BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HUỲNH THỊ HỒNG TRANG
NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỘNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA SINH
CỦA CÂY NHA ĐAM DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA MANNITOL
TRONG ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY IN VITRO
ràng. Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tác giả luận văn
HUỲNH THỊ HỒNG TRANG
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
Danh mục đồ thị
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu chung về thực vật CAM 3
1.1.1. Thực vật CAM 3
1.1.2. Cơ chế chuyển hóa acid malic trong quá trình quang hợp của thực vật CAM 5
1.2. Giới thiệu chung về cây nha đam 7
1.2.1. Lịch sử phát hiện cây nha đam 7
1.2.2. Đặc điểm sinh học của cây nha đam 8
1.2.3. Thành phần hóa học cây nha đam 9
1.3. Nhân giống in vitro 9
1.3.1. Thuật ngữ nhân giống in vitro 9
1.3.2. Lược sử phát triển của nhân giống in vitro 10
1.3.3. Nhân nhanh cây con in vitro 14
1.4. Đặc tính chịu hạn của thực vật 15
1.4.1. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn của thực vật 15
1.4.2. Ảnh hưởng của mannitol lên nuôi cấy mô tế bào thực vật 17
1.5. Tổng quan về một số thành phần hóa sinh 18
1.5.1. Tổng quan về tinh bột 18
1.5.2. Tổng quan về acid oxaloacetic (OAA) 19 3.2. Ảnh hưởng của mannitol ở các nồng độ khác nhau lên khả năng sinh trưởng
và các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh của cây nha đam in vitro 32
3.2.1. Ảnh hưởng của mannitol lên khả năng sinh trưởng của cây nha đam in vitro 32
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ mannitol đến tốc độ sinh trưởng tương đối cây nha
đam trong điều kiện in vitro 34
3.2.3. Ảnh hưởng của mannitol đến các chỉ tiêu sinh lý của cây nha đam in vitro 35
3.2.3.1. Biến động pH của dịch lá nha đam in vitro nuôi cấy trên môi trường
có bổ sung các nồng độ mannitol khác nhau 35
3.2.3.2. Cường độ quang hợp ở lá của cây nha đam in vitro sau 4 tuần nuôi
cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 37
3.3. Ảnh hưởng của mannitol đến các chỉ tiêu hóa sinh của lá cây nha đam in
vitro nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau . 38
3.3.1. Hàm lượng nước trong lá cây nha đam in vitro cấy chuyển lên môi trường có
bổ sung mannitol ở các nồng độ khác nhau 38
3.3.2. Hàm lượng protein 39
3.3.3. Hàm lượng đường khử và hàm lượng tinh bột 40
3.3.4. Hàm lượng pyruvate và OAA 42
3.3.5. Hoạt độ enzyme 44
3.6. Kết quả chạy điện di SDS-PAGE 46
Chƣơng 4 . KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48
4.1. Kết luận 48
4.2. Kiến nghị 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
PHỤ LỤC
Trang
Bảng 2.1
Thành phần môi trường MS
25
Bảng 3.1
Ảnh hưởng của nồng độ mannitol đến tốc độ sinh trưởng
tương đối của cây nha đam trong điều kiện in vitro
34
Bảng 3.2
Biến động pH của dịch lá cây nha đam in vitro sau 4 tuần
nuôi cấy trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng
độ khác nhau
36
Bảng 3.3
Cường độ quang hợp của lá cây nha đam in vitro nuôi cấy
trên môi trường có bổ sung mannitol ở các nồng độ khác
nhau
37
Bảng 3.4
Hàm lượng chất khô và protein trong lá nha đam được
nuôi cấy trên môi trường bổ sung các nồng độ mannitol
khác nhau
39
Bảng 3.5
Hàm lượng đường khử và hàm lượng tinh bột trong lá cây
nha đam in vitro khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung
mannitol ở các nồng độ khác nhau
41
Bảng 3.6
Hàm lượng pyruvate và OAA trong lá nha đam in vitro
19
Hình 1.5
Cấu tạo phân tử mannitol
21
Hình 2.1
Cây nha đam (Aloe vera L.) in vitro
24
Hình 3.1
Cụm chồi thu được từ đoạn thân tách từ cây nha đam in vitro
29
Hình 3.2
Cụm chồi thu được từ đỉnh sinh trưởng tách từ cây nha
đam in vitro 3 tuần
30
Hình 3.3
Chồi đơn tách từ cụm chồi nha đam in vitro mới cấy chuyển
31
Hình 3.4
Chồi đơn tách từ cụm chồi nha đam in vitro sau cấy
chuyển 4 tuần
32
Hình 3.5
Mẫu nha đam in vitro xử límannitol :a,b,c,d,e,f,g tương
ứng với nồng độ mannitol: 1, 3, 6, 9, 12,15, 18% cấy
chuyển sau 4 tuần.
