BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
*&*
NGUYỄN THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU BẢO QUẢN TINH TRÙNG CÁ
CHẼM MÕM NHỌN Psammoperca waigiensis
(Cuvier, 1828) TRONG NITƠ LỎNG LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nha Trang, năm 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

chẽm mõm nhọn Psammoperca waigiensis (Cuvier, 1828) trong nitơ lỏng” thuộc đề
tài “Nghiên cứu mt s đặc tính và bảo quản tinh trùng cá chẽm mõm nhọn
Psammoperca waigiensis (Cuvier, 1828)” do Quỹ khoa học và công nghệ Quốc gia
(NAFOSTED) tài trợ - trường Đại Học Nha Trang chủ trì - TS. Lê Minh Hoàng chủ
nhiệm, được thực hiện từ tháng 12 năm 2011 đến tháng 12 năm 2013 là chính xác. Các số
liệu, kết quả trình bày trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong
bất cứ công trình khoa học nào khác tới thời điểm này.
Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Thủy
ii

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các quý
phòng ban trường Đại học Nha Trang nói chung và Viện Nuôi trồng thuỷ sản nói riêng;
đặc biệt là sự hướng dẫn trực tiếp và tận tình của TS. Lê Minh Hoàng đã giúp tôi hoàn
thành tốt đề tài. Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ này.
Tôi xin cảm ơn các cán bộ, công nhân tại lồng bè nuôi cá Vũng Ngán – Nha Trang –
Khánh Hòa đã giúp chúng tôi nuôi vỗ thành thục cá.
Tôi xin ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) hỗ trợ
kinh phí thuộc đề tài giúp tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến tất cả quý thầy, cô giáo trong Viện
Nuôi trồng thuỷ sản – Trường Đại học Nha Trang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức
cơ bản nhất làm cơ sở và nền tảng cho tôi thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ và động
viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, ngày 25 tháng 6 năm 2014

1.2.3 Đặc điểm sinh l học của tinh trùng 8
1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tinh trùng cá: 9
1.2.4.1 Yếu tố lý học 9
1.2.4.2 Các yếu tố hóa học 11
1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bảo quản tinh trng cá trong nitơ lỏng 14
iv

1.2.5.1 Kỹ thuật chọn cá thu mẫu: 14
1.2.5.2 Thao tác thu tinh: 14
1.2.5.3 Tỷ lệ pha loãng: 15
1.2.5.4 Chất bảo quản: 15
1.2.5.5 Chất chống đông và nồng độ chất chống đông: 16
1.2.5.6 Thời gian cân bằng: 18
1.2.5.7 Tốc độ hạ nhiệt: 18
1.2.5.8 Phương pháp rã đông: 19
1.3 Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh trng trong nitơ lỏng: 20
1.3.1 Trên thế giới: 20
1.3.2 Ở Việt Nam: 23
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1 Địa điểm nghiên cứu: 24
2.2 Thời gian nghiên cứu: 24
2.3 Đối tượng nghiên cứu: 24
2.4 Phương pháp nghiên cứu 24
2.4.1 Chọn cá đực và thu tinh 24
2.4.1.1 Chọn cá đực 24
2.4.1.2 Vuốt và thu tinh: 24
2.4.2 Một số đặc điểm của tinh dịch cá chm mõm nhọn đưa vào nghiên cứu: 24
2.4.2.1 Màu sắc tinh dịch 24
2.4.2.2 Dung lượng tinh dịch 25
2.4.2.3Mật độ tinh trùng 25


vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình dạng ngoài của cá chm mm nhọn 4
Hình 1.2 Vng phân bố cá chm mm nhọn trên thế giới 5
Hình 1.3 Cấu tạo tinh trng cá 7
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu bảo quản tinh trng cá chm mm nhọn trong nitơ lỏng 26
Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng đến hoạt lực và vận tốc tinh trng cá chm mm
nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 30
Hình 3.2 Ảnh hưởng của chất bảo quản đến hoạt lực và vận tốc tinh trng cá chm mm
nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 32
Hình 3.3 Ảnh hưởng của chất chống đông đến hoạt lực và vận tốc tinh trng cá chm
mm nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 35
Hình 3.4 Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh đến hoạt lực và vận tốc tinh trng cá chm
mm nhọn bảo quản trong nitơ lỏng 37
Hình 3.5 Tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ nở của tinh trng cá chm mm nhọn sau 1 tuần, 1 tháng
và 1 năm bảo quản trong nitơ lỏng 39

viii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CCSE
: Common carp sperm extender
ASP
: Artificial seminal plasma
RFS:
: Ringer solution for seawater fish species

bảo tồn nguồn gen của vật nuôi, góp phần cung cấp nguồn nguyên liệu cho công nghệ di
truyền phân tử áp dụng trong các chương trình chọn giống. Nhờ bảo quản tinh ta có thể
chủ động trong quá trình sản xuất giống nhân tạo, nhất là trong trường hợp có hiện tượng
lệch pha trong sự thành thục giữa giới đực và cái. Việc bảo quản tinh góp phần làm đơn
giản hóa quá trình vận chuyển cá bố từ nơi này đến nơi khác. Ngoài ra, phương pháp này
còn hạn chế tối đa việc lưu giữ cá đực bảo tồn dòng thuần ngăn cản suy giảm chất lượng
di truyền do lai cận huyết [98].
Những năm gần đây, cá chm mm nhọn là loài được nuôi rất ph biến, đặc biệt là
ở Việt Nam [94, 95, 107]. Tuy nhiên, vẫn chưa c các nghiên cứu về việc xác định các
điều kiện tối ưu cho quá trình bảo quản lạnh tinh trng. Mặc d trên thế giới đã c nhiều
nghiên cứu về lnh vực này trên nhiều đối tượng như: cá tuyết Đại Tây dương Gadus
morhua, cá tuyết chấm đen Melanogrammus aeglefinus [100], cá bơn Pseudopleronectes
americanus [101], cá rô biển Lateolabrax japonicus [43], cá chm châu Âu
Dicentrarchus labrax [50], cá mú đen Epinephelus malabaricus [56], …nhưng vẫn chưa
tiến hành nghiên cứu bảo quản tinh trng cá chm mm nhọn trong nitơ lỏng. Chnh vì
thế, nhằm gp phần cung cấp thông tin về các điều kiện tối ưu trong bảo quản lạnh tinh
trng cá chm mm nhọn cũng như chủ động trong sinh sản nhân tạo đối tượng này, đề
2

tài “Nghiên cứu bảo quản tinh trng c chẽm mm nhọn Psammoperca waigiensis
trong nitơ lỏng” được thực hiện.
Đề tài này được thực hiện với các nội dung chnh sau:
- Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng đến hoạt lực tinh trng cá chm mm nhọn bảo
quản trong nitơ lỏng.
- Ảnh hưởng của chất bảo quản đến hoạt lực tinh trng cá chm mm nhọn bảo
quản trong nitơ lỏng.
- Ảnh hưởng của chất chống đông khác nhau đến hoạt lực tinh trng cá chm mm
nhọn bảo quản trong nitơ lỏng.
- Ảnh hưởng của quy trình làm lạnh đến hoạt lực tinh trng cá chm mm nhọn bảo
quản trong nitơ lỏng.

Tên tiếng Anh
Tên tiếng Việt
Sand bass
Glass eyed perch
Sand perch
Waigieu sea perch
Cá chm mm nhọn
Cá vược mm nhọn
Cá thầy bi
Cá vược cát

Hnh 1.1 Hnh dng ngoi của c chẽm mm nhọn – Psammoperca waigiensis
Cuvier, 1828[123]

4

1.1.2 Phân b:
Trên th gii: Phân bố ở các vng biển ven bờ các nước nhiệt đới từ đông Ấn Độ
Dương đến tây Thái Bình Dương, giới hạn ở Bắc bán cầu là vng đảo Ryukyu [28].

Hnh 1.2 Vng phân b c chẽm mm nhọn trên thế gii (Ngun:www.aquamaps.org,
version of Aug. 2010. Web. Accessed 9 Mar. 2013).
*Màu đ: Vng phân b ca cá chm mm nhọn
 Vit Nam: Cá phân bố từ vịnh Bắc Bộ đến vịnh Thái Lan nhưng không nhiều.
Chúng thường sống ở vng đáy, ven biển, cửa sông và ở các thủy vực nước lợ. Thường
gặp ở các hang, hốc đá, thch nghi với đáy là các rạn san hô c nhiều thực vật lớn như
rong, cỏ biển [9].
1.1.3 Đc đim hnh thi:
Thân dài, dt bên, đầu nhỏ nhọn, bắp đuôi ngắn, nền bụng hơi tròn. Chiều dài thân
bằng 2,7-3,6 lần chiều cao. Mp sau xương nắp mang hình răng cưa, gc dưới c một gai

. Tui thành thục lần
đầu của Cá Chm Mõm Nhọn là 2
+
với chiều dài và khối lượng trung bình là 256 mm và
233 gram. Thời gian phát triển phôi bình quân 16-18 giờ ở nhiệt độ nước 27-30
o
C [5].
Cá chm mm nhọn c t lệ con đực thấp khi tui càng cao, cá đạt 5
+
và 6
+
tui thì
không c con đực [7].Khác với kết quả nghiên cứu của Shimose, T.và ctv cho thấy tỷ lệ
cá đực càng cao khi tui cá càng lớn, trên 4
+
tui [107].
1.1.5 Đc đim sinh sn
1.1.5.1 Tui và kch thưc thành thc
Ở vng biển Khánh Hòa, cá thành thục lần đầu khi đạt 2+ tui, chiều dài toàn thân
trung bình đạt 256,2±6,9 mm [4]. Tui tham gia sinh sản lần đầu của cá đực và cá cái là
như nhau.
1.1.5.2 H s thành thc
Hệ số thành thục (GSI) của cá cái ở vng đảo Okinawa Nhật Bản dao động từ 0,07 -
12,56% và ở con đực là 0,03 - 5,81%. Hệ số này ở con cái tăng từ tháng 3 đến tháng 5,
sau đ giảm đến tháng 10, thấp nhất từ tháng 11 đến tháng 2. Với con đực, hệ số này tăng
từ tháng 3 đến tháng 4, giảm đến tháng 9, thấp nhất từ tháng 11 đến tháng 2 [107]. Tại
6

Khánh Hoà, hệ số thành thục của loài này như sau: con đực: 1- 4,28%; con cái từ 0,62
(giai đoạn II) đến 6,30% (giai đoạn IV) [4].

qua một số chu kỳ phân bào từ khoảng 5 đến 15 tùy thuộc vào loài. Trong quá trình phân
chia, tế bào con cần duy trì trực tiếp giữa các tế bào chất với nhau. Trong giai đoạn của
sự gia tăng phân bào, các spermatogonia đầu tiên thông qua một giai đoạn có tốc độ phân
chia chậm được gọi là spermatogonia A và sau đ thông qua một giai đoạn có tốc độ
phân chia nhanh hơn được gọi là spermatogonia B.
- Giai đoạn 2: Giai đoạn phân bào giảm nhim: Việc phân bào cuối cùng của
spermatogonia B tạo ra túi tinh bào (spermatocytes) chính tham gia vào quá trình phân
bào giảm nhim. Trong suốt giai đoạn 2, spermatocytes tiếp tục sự phân chia phân bào
giảm nhim lần đầu, trong đ bao gồm việc sao chép DNA và tái t hợp thông tin di
truyền, dẫn đến sự hình thành của spermatocytes thứ cấp. Chúng nhanh chng đi đến
phân bào giảm nhim thứ cấp nhưng không sao chp DNA, dẫn đến sự hình thành của
các tế bào mầm đơn bội gọi là tiền tinh trùng hay tinh tử (spermatids).
- Giai đoạn 3: Sự biến đi của tinh tử và tinh trùng. Tinh tử bắt đầu quá trình biến
đi trong đ các tế bào đơn bội spermatids biệt hóa thành tinh trùng roi. Quá trình này
làm tế giảm mạnh về kch thước (>80%) [35].
1.2.2 Cấu to tinh trùng

Hình 1.3 Cấu to tinh trùng cá [104]

8

Ở các lớp động vật khác nhau, tinh trùng của chúng khác nhau khá nhiều. Tuy nhiên
tất cả đều có nét chung về hình thái và có liên quan mật thiết đến chức năng chủ yếu là khả
năng sống và thụ tinh [1]. Cấu tạo tinh trùng gồm 3 phần: phần đầu, phần c và phần đuôi.
 Phần đầu: Đầu tinh trùng là phần có khả năng kch thch trứng và chuyển vật chất
di truyền vào trong trứng. Hình thái của đầu tinh trùng khác nhau tùy loài, có thể là hình
đa giác, hình xoắn (ở cá sụn) hay hình ovan, ở cá xương đầu tinh trùng có cấu tạo đơn
giản gần như hình tròn [1].
Đầu tinh trng thường rất to so với các phần c và đuôi. Trên cng của đầu, nằm
ngang dưới màng là thể đnh. Thể đnh c hình như chiếc mũ trm xuống pha dưới,

kích hoạt. Cụ thể là: Mức 5: Tất cả tinh trng đều chuyển động tiến thẳng, mức 4: Đa số
tinh trùng chuyển động tiến trong hiển vi thường thấy ch có một số ít tinh trùng dao
động, mức 3: Số tinh trùng chuyển động t hơn số tinh trng dao động, đã c một số tinh
trùng bất hoạt, mức 2: Rất ít tinh trùng chuyển động tiến, một số ít chuyển động dao
động, ¾ số tinh không chuyển động, mức 1: Tất cả tinh trùng không chuyển động.
Năng lượng cung cấp cho sự vận động của tinh trùng chủ yếu dựa vào sự phân giải
glucid, năng lượng dự trữ của tinh trùng. Sự vận động là tiêu chun quan trọng nhất để
xác định sức sống của tinh trng cá. Cá đực thành thục tốt thì tinh trùng khỏe mạnh và
tui thọ ko dài hơn so với cá đực chưa thành thục.
1.2.4 Các yếu t nh hưng đến tinh trùng cá:
1.2.4.1 Yu t lý học
Tinh dịch là sản phm tiết của tinh sào và ống dẫn tinh trùng, sự xáo trộn thành phần
của nó s dẫn đến thay đi chất lượng tinh trùng [32, 35]. Vai trò chính của các thành phần
trong tinh dịch là tạo ra môi trường tối ưu cho hoạt lực tinh trùng [105]. Các thông số lý
học của tinh dịch được xác định bao gồm: Mật độ tinh trng, độ quánh, pH, áp suất thm
thấu, tng hàm lượng protein [49, 53].
Mật độ tinh trùng là một yếu tố đánh giá chất lượng tinh trùng cá, tuy nhiên mật độ
tinh trùng có sự khác nhau giữa các con đực trong cùng loài, giữa mùa sinh sản, giữa các
ma trong năm và giữa các loài khác nhau [67, 96]. Ví dụ, cá Carassius auratus có sự
thay đi mật độ tinh trùng theo bốn ma trong năm. Mật độ tinh trng (tb/ml/con đực)
vào ma hè (57,30±10,41tb/ml) và ma đông (65,09±80,40 tb/ml) cao hơn ma xuân 9
10

