BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI NGUYỄN THỊ VÂN
KHẢO SÁT TẬP ðOÀN CÀ CHUA, PHÁT HIỆN GEN
CHÍN CHẬM VÀ KHÁNG VIRUS XOĂN VÀNG LÁ
BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA
LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số : 60 42 80

Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS. PHAN HỮU TÔN


thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn KS. Tống
Văn Hải và toàn thể cán bộ, nhân viên bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ
sinh học ứng dụng, Khoa công nghệ sinh học, ðH Nông nghiệp Hà Nội ñã rất
nhiệt tình giúp ñỡ, tạo ñiều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong thời gian thực
hiện ñề tài tại bộ môn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo
trường ðH nông nghiệp Hà Nội ñã trang bị cho tôi những kiến thức cần thiết
ñể có thể thực hiện ñề tài và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia ñình,
anh em, bạn bè ñã ñộng viên, giúp ñỡ và tạo ñiều kiện cho tôi hoàn thành
luận văn này.
Hà Nội, ngày 15 tháng 9 năm 2012
Tác giả Nguyễn Thị Vân
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

iii

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục chữ viết tắt v
Danh mục bảng vi
Danh mục hình vii
1 MỞ ðẦU 1
1.1 ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục ñích, yêu cầu 3

4.4.2 Kết quả PCR phát hiện gen Ty-2 59
4.4.3 Kết quả PCR phát hiện gen Ty-3 59
4.5 ðề xuất một số mẫu giống cà chua triển vọng 60
5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63
5.1 Kết luận 63
5.2 Kiến nghị 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO 64
PHỤ LỤC 69

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

v

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

- PCR: Polymerase Chain Reaction: Phản ứng chuỗi trùng hợp DNA
- TYLCV: Tomato yellow leaf curl virus
- ACC : 1-aminocylopropane-1-carbonxylic acid.
- Cnr : Colorless non-ripening.
- ETB : Ethidium bromide.
- DNA : Deoxyribonucleotide acid.
- dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate
- EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic
- FAO : Food and Agriculture Organization.
- Gr : Green ripe.
- rin : ripening inhibitor.
- Nor : non-ripening.
- Nr : Never ripen.
- PG : enzyme polygalacturonase.


STT Tên hình Trang

2.1 Sơ ñồ tổng hợp Ethylen theo Chalves & Mello-Farias, 2006 8

2.2 Sơ ñồ phương pháp tạo cà chua chín chậm dựa vào sinh tổng hợp
Ethylen 10

2.3 Sơ ñồ thể hiện cơ chế ñiều hòa, tác ñộng của ethylen 11

2.4 Sự khác biệt về cấu trúc của 5 loại receptor ethylen ở cà chua 12

2.5 Bản ñồ gen rin trên nhiễm sắc thể số 5 của cà chua 14

2.6 Bản ñồ gen của Gr và Nr-2 trên nhiễm sắc thể số 1 của cà chua 15

2.7 Gen Ty-1 nằm trên NST số 6 18

2.8 Vị trí gen Ty-2 trên nhiễm sắc thể số 11 18

2.9 Gen Ty-3 nằm trên NST số 6 20

2.10 Gen Ty-4 nằm trên trên NST số 3 20

2.11 Bản ñồ khoảng cách cM giữa các marker gen Ty-5 trên nhiễm sắc
thể 4 21

4.2 Ảnh ñiện di sản phẩm chạy PCR phát hiện gen chín chậm rin 56

4.3. Ảnh ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen Ty-1 với cặp mồi JB-1 58


biến và công nghiệp ñồ hộp rất cao, giá cà chua lúc này có lúc tăng gấp 2 – 3
lần thời ñiểm chính vụ. Vì thế, ñã có nhiều biện pháp kỹ thuật nhằm rải vụ cà
chua như trồng sớm hoặc muộn, trồng trong nhà lưới và dùng các giống
chống chịu nóng, úng và sâu bệnh. Tuy nhiên do ñiều kiện thời tiết không
thuận lợi nