ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LÊ THỊ PHƯƠNG TÚ
KHẢO SÁT TÌNH HÌNH MANG VI KHUẨN
NON-TYPHI SALMONELLA KHÔNG TRIỆU CHỨNG
TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Chuyên ngành: DI TRUYỀN
Mã số: 60.42.70
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. STEPHEN BAKER
Thành phố Hồ Chí Minh - 2011
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tiến sĩ Stephen Baker, người
trực tiếp hướng dẫn đề tài cũng như đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn
thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn chị Minh, Viện, Ánh, Nga đã dành thời gian đọc
và góp ý, chỉnh sửa cho luận văn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Corinne
Thompson và chị My đã hỗ trợ tôi trong phần phân tích kết quả. Xin cảm ơn các
anh chị trong phòng thí nghiệm vi sinh của đơn vị nghiên cứu lâm sàng đại học
Oxford đã tận tình chỉ dạy tôi những thao tác vi sinh cơ bản và giúp đỡ tôi trong
thời gian làm đề tài.
Xin cảm ơn các anh chị bạn đồng nghiệp ở OUCRU, đặc biệt là Nhã Thư và
chị Thảo đã luôn ở bên cạnh chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm cũng như đã giúp đỡ tôi
rất nhiều trong quá trình làm đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô giảng dạy tại khoa
Sinh Học trường đại học Khoa Học Tự Nhiên Thành Phố Hồ Chí Minh đã truyền
đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian đại học cũng như cao học.
Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thành viên trong
gia đình tôi đã hỗ trợ tôi về mặt tinh thần cũng như đốc thúc tôi hoàn thành đề tài
này.

1.5.5. MLEE 19
1.5.6. MLST 19
1.6. Tình trạng mang vi khuẩn không triệu chứng ở S. Typhi và NTS 22
1.6.1. Tình trạng mang trùng không triệu chứng của Typhi và Paratyphi A 23
1.6.2 Tình trạng mang trùng NTS 23
1.7. Các yếu tố nguy cơ trong nhiễm trùng do NTS 24
1.7.1. Các yếu tố nguy cơ từ môi trường 24
1.7.2. Các yếu tố nguy cơ từ bản thân vật chủ 25
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP
2.1 Đối tượng nghiên cứu 28
2.2 Qui trình thực nghiệm 29
2.3 Hóa chất- thiết bị- phương pháp tiến hành 29
2.3.1 Phân lập và định danh Salmonella spp bằng API 20E 29
2.3.2 Định danh dựa trên phản ứng ngưng kết kháng nguyên kháng thể 32
2.3.3 Xác định kháng sinh đồ 33
2.3.4 Xác định sự đa dạng di truyền bằng phương pháp MLST 35
2.3.4.1 Tách chiết DNA vi khuẩn 35
32.3.3.2 PCR 7 gen giữ nhà (house keeping genes) 37
2.3.3.3 Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 38
2.3.3.4 Tinh sạch sản phẩm PCR 40
2.3.3.5 Giải trình tự các gen giữ nhà 42
2.3.3.6 Phân tích kết quả giải trình tự 44
2.3.3.7 Phân tích kết quả MLST 45
2.3.5 Xác định các yếu tố nguy cơ trong nhiễm trùng dạ dày ruột do Salmonella 46
2.3.5.1 Bảng câu hỏi khảo sát 46
2.3.5.2 Phân tích thống kê bằng phần mềm Stata 47
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ-BIỆN LUẬN

bp Base pair
CAZ Ceftazidime
CIP Ciprofloxacin
CHL Chloramphenicol
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CN Gentamicin
CRO Ceftriaxone
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate
DNA Deoxyribonucleic acid
MC Mac Conkey
MLST Multilocus sequence typing
MH Muller-Hinton
MLEE Multilocus enzyme electrophoresis
MST Minimum spanning tree
Na Nalidixic acid
NA Nutrition agar
NTS Non-Typhi Salmonella
6
OFX Oxfloxacin
OR Odds ratio
PCR Polymerase chain reaction
PSO Polyvalent O
PFGE Pulsed field gel electrophoresis
SB Selenite broth
SLVs Single locus variants
ST Sequence type
SPI Salmonella Pathogenicity Islands
S.Typhimurium Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium
SXT Trimethoprim – sulfamethoxazole