(48,0±7,08 tb/ml) và mùa thu ( 40,42±16,54×109 tb/ml) [126]. Độ quánh (spermatocrit)
tinh dịch là một trong yếu tố ảnh hưởng tới mật độ tinh trng loài cá đ. Nhiều nghiên
cứu ch ra rằng có một sự tương quan giữa mật độ tinh trng và độ quánh tinh dịch cá
như trên cá hồi Salmonids, cá chép Cyprinids và cá bơn Đại Tây Dương Hippoglossus
hippoglossus [60, 89]. Độ quánh của tinh dịch loài được xem như thước đo cho mật độ
tinh trng loài cá đ [59]. Độ quánh cũng thay đi ty loài, đặc biệt độ quánh liên quan
đến chất lượng nguồn cá đực. Độ quánh cao chứng tỏ tinh dịch con cá đ cho mật độ cao

), kali
(K
+
), clorua (Cl
-
), canxi (Ca
2+
) và magiê (Mg
2+
). Trong đ ion Na
+
, Cl
-
chiếm chủ yếu sau
đ là K
+
, 2 ion thứ yếu là Ca
2+
và Mg
2+
[20, 23, 47]. Việc xác định nồng độ của chúng s
thay đi từ loài này sang loài khác, nhưng c một khoảng thích hợp cho mỗi ion để cung
cấp những điều kiện tốt nhất cho tinh trùng [15, 31].
Tùy thuộc vào nồng độ của các ion, hầu hết chúng đều tham gia vào việc kích hoạt
tinh trùng cá hoạt động bằng cách góp phần vào ion nội bào hoặc bằng cách tăng giảm
nồng độ để điều hòa áp suất thm thấu [74, 91]. Sự tương quan giữa các thành phần, nồng
độ các cation và hoạt lực tinh trng đã được nghiên cứu trên nhiều loài khác nhau.
Lahnsteiner và ctv cho rằng có sự tương quan giữa khả năng di chuyển của tinh trùng và
thành phần dịch tương trong tinh dịch cá Alburnus alburnus và gợi ý rằng mối tương
quan này có thể cho biết các thành phần ảnh hưởng tới khả năng di chuyển của tinh trùng.

trong dịch tương cao (từ 20 đến 60 mM), sự có mặt với nồng độ khá cao có
thể liên quan đến sự bất động của tinh trùng trong tinh dịch [55, 86]. Sự vận động của
tinh trng được kích hoạt do sự suy giảm nồng độ K
+
ngoại bào. Tuy nhiên, không ch có
ion K
+
liên quan đến sự kích hoạt khả năng vận động của tinh trùng mà còn có sự tác
động của đến khả năng này [87]. Một số nghiên cứu ch ra rằng các ion hóa trị 2 như Ca
2+

và Mg
2+
trong môi trường thụ tinh có tác dụng là ion đối kháng hay ức chế ion K
+
[21].
Các yếu tố ức chế nồng độ K
+
có thể phụ thuộc vào sự nhạy cảm của tinh trùng với ion
này thay đi giữa con đực và mùa sinh sản [112].
Cơ chế điều chnh vận động của tinh trùng cá tầm và cá thìa Polyodon spathula cho
đến nay vẫn chưa được nghiên cứu sâu nhưng cũng đã được trình bày khá tương đồng với
tinh trùng nhóm cá hồi Salmonids [79]. Nồng độ ion K
+
trong dịch tương cá tầm
Acipenser persicus là 6,92±0,88 mmol/l, với nồng độ này K
+
là chất ức chế chủ yếu khả
năng vận động của tinh trùng cá tầm [22]. Tinh trùng cá chép ít nhạy cảm với ion K
+

từ 30 nM đến 180 nM trước và sau khi
vận động [35].
Ở những loài có thể kích hoạt sự vận động trong môi trường ưu trương không chứa
ion, có thể tăng nồng độ ion Ca
2+
nội bào để kích hoạt tinh trùng vận động hoặc để tạo ra
các đợt kích hoạt bằng cách giải phóng từ các kho dự trữ bên trong cùng với lượng Ca
2+

có trong tinh dịch.
Đối với những loài có thể kích hoạt sự vận động ở môi trường ưu trương không
chứa ion, có thể tăng canxi bên trong tế bào là cần thiết để kích hoạt tinh trùng hoạt động
hoặc để tạo ra các đợt kích hoạt bằng cách giải phóng từ các kho dự trữ bên trong cùng
với lượng canxi có trong tinh dịch. Như vậy có thể thấy rằng nồng độ canxi trong tế bào
đã được cho là thành phần quan trọng trong kích hoạt khả năng vận động của tinh trùng.
Một nghiên cứu khác cũng về nội dung này trên cá tầm Acipenser ruthenus hoạt lực tinh
trng đã hoàn toàn bị ức chế tại 0,35 mM Ca
2+
và tác giả cũng cho biết thêm chính ion K
+

đã gây nên tác dụng ức chế đối với ion Ca
2+
[19, 116].
* Ion Natri:
Na
+
có một vai trò thứ yếu trong việc kích hoạt và duy trì vận động của tinh trùng cá.
Thực tế không có nhiều nghiên cứu được tìm thấy để chứng minh về vai trò kích hoạt vận
động tinh trùng cá của ion này và ch gần đây vai trò của Na

, song trên cá biển vẫn chưa c chứng minh nào cho điều đ.
Sự ức chế khả năng vận động của tinh trùng trong tinh dịch chủ yếu là do ion K
+
trong cá
hồi và áp suất thm thấu trong cá chp nhưng Mg
2+
cũng c phần ảnh hưởng tới tính bất
hoạt của tinh trùng [34].
1.2.5 Cc yếu t nh hưng đến qu trnh bo qun tinh trng c trong nitơ lng
Ngoài các yếu tố trên thì quá trình bảo quản lạnh tinh trng cũng gp phần vào làm
giảm chất lượng tinh trùng sau khi bảo quản [42, 110].
1.2.5.1 Kỹ thuật chọn cá thu mu:
Đây là khâu đầu tiên rất quan trọng vì chất lượng tinh trùng của cá đực có tốt hay
không phụ thuộc vào mức độ thành thục và điều kiện sống của cá đực. Khả năng vận
động của tinh trng chưa thành thục hay quá thành thục đều rất kém so với tinh trng
thành thục vừa. Ngoài ra, việc sử dụng kích dục tố cũng ảnh hưởng đến chất lượng tinh
trùng.
1.2.5.2 Thao tác thu tinh:
Trước khi thutinh, dụng cụ cần được khử trng và để nơi thoáng mát và kiểm tra lại
cá đực. Trước khi thu mẫu phải lau khô phần dọc theo bụng cá. Khi thu mẫu phải hết sức
cn thận và nh nhàng, tránh không để phân cá, máu hay nước tiểulẫn vào tinh dịch, nếu
không tinh trùng d bị kích hoạt dẫn đến thời gian cất giữ ngắn hay không đạt kết quả
mong muồn. Nên lấy tinh dịch vào bui sáng sớm hoặc chiều mát để tinh dịch không bị
biến đi, không nên lấy tinh dưới ánh sáng mặt trời để tránh tinh trùng bị sát thương.
Những ống đựng tinh dịch (eppendorfs tube) nên được để trên khay đá khô, không
nên nắm trong tay bởi nhiệt độ cơ thể cao làm giảm tui thọ tinh trng. Tinh thu xong được
lưu giữ trên đá lạnh và vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm để kiểm tra và xử lý mẫu.
15

1.2.5.3 T l pha long: