E7 còn gây ra tình trạng số nhiễm sắc thể của tế
Phần 1: Tổng quan tài liệu

8

bào không còn là bội số của bộ đơn bội, góp phần vào quá trình phát sinh ung thư
[13].
Protein E7 có thể làm mất sự ổn định của bộ gene thông qua việc cảm ứng sự
phá hủy DNA và hoạt hóa con đường ATM-ATR. Sự mất tính ổn định bộ gene do
E7 gây ra sẽ làm gia tăng khả năng sát nhập DNA virus vào bộ gene của tế bào chủ,
từ đó tăng khả năng chuyển dạng tế bào và phát sinh ung thư [42].

1.3. CÁC PH
ƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN UTCTC
1.3.1. Các phương pháp dựa trên cơ sở tế bào học
1.3.1.1. Xét nghiệm Pap (Pap smear)
Xét nghiệm Pap, hay còn được gọi là phết tế bào âm đạo - cổ tử cung, được
phát triển từ những năm 1930 bởi một bác sĩ người Hy Lạp là George Papanicolaou.
Đây là một xét nghiệm tế bào học dùng để phát hiện các bất thường trong tế bào cổ
tử cung [29].
Phương pháp này hiện nay vẫn là phương pháp đầu tiên dùng để
phát hiện
ung thư có liên quan đến các type HPV có nguy cơ cao. Các chương trình tầm soát
dựa trên phương pháp này đã góp phần làm giảm một nửa đến hai phần ba tỉ lệ mắc
UTCTC và tử vong do bệnh này và thậm chí giảm tới 90 % ở những nơi có các
chương trình tầm soát tốt [15].
Tuy nhiên, do tính chủ quan của các tiêu chuẩn xét nghiệm nên phương pháp

huyết thanh, kháng thể kháng HPV còn có thể được tìm thấy trong dịch âm đạo
hoặc buồng trứng.
Các phương pháp phát hiện kháng thể thường nhắm vào kháng thể kháng
protein vỏ capsid L1 như các nghiên cứu của Sehr và cộng sự (2002) [58]. Tuy
nhiên, thử nghiệm ELISA dựa trên VLP để phát hiện kháng thể kháng L1 không thể
giúp phân biệt được việc nhiễm HPV là hiện tại hay trong quá khứ. Các thử nghiệm
nhằm phát hiện kháng thể kháng E6 và E7 cũng đang được phát triển [48].

1.3.2.2. Phát hiện các protein virus
Các protein gây ung thư của HPV hầu hết đều đã được phát hiện bằng
phương pháp nhuộm miễn dịch mẫu tế bào hoặc mẫu mô bệnh phẩm bằng các
kháng thể đơn dòng và đa dòng. Các phương pháp hóa tế bào và hóa mô miễn dịch
dùng để phát hiện E6 và E7 trong giai đoạn đầu của ung thư đang được nghiên cứu
phát tri
ển để trở thành các xét nghiệm nhanh dùng trong chẩn đoán [48]. Ngoài ra,
Phần 1: Tổng quan tài liệu

10

có các công trình như của Selvey và cộng sự (1992) xây dựng quy trình ELISA phát
hiện E7 HPV 16 và 18 trong các dòng tế bào nuôi cấy [59], công trình của
Frazer và cộng sự (1995) xây dựng các thử nghiệm miễn dịch để phát hiện UTCTC
[25], công trình của Roger và cộng sự (2006) phát triển một que thử miễn dịch để
phát hiện E6 HPV 16 [55].

1.4. KĨ THUẬT HÓA TẾ BÀO MIỄN DỊCH (IMMUNOCYTOCHEMISTRY)
1.4.1. Khái niệm
Kĩ thuật hóa tế bào miễn dịch là sự kết hợp giữa phả
n ứng miễn dịch của
kháng nguyên – kháng thể và phản ứng hóa học để phát hiện một protein mục tiêu

ện nay. Tác nhân hóa học sử dụng để cố
định sẽ tạo các liên kết chéo với các gốc hoạt động trên protein, lipid, giữ chúng ở
nguyên vị trí ban đầu trong tế bào. Tuy nhiên, quá trình cố định quá mức sẽ tạo nên
một mạng lưới liên kết phân tử, ngăn chặn sự thâm nhập của kháng thể vào tế bào.
Tác nhân cố định chủ yếu sử dụng nhất trong lĩnh vực mô học hiện nay là
paraformaldehyde [16].
Đối vớ
i các mẫu dịch phết tế bào, tác nhân cố định thường được sử dụng là
ethanol 95 %. Ethanol cho hiệu quả cố định tốt đối với hầu hết các loại kháng
nguyên khác nhau [12].

1.4.2.2. Bộc lộ kháng nguyên (Antigen retrieval)
Quá trình cố định mẫu làm thay đổi cấu trúc bậc bốn của kháng nguyên, có
thể làm mất đi khả năng nhận biết đặc hiệu của kháng thể đối với kháng nguyên.
Quá trình bộc lộ
kháng nguyên cho phép hồi phục lại các biến đổi xảy ra trong quá
trình cố định, giúp trả lại cấu hình ban đầu của kháng nguyên. Sự cần thiết của việc
tiến hành bộc lộ kháng nguyên không chỉ phụ thuộc vào loại kháng nguyên mục
tiêu mà còn phụ thuộc vào kháng thể sử dụng. Các kháng thể đa dòng thường vẫn
duy trì được khả năng nhận biết kháng nguyên mục tiêu mà không cần xử lý bộc lộ
kháng nguyên [51].
Có nhiều phươ
ng pháp bộc lộ kháng nguyên khác nhau:
- Sử dụng enzyme phân giải: các protease thường được sử dụng là trypsin,
proteinase K, pronase, ficin và pepsin. Phương pháp này làm phân giải các protein,
tuy nhiên hoạt tính này là không đặc hiệu và có thể làm ảnh hưởng tới kháng
Phần 1: Tổng quan tài liệu

12


 Hệ thống phát hiện trực tiếp
Đây là dạng phát hiện đơn giản nhất được ứng dụng trong hóa tế bào miễn
dịch. Trong hệ thống phát hiện này, phân tử đánh dấu được gắn trực tiếp lên kháng
thể sơ cấp, phản ứng chỉ xảy ra một bước. Phươ
ng pháp này tiến hành nhanh chóng
nhưng độ nhạy không cao.
Phần 1: Tổng quan tài liệu

13

Hình 1.4. Hệ thống phát hiện trực tiếp [12]

 Hệ thống phát hiện gián tiếp
Hệ thống này cho phép tăng độ nhạy của phương pháp phát hiện, sử dụng
kháng thể sơ cấp không đánh dấu và kháng thể thứ cấp kháng kháng thể sơ cấp
đánh dấu. Có nhiều dạng biến đổi khác nhau của hệ thống gián tiếp:
- Hệ thống avidin – biotin: tận dụng tương tác
đặc hiệu giữa
avidin/streptavidin và biotin. Có hai hệ thống phổ biến nhất đang được sử dụng là
hệ thống ABC và LAB hoặc LSAB. Trong hệ thống ABC, kháng thể thứ cấp được
đánh dấu biotin và sẽ được phát hiện bởi avidin và phức hợp biotin gắn cộng hợp
với enzyme. Còn với hệ thống LAB hay LSAB thì kháng thể thứ cấp đánh dấu
biotin sẽ được phát hiện bởi phức hợp avidin/streptavidin gắn cộ
ng hợp với enzyme.
Hệ phát hiện này cho phép tăng độ nhạy của phản ứng nhưng lại có tín hiệu nền
cao.
Hình 1.5. Hệ thống avidin-biotin. (a) ABC, (b) LAB hoặc LSAB [12]

Phần 1: Tổng quan tài liệu



protein p16
ink4a
và Ki-67 trong dịch phết và mẫu sinh thiết cổ tử cung để phát triển
các phương pháp chẩn đoán UTCTC [34], [57], [66].

1.5. KĨ THUẬT IMMUNO-PCR
1.5.1. Khái niệm
Kĩ thuật immuo-PCR được giới thiệu đầu tiên bởi Sano và cộng sự vào năm
1992 [56]. Đây là kĩ thuật kết hợp giữa ELISA (Enzyme-linked immunosorbent
assay) và PCR (Polymerase chain reaction), tận dụng độ đặc hiệu của tương tác
kháng nguyên – kháng thể trong ELISA và độ nhạy của phản ứng PCR để t
ạo ra
một công cụ cho phép phát hiện các protein hiện diện ở nồng độ rất thấp trong mẫu.
Immuno-PCR có độ nhạy so với ELISA truyền thống hơn từ 100 – 10.000
lần. Từ khi ra đời đến nay, immuno-PCR ngày càng được phát triển thành một công
cụ có khả năng ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu miễn dịch cơ bản cũng như
ứng dụng [38], [44].

Hình 1.7. ELISA và immuno PCR. Nguyên lý và độ nhạy của hai phương pháp
[44]

1.5.2.
Nguyên lý
Immuno-PCR gồm 2 bước cơ bản:
- Phản ứng miễn dịch: cho phép phát hiện protein mục tiêu trong mẫu thông
qua tương tác kháng nguyên – kháng thể. Bước này tương tự như ELISA, có thể là
dạng trực tiếp (mẫu có kháng nguyên mục tiêu được phủ trực tiếp lên giếng) hoặc
Phần 1: Tổng quan tài liệu


tương tác của STV với biotin. Sano và cộng sự (1992) đã ứng dụng dạng immuno-
PCR này để phát hiện protein BSA (bovine serum albumin) cố định trực tiếp trên
giếng với độ nhạy đạt được là 9,6x10
-22
mol [56].
Phần 1: Tổng quan tài liệu

17

Tuy nhiên, phương pháp này bộc lộ một số nhược điểm: do khả năng tương
tác không đặc hiệu với tất cả kháng thể của protein A nên không thể ứng dụng trong
các dạng immuno-PCR “kẹp chả” sử dụng thêm một kháng thể “bắt giữ” phủ sẵn
trên giếng. Đồng thời, protein lai protein A – STV này không dễ dàng chế tạo được
nên rất khó được ứng dụng rộng rãi [4], [38].
Hình 1.8. Immuno-PCR cổ điển, s
ử dụng protein lai giữa protein A và
streptavidin [4]

1.5.3.2. Immuno-PCR phổ biến
Đây là dạng immuno-PCR được ứng dụng rộng rãi nhất trong các nghiên
cứu, được mô tả đầu tiên bởi Zhou và cộng sự (1993) [70], dựa trên khả năng tự
hình thành phức hợp giữa DNA đánh dấu biotin, STV và phức hợp kháng thể đánh
dấu biotin – kháng nguyên mục tiêu.
Dạng immuno-PCR này cho phép ứng dụng trong phát hiện trực tiếp và gián
tiếp. Các thành phần trong phản ứng có thể tiế
p cận dễ dàng. STV đã được chứng
minh là ít có ái lực không đặc hiệu với các protein ngoại lai hơn so với avidin, giúp
giảm tín hiệu nền của phản ứng. Các kháng thể đánh dấu biotin được thương mại
hóa khá nhiều, và cũng có thể được tự chuẩn bị một cách dễ dàng tại phòng thí
nghiệm bằng cách sử dụng các kit biotin hóa. Đoạn DNA marker đánh đánh dấu