33
Hình 3.6
Quá trình tích lũy và chuyển hóa acid malic trong nhóm
PCK – CAM
35
1
MỞ ĐẦU
Thực vật có mạch lá được chia thành 3 nhóm chính: C3, C4, CAM
(Crassualacean acid metabolism). Trong số đó, thực vật CAM chiếm khoảng 6 –
7%, được phân thành 5 lớp, 33 họ, 328 giống, 16.000 loài khác nhau. Thực vật
CAM có nhiều giá trị kinh tế khác nhau, một số thuộc nhóm hoa cây cảnh như
phong lan, hoa quỳnh đỏ, quỳnh trắng, xương rồng…, một số thuộc nhóm cây dược
liệu như cây thuốc bỏng, nha đam, dứa dại…, một số thuộc nhóm cây ăn trái như
dứa, thanh long… [26].
Khác với các loài thực vật C3 và C4, các loài thực vật CAM thường có khả
năng đóng khí khổng vào ban ngày, do vậy hạn chế được sự mất nước qua lá, đồng
thời vào ban đêm, khí khổng của chúng thường mở ra để hấp thụ CO
2
và tích lũy
lượng CO
2
này trong acid malic. Quá trình chuyển hóa acid malic vào ban ngày sẽ
tạo ra sản phẩm hữu cơ là pyruvate hoặc acid oxaloacetic (OAA) đồng thời thải ra
CO
2
. Lượng CO
2
này sẽ được bào quan lục lạp ở trong cây sử dụng, phối hợp với
nước và ánh sáng để tiến hành quá trình quang hợp [31]. Căn cứ vào sản phẩm tạo
nước trầm trọng, dẫn đến sự ngừng trệ các hoạt động trao đổi chất trong cây và gây ảnh
hưởng lớn đến sự sống của cây. Một số trường hợp nghiên cứu gần đây cho thấy, trong
trường hợp mất nước nghiêm trọng, một số loại cây có khả năng chuyển hướng trao đổi
chất để tăng cường tính thích nghi nhằm duy trì sự sống.
Để hiểu rõ hơn đặc tính này trong nhóm thực vật CAM, chúng tôi chọn đề tài
“Nghiên cứu biến động một số chỉ tiêu hóa sinh của cây nha đam dƣới tác động
của mannitol trong điều kiện nuôi cấy in vitro”.
3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về thực vật CAM
1.1.1. Thực vật CAM
Thực vật CAM được phát hiện đầu tiên vào cuối năm 1940, bởi 2 nhà thực
vật học Rason và Thormas. Thuật ngữ “CAM” được đặt theo tên của họ thực vật mà
cơ chế này lần đầu tiên được phát hiện ra. Từ sau phát hiện đó, thực vật CAM dần
được các nhà sinh học quan tâm nghiên cứu nhiều hơn và đã có một số kết quả về
để khai thác và sử dụng chúng phục vụ nhu cầu đời sống của con người là một việc
làm cần thiế ý nghĩa lớn trong tương lai [26].
Hiện nay, khí hậu toàn cầu đang ngày càng nóng lên và theo dự đoán, nhiệt
độ trái đất sẽ ấm lên trung bình từ 2 – 4
0
C trong thế kỷ tới (IPCC, 2007), dẫn đến
tình trạng khan hiếm nước. Việt Nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa.
Vì vậy, hạn là yếu tố thường xuyên tác động gây ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát
triển của cây trồng, ảnh hưởng xấu đến năng suất và phẩm chất của chúng [12].
Trong điều kiện cực kì khô hạn, thực vật CAM có thể đóng khí khổng một thời gian
dài để ngăn chặn sự mất nước và lặp lại chu trình CO
2
bên trong tế bào. Do đó,
chúng sẽ không có bất cứ một sự sinh trưởng nào nhưng có thể duy trì sự sống cho
tế bào. Thực vật CAM được tìm thấy trước đây chủ yếu là ở sa mạc hay những vùng
khí hậu khô hạn với các dạng sống như: biểu sinh, leo hay thẳng đứng. Nhưng
những nghiên cứu gần đây cho rằng một số thực vật CAM cũng sống trong nước.
Có nhiều tài liệu khác nhau về thực vật CAM sống thủy sinh như Isoëtes và một số
thực vật 1 lá mầm và 2 lá mầm. Keeley khẳng định: "Thực vật CAM thủy sinh sống
ở những nơi mà quang hợp có khả năng bị hạn chế bởi carbon" [30]. Thực vật CAM
sống thủy sinh không có liên quan với sự mất nước, đúng hơn là có liên quan tới
hàm lượng khí CO
2
. Các dạng sống có thể thay đổi trong chu trình sống. Ví dụ như
cây dạng sống bán biểu sinh sẽ sống như dạng thẳng và trở thành dạng đứng tự do
khi chúng giết chết tế bào chủ. Các họ thực vật CAM sống dạng đứng tự do như:
Cactaceae, Euphorbiaceae, Didieraceae, Agavaceae. Có một số thực vật thực hiện
cả quang hợp C3 và CAM hay C4 và CAM .
Ở nước ta có rất ít nghiên cứu được tiến hành trên thực vật CAM. Một số nghiên
cứu hiện nay về thực vật CAM hầu như chỉ tập trung chủ yếu vào hướng hoa cây cảnh
6
cơ chế chuyển hóa acid malic tạo thành OAA hoặc pyruvate để tăng khả năng sống
sót và thích nghi với sự biến đổi của môi trường.
Mỗi nhóm ME – CAM hay PCK – CAM được chia thành 2 nhóm nhỏ: nhóm
tạo thành tinh bột và nhóm tạo thành đường glucose bên ngoài lục lạp dựa trên
nguồn carbonhydrate chính đã sử dụng trong chu trình hàng ngày của chúng. Bên
cạnh đó có 1 số loài thực vật CAM trung gian có đặc tính của cả 2 nhóm ME –
CAM và PCK – CAM, phụ thuộc vào điều kiện môi trường.
Mỗi loài thực vật CAM sở hữu một cơ chế chuyển hóa riêng biệt.
Hình 1.2. Sơ đồ chuyển hóa acid malic ở hai nhóm thực vật CAM
- Chuyển hóa acid malic tế bào chất và chức năng sinh lý của chúng ở các
loài thực vật CAM
Ở các loài thực vật CAM, acid malic tạo thành vào ban đêm và tích lũy trong
không bào của các tế bào quang hợp, phụ thuộc vào mỗi loài thực vật CAM khác
nhau. Acid malic được chuyển hóa tạo thành pyruvate và CO
2
hoặc OAA và CO
2
vào ban ngày. ME và malate dehydrogenase (MDH) đóng vai trò quan trọng trong
chuyển hóa acid malic ở tế bào chất của các loài thực vật CAM [26].
7
dược (sau này gọi là nha đam hoặc lô hội), từ Trung Quốc cây nha đam được di thực
sang Việt Nam.
Cây nha đam là loại cây bụi như xương rồng, còn được gọi bằng một số tên
khác như: tượng đảm, long tu, du thông, lưỡi hổ, hổ thiết… thuộc chi Aloe, họ huệ
tây (Liliaceae) [4]. Trong khoảng 180 loài thuộc chi Aloe thì chỉ có 4 loài được sử
dụng để làm thuốc bổ dưỡng và chữa bệnh, một số loài có độc tố. Hai loài được chú
ý nhiều nhất là A. Ferox và A. vera Linne.
Theo sách “Cây cỏ Việt Nam” của Phạm Hoàng Hộ thì chi Aloe ở nước ta
chỉ có 1 loài là A.vera L. Sinensis. Berger tức là cây nha đam lá nhỏ [6], [7].
1.2.2. Đặc điểm sinh học của cây nha đam
Theo Võ Văn Chi (1991), Đỗ Thanh Hội (1997) thì cây nha đam là loại cây
dạng thân cỏ, mập, màu xanh lục nhạt, thân ngắn [3], [8].
Cây nha đam trưởng thành có lá mập, dài 30 – 50 cm, rộng 5 – 10 cm, dày 1 – 2 cm.
Lá nha đam gồm 2 phần: phần vỏ ngoài là lớp vỏ xanh, khi cắt ngang chảy ra
nhựa màu vàng có mùi hắc, để khô chuyển thành màu đen, phần trong là phần thịt
mọng nước dạng gel.
Cụm hoa của cây cao khoảng 1m, mọc thành chùm, hoa to đều có màu vàng
lục nhạt. Quả nang hình trứng màu xanh, chứa nhiều hạt. Nếu rạch một đường giữa
là nha đam tươi rồi dùng thìa nạo ở giữa lá nha đam quan sát sẽ thấy có một chất gel
trong suốt. 9
1.2.3. Thành phần hóa học cây nha đam
Phân tích các thành phần lấy từ lá nha đam, các nhà nghiên cứu tìm thấy các
chất sau [14]:
1. Hợp chất anthraquinon: đây là thành phần có tác dụng chữa bệnh của
1.3.2. Lược sử phát triển của nhân giống in vitro:
Bắt đầu từ năm 1938, hai nhà sinh học người Đức là Matthias Jacob
Schleiden (nhà thực vật học) và Theodor Schwann (nhà động vật học) mới chính
thức đề xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là Học thuyết tế bào. Học thuyết
tế bào khẳng định: mỗi cơ thể động, thực vật đều bao gồm những thể tồn tại hoàn
toàn độc lập, riêng lẻ và tách biệt, đó chính là tế bào [1].
Năm 1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ
quan sinh dục. Từ một tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có thể tái sinh thành một cơ
thể sống hoàn chỉnh. Khả năng này của tế bào thực vật được gọi là tính toàn năng.
Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô và tế
bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Ông làm thí nghiệm với tế
bào khí khổng và đã không thành công, do ông đã chọn cây một lá mầm là đối
tượng rất khó nuôi cấy, hơn nữa ông đã dùng các tế bào đã mất hết khả năng tái
sinh. Một nguyên nhân khác của sự thất bại là do vào thời kỳ đó, những hiểu biết
khoa học về nhu cầu dinh dưỡng của mô thực vật còn rất hạn chế nên Haberlandt đã
không tìm ra được môi trường dinh dưỡng tối thích cho sự phân chia tế bào.
Đến năm 1922, Robins và học trò của Haberlandt là Kotte đã tiến hành nuôi
cấy đỉnh sinh trưởng của rễ một cây hòa thảo trong môi trường lỏng, có sự hiện diện
của muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh và tạo nên một hệ rễ nhỏ
có cả rễ phụ. Sau đó, hệ rễ này sinh trưởng chậm dần và ngừng lại, mặc dù đã
chuyển sang môi trường mới [1].
Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một hormone
thực vật đầu tiên thuộc nhóm auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân
chia tế bào. Năm 1939, ba nhà khoa học Gautheret, Nobecourt và White đã đồng
thời nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô tượng tầng (cambium) ở
cà rốt và thuốc lá, mô sẹo có khả năng sinh trưởng liên tục.
Năm 1934. White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua (Lycopersicum
esculentum) trong môi trường lỏng có bổ sung muối khoáng, glucose và dịch chiết
11
Năm 1954, Miller và Skoog trong khi nuôi cấy mô lõi cây thuốc lá đã đã phát
minh cấu trúc và sinh tổng hợp của kinetin - một cytokinin đóng vai trò quan trọng
12
trong phân bào và phân hoá chồi ở mô nuôi cấy. Sau này, người ta đã chứng minh
rằng sự phân bào ở thực vật trong tự nhiên cũng do các chất hóa học tương tự như
kinetin điều khiển và xếp chung các chất đó vào nhóm có tên gọi là cytokinin. Chất
cytokinin đầu tiên được tách từ thực vật bậc cao là zeatin lấy từ mầm ngô.
Việc phát hiện ra vai trò của IAA, NAA, 2,4-D và kinetin cùng với việc phát
hiện vai trò của vitamin và nước dừa có ý nghĩa rất quan trọng trong lịch sử nuôi
cấy mô và tế bào thực vật. Chính việc phát hiện này làm cơ sở cho sự phát triển tiếp
theo của lĩnh vực khoa học này.
Đến năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các
chất auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi).
Khi tỷ lệ auxin/ cytokinin (ví dụ: nồng độ IAA/kinetin) nhỏ hơn 1 và càng nhỏ, mô
có xu hướng tạo chồi. Ngược lại khi nồng độ IAA/ nồng độ kinetin lớn hơn 1 và
càng lớn, mô có xu hướng tạo rễ. Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ
kích thích phân hoá cả chồi và rễ, tạo cây hoàn chỉnh. Hiện tượng này được xác
nhận trên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào điều khiển sinh trưởng, phát
triển và phát sinh cơ quan của mô, tế bào trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật.
Từ năm 1954 - 1959, kỹ thuật tách và nuôi tế bào đơn được phát triển.
Muller, Haberlandt và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một huyền phù các
tế bào đơn bằng cách nuôi trên máy lắc. Nickell (1956) nuôi liên tục được một
huyền phù tế bào đơn cây đậu (Phaseolus vulgaris). Reinert và Steward (1958) tạo
được phôi và cây cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy trong dung dịch.
Melchers và Beckman (1959) đã nuôi liên tục các tế bào đơn trong bình có dung
tích khá lớn bằng cách sục khí liên tục và thỉnh thoảng thu hoạch tế bào, thêm dung
trong các điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí các bào quan
từ bên ngoài. Do đó, các nhà nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật hy vọng rất lớn là có
thể sử dụng protoplast trong công tác chọn giống thực vật.
Từ năm 1980 đến nay là giai đoạn thành công của lĩnh vực công nghệ gen thực
vật. Chỉ trong một thời gian ngắn, hàng loạt các phương pháp đưa gen ngoại lai vào tế
bào thực vật đã được công bố như phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn
Agrobacterium, kỹ thuật dung hợp bằng điện (electroporation), kỹ thuật vi tiêm
(microinjection), sử dụng sóng siêu âm (ultrasonic gene transfer), sử dụng súng bắn
gen (gene gun) đang được các phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng và đạt được
14
nhiều kết quả mong muốn. Sau khi đưa gen ngoại lai vào tế bào, người ta sử dụng kỹ
thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nuôi cấy tế bào được chuyển nạp, sau đó tái
sinh lại thành cây hoàn chỉnh mang những đặc tính sinh học mới. Các cây chuyển gen
đó ra hoa, kết hạt bình thường và được coi như một giống cây trồng mới.
Từ năm 1996 - 2000, một hướng ứng dụng khác của nuôi cấy mô và tế bào thực
vật là sản xuất protein ngoại lai bằng cách sử dụng huyền phù tế bào thực vật như một
phương tiện cho sản xuất kháng thể tái tổ hợp (recombinant antibodies) và các đoạn
kháng thể (antibody fragments) (Lacount và cs., 1997; Liu và cs., 1999), các enzyme như
β-glucuronidase (Kurata và cs., 1998), invertase (Molles và cs., 1999),
phosphomonoesterase (Ilieva và cs., 1996) và các protein có giá trị chữa bệnh như
interleukin 2 (IL-2) và interleukin 4 (IL-4) của người (Magnuson và cs., 1997), Ricin
(Sehnke và cs., 1999), α
1
-antitrypsin người, GM-CSF người (James và cs., 2000).
Năm 2004, Kunet và cs. đã nghiên cứu ứng dụng công nghệ chíp DNA vào
trong ngành nuôi cấy mô và tế bào thực vật để phân tích sự sai khác DNA trong quá
C.
Ngược lại, đối với những loài hoa ở vùng ôn đới nhiệt độ thích hợp cho quá trình
tạo cụm chồi phải < 30
0
C.
Mục tiêu của giai đoạn này là nhân nhanh với số lượng lớn tạo điều kiện cho
việc tiến hành thí nghiệm sau này khi xử lý mannitol gây stress nước.
1.4. Đặc tính chịu hạn của thực vật
1.4.1. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn của thực vật
Khả năng của thực vật ngăn ngừa tổn thương khi bị ảnh hưởng của các yếu
tố bất lợi đó là tính chống chịu [15].
Trong tự nhiên, hạn hán là hiện tượng thường xuyên xảy ra và liên quan trực
tiếp đến vấn đề nước trong cây. Kramer (1983) cho rằng, những tác động của môi
trường xung quanh đủ để gây nên mất nước ở thực vật đó là hạn [33]. Khi hạn là yếu
tố bất lợi với thực vật sẽ gây ra các mức độ thiệt hại khác nhau. Để chống lại sự mất
nước do nguyên nhân từ các tác động bên ngoài, ở thực vật có 3 cơ chế sinh lý chủ
yếu được thảo luận, đó là cơ chế trốn hạn, cơ chế tránh hạn và cơ chế chịu hạn [15].
Thực vật có thể hoàn thành chu kỳ sống sớm hơn trước khi sự thiếu nước
nghiêm trọng trong đất và trong cây xảy ra. Kiểu chịu mất nước này gọi là trốn hạn.
Muốn trốn được hạn, cây phải có sức sinh trưởng và phát triển mạnh, có thể ra hoa
và tạo quả sớm để thời điểm thiếu nước không ảnh hưởng đến chu kỳ sống của cây.
Nhóm cây trốn hạn thường là cây sống ở vùng sa mạc, cây có thời gian sinh trưởng
ngắn. Chu trình sống của chúng thường hoàn thành trước mùa khô hạn tới.
Copyright: Tài liệu đại học ©