Biểu đồ 3.2 Mối liên hệ giữa số ca nhiễm và nhiệt độ trung bình theo tháng 64
9
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Hệ thống phân loại của giống Salmonella 4
Hình 1.2 Cấu trúc tế bào vi khuẩn Salmonella spp và vách tế bào 5
Hình 1.3 Tỉ lệ các týp huyết thanh phổ biến nhất ở người phân lập từ các
châu lục khác nhau 15
Hình 1.4 Tỉ lệ các týp huyết thanh phổ biến nhất ở các nguồn không từ người
phân lập ở các châu lục khác nhau 15
Hình 1.5 Kết quả cây phân loại di truyền cho Salmonella enterica 22
Hình 2.1 Kết quả que thử API 20E cho Salmonella spp 30
Hình 2.2 Thang 100bp của Invitrogen 39
Hình 3.1 Kết quả điện di của 7 phân đoạn gen của 7 gen giữ nhà 51
Hình 3.2 Cây phát sinh loài của 174 chủng Salmonella spp 57
Hình 3.3 Cây Minimum spanning tree được vẽ từ dữ liệu MLST
của 174 mẫu Salmonella spp 59
1

LỜI MỞ ĐẦU
Với 1.8 triệu ca tử vong mỗi năm do tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi, chiếm 19%
số ca tử vong trên trẻ em, bệnh tiêu chảy cấp vẫn là nguyên nhân gây bệnh hàng đầu ở
các nước đang phát triển. Trong đó thì Salmonella là một trong những tác nhân vi
khuẩn chính gây bệnh với tổn thất kinh tế được tính bằng số ngày nằm viện và chi phí
chữa trị. Bệnh cảnh phổ biến do Salmonella spp gây ra là tiêu chảy, tuy nhiên bệnh
cũng có thể gây biến chứng nặng trên người có hệ miễn dịch yếu như trẻ em, người lớn
tuổi, người nhiễm HIV…. Non-typhi Salmonella (NTS) có phổ vật chủ khá rộng bao
gồm người, động vật, bò sát… cũng như có thể tồn tại lâu ở môi trường bên ngoài. Con
đường lan truyền phổ biến nhất là thông qua việc ăn uống các thực phẩm nhiễm khuẩn.
Ở Việt Nam hiện nay có rất ít các nghiên cứu về NTS, đa số các nghiên cứu đều
dừng lại ở việc xác định mức độ phổ biến của Salmonella spp phân lập được trên thực

1.1. Danh pháp và phân loại Salmonella enterica
Salmonella là giống vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae,
bao gồm nhiều vi khuẩn gây hại trên người và động vật. Giống vi khuẩn Salmonella
được chia thành 2 loài là enterica và bongori[10]. Salmonella enterica được chia thành
6 phân loài enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae and indica, với hơn 2500
týp huyết thanh khác nhau (hình 1.1). Việc phân loài Salmonella được dựa trên đặc
tính sinh hóa, độ tương đồng về trình tự nucleotide và gần đây được hỗ trợ bởi dữ liệu
giải trình tự. Týp huyết thanh được xác định bởi kháng nguyên O (kháng nguyên vỏ) và
kháng nguyên H (kháng nguyên lông roi) với công thức kháng nguyên được viết là:
kháng nguyên O; kháng nguyên H (pha 1, pha 2)[41].
Phần lớn các týp huyết thanh của Salmonella thuộc S.enterica phân loài enterica
(phân loài I), là nguyên nhân gây hơn 99.9% các bệnh nhiễm trùng ở người và động vật.
Các týp huyết thanh thường đươc đặt tên theo nơi chúng được phân lập lần đầu, không
viết in nghiêng và chữ cái đầu được viết hoa.
Ví dụ: Tên đầy đủ của týp huyết thanh Typhi là S.enterica phân loài enterica týp
huyết thanh Typhi, thường được gọi tắt là S. enterica týp huyết thanh Typhi, S. Typhi
hoặc đơn giản hơn chỉ gọi bằng Typhi.
Trong phạm vi bài này, thuật ngữ Non-typhi Salmonella (NTS) dùng để chỉ tất
cả những týp huyết thanh Salmonella gây bệnh nhiễm trùng dạ dày ruột và nhiễm trùng
xâm lấn trên người hoặc động vật, ngoại trừ S. Typhi và S. Paratyphi A.
4

Hình 1.1: Hệ thống phân loại của giống Salmonella[60]. Việc phân loài Salmonella
được dựa trên biotyping, lai DNA-DNA, phân tích 16S RNA và MLEE. Serotyping
được sử dụng để phân biệt các týp huyết thanh ở mức dưới phân loài. Số lượng týp
huyết thanh là chữ số trong ngoặc đơn dưới mỗi phân loài.
1.2. Đặc điểm cấu trúc, sinh lý sinh hóa và di truyền của Salmonella enterica
1.2.1. Đặc điểm cấu trúc
Salmonella, cũng như các vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae khác, là các
vi khuẩn Gram âm, kị khí tùy ý, hình que, oxidase âm, không tạo bào tử và có khả năng

xác định ở Salmonella, chúng khác nhau bởi thành phần đường cấu tạo nên tiểu đơn vị
O, thứ tự sắp xếp và liên kết. Sự đa dạng về mặt cấu trúc phản ánh sự đa dạng về mặt di
truyền của nhóm gen wba, với cấu trúc khảm chứng tỏ có sự tiến hóa bởi quá trình
chuyển gen theo hàng ngang của các loài vi khuẩn. Gốc oligosaccharide được mã hóa
bởi một nhóm gen khác gọi là waa, với sự đa dạng liên quan tới sự đa dạng cấu trúc của
gốc oligosaccharide.
Salmonella còn có biểu hiện kháng nguyên O LPS ngoại bào, gồm các tiểu đơn
vị O tương tự như ở kháng nguyên O LPS. Quá trình tổng hợp vỏ kháng nguyên O phụ
thuộc vào những gen nằm ngoài locus wba (yihU - yshA và yihV - yihW). Kháng nguyên
O LPS ngoại bào cần thiết cho sự hình thành lớp màng sinh học trên bề mặt sỏi mật
(quan trọng cho quá trình mang trùng không triệu chứng trên vật chủ có vú)[15,
16] và cho quá trình bám dính trên lá (liên quan đến con đường lan truyền qua thực
phẩm)[4].
Hầu hết Salmonella có hai gen tạo lông roi gọi là fliC và fliB, nhưng chỉ biểu
hiện một gen ở mỗi giai đoạn, với tỉ lệ chuyển giữa hai pha là từ 10-3 đến 10-5. Quá
trình biến đổi pha có thể là hệ thống giúp Salmonella thoát khỏi tác động của hệ miễn
dịch vì fliC được xem là kháng nguyên mục tiêu cho tế bào T trên mô hình chuột[26].
7

Cấu trúc bề mặt đóng vai trò quan trọng quyết định các đặc tính sinh lý và sự
bám vào các mô của tế bào chủ. Nếu Salmonella mất hoặc không biểu hiện kháng
nguyên O sẽ không có khả năng sống sót trong tế bào chủ do kháng nguyên O là lớp
LPS bảo vệ vi khuẩn khỏi sự tấn công của các bổ thể thuộc hệ miễn dịch.
1.2.2. Đặc điểm sinh lý sinh hóa
Vi khuẩn Salmonella lên men đường glucose và thường sinh hơi. Thêm vào đó,
chúng có khả năng mọc trên môi trường tối thiểu chỉ có đường glucose như nguồn cung
cấp carbon và muối ammonium như nguồn cung cấp đạm. Hầu hết các týp huyết thanh
được phân loại kiểu hình dựa trên khả năng thủy giải ure, không lên men đường lactose
và sinh H2S[49]. Salmonella có chu kì phân chia tế bào là 40 phút, tăng trưởng
tốt ở nhiệt độ 37oC, tuy nhiên vẫn có khả năng tăng trưởng ở khoảng nhiệt rộng hơn, từ

mã hóa cho hệ thống tiết loại 1 (T1SS). SPI-7 là vùng gen trên bộ gen Typhi mã hóa
gen tổng hợp kháng nguyên Vi, chỉ hiện diện trên Typhi, Paratyphi C, Citrobacter
freundii và một số chủng Dublin mà không được tìm thấy ở bất kì Salmonella spp
nào khác. Ngoài ra còn có một loạt các SPI khác từ SPI-11 đến SPI-22 cũng được mô tả
gần đây.
1.3. Bệnh học nhiễm trùng do NTS
Nhiễm Salmonella có thể có nhiều bệnh cảnh lâm sàng khác nhau, phụ thuộc
mối tương tác giữa vi khuẩn và vật chủ. Kết quả của mối tương tác giữa chủng
Salmonella và vật chủ phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như týp huyết thanh của
vi khuẩn, liều nhiễm, khả năng miễn dịch và hệ vi sinh vật đường ruột của vật chủ. Phổ
gây bệnh khá đa dạng từ sốt thương hàn, nhiễm trùng dạ dày ruột cho tới mang trùng
không triệu chứng. Salmonella enterica phân loài I enterica là tác nhân chính gây bệnh
nhiễm trùng dạ dày ruột ở động vật có vú. Phân loài này thường gây bệnh thương hàn
9

hoặc nhiễm trùng dạ dày ruột không phải thương hàn. Sốt thương hàn gây ra bởi S.
Typhi và S. Paratyphi A và chỉ xuất hiện trên người.
NTS thường gây ra tiêu chảy, mất nước và chất điện giải, suy dinh dưỡng, hoại
tử ruột non ở trẻ sơ sinh, nhiễm trùng tại chỗ và nhiễm trùng hệ thống[24]. Đôi khi
bệnh có thể dẫn tới các biến chứng nguy hiểm như viêm màng não, viêm tủy xương,
nhiễm trùng máu hoặc hiếm gặp hơn là viêm cơ tim và viêm phổi. Viêm màng não do
Salmonella đặc biệt quan trọng vì bệnh có thể để lại di chứng thần kinh. Khoảng từ 2-
45% bệnh nhân bị tiêu chảy do NTS sẽ có biến chứng thành nhiễm trùng máu. Tỉ lệ
nhiễm trùng máu tùy thuộc vào cơ địa và týp huyết thanh gây bệnh và tỉ lệ này là khác
nhau giữa các nghiên cứu[103]. Các thể bệnh do NTS này thường nghiêm trọng và
nguy hiểm đến tính mạng cũng như xuất hiện mà không có triệu chứng tiêu chảy báo
trước mặc dù đường tiêu hóa thường là nguồn gốc của bệnh. Bệnh thường nguy hiểm ở
trẻ sơ sinh, người già và người suy yếu hệ miễn dịch, tỉ lệ chết thường cao trong nhóm
bệnh nhân này.
1.3.1. Triệu chứng lâm sàng

và rối loạn điện giải. Xét nghiệm tìm máu trong phân cho thấy bạch cầu đa nhân hiện
diện từ 36 đến 82% các ca nhiễm trùng dạ dày ruột do Salmonella, nhưng kết quả này
không đặc hiệu. Chẩn đoán chính xác chỉ có thể có được bằng cách phân lập tác nhân
gây bệnh. Ở bệnh nhân bị nhiễm trùng dạ dày ruột, việc cấy phân hoặc mẫu phết trực
tràng là dương tính ở hầu hết người bị nhiễm. Mẫu phết được nuôi cấy qua đêm trong
môi trường selenite để tăng sinh vi khuẩn từ phân. Môi trường chuẩn để phân lập vi
khuẩn là Mac Conkey, Hektoen Enteric hoặc Xylose Lysine Desoxychocolate.
Salmonella cũng có thể được phân lập từ máu của bệnh nhân nhiễm trùng máu do
11

Salmonella. Vi khuẩn được định danh sinh hóa bằng bộ kit Api20E (Biomerieux) và
định týp huyết thanh.
Có nhiều phương pháp khác nhau để định danh Salmonella. Trong đó phương
pháp định týp huyết thanh Kauffmann-White là phương pháp định danh được công
nhận và sử dụng rộng rãi từ năm 2003[41]. Phương pháp này dựa vào sự ngưng kết của
huyết thanh với 2 kháng nguyên bề mặt của Salmonella là kháng nguyên O và kháng
nguyên H.
Định týp huyết thanh (serotyping) đã được áp dụng rộng rãi để định danh cũng
như dùng trong chẩn đoán thường qui cho Salmonella, tuy nhiên kĩ thuật này cũng có
một số hạn chế. Kháng nguyên O của một số týp huyết thanh có phản ứng chéo với một
số giống khác thuộc họ Enterobacteriaceae, đặc biệt là Escherchia coli dẫn đến phản
ứng dương giả. Serotyping dựa trên công thức kháng nguyên và không có khả năng
phân biệt các chủng có vật chủ khác nhau. Ví dụ: Typhimurium phagetype DT2 và
DT99 chỉ gây bệnh ở gia cầm trong khi DT104 và DT204 có phổ gây bệnh rộng hơn.
Hiện nay nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đang phát triển các kỹ thuật sinh
học phân tử như PCR để định týp huyết thanh cho các týp huyết thanh phổ biến dựa
trên trình tự đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên O và kháng nguyên H[5, 29].
1.3.4. Điều trị
Tiêu lỏng và nôn ói nhiều lần làm cơ thể người bệnh bị mất nước nhanh chóng,
đặc biệt là ở trẻ sơ sinh, trẻ nhỏ ở vùng khí hậu nóng và có kèm sốt. Phác đồ điều trị

trọng ngăn ngừa việc lây bệnh từ người sang người thông qua thức ăn. Những người
thải Salmonella trong phân không được phép tham gia chế biến thức ăn hoặc chăm sóc
trẻ cho đến khi kết quả cấy phân là âm tính.
13

Hiện tại vẫn chưa có vắc xin hiệu quả phòng bệnh NTS. Độc lực của NTS là tùy
thuộc vào khả năng sinh sôi của vi khuẩn trong đại thực bào của hệ võng nội mô. Tình
trạng kháng với bổ thể, bởi chuỗi dài lipopolysacharide cũng là một tính độc quan trọng
của vi khuẩn. Cả bổ thể và kháng thể đặc hiệu đều cần thiết để giết Salmonella spp in
vitro[34]. Mặc dù mẫu huyết thanh của bệnh nhân Châu Phi khỏe mạnh có khả năng
tiêu diệt NTS, những mẫu huyết thanh của trẻ em dưới 16 tháng tuổi thường không có
đủ kháng thể đặc hiệu để tiêu diệt NTS một cách hiệu quả[69]. Điều này có thể giải
thích cho khuynh hướng mắc bệnh nhễm trùng hệ thống do NTS ở trẻ em nhỏ tuổi và
cũng giúp hiểu được sự bất thường về hệ miễn dịch của bệnh nhân nhiễm HIV cũng
khiến những bệnh nhân này dễ mắc bệnh nhiễm trùng xâm lấn do NTS. Nghiên cứu gần
đây nhất của Calman và cộng sự (2010) cho thấy kháng thể trong máu của bệnh nhân
HIV thay vì bám vào protein trên màng tế bào (outer membrane protein) cho phép hệ
miễn dịch nhận biết và tiêu diệt Salmonella thì lại bám vào LPS khiến các kháng thể
bình thường không làm được nhiệm vụ tiêu diệt[68, 87]. Nghiên cứu này cho thấy
protein màng tế bào có thể là nhân tố hứa hẹn trong sản xuất vắc xin thay vì sử dụng
LPS như mục tiêu tiềm năng[33].
1.4. Tình hình nhiễm NTS trên thế giới và ở Việt Nam
1.4.1. Tình hình nhiễm NTS trên thế giới
Ước tính hàng năm có khoảng 93.8 triệu ca nhiễm trùng dạ dày ruột do
Salmonella trên toàn thế giới, với tỉ lệ tử vong là 155.000 ca. Trong đó khoảng 80.3
triệu ca là do ngộ độc thực phẩm [71]. Riêng tại Mỹ, ước tính hàng năm có khoảng 1.4
triệu ca ngộ độc thực phẩm gây ra bởi Salmonella[72, 101].
Hai týp huyết thanh gây bệnh ở người phổ biến nhất ở cả 6 châu lục là S.
Enteritidis và S. Typhimurium[30]. S. Enteritidis là týp huyết thanh phổ biến toàn cầu,
đặc biệt là ở Châu Âu (chiếm 80% số ca bệnh) và Châu Á (38% số ca). Đại dịch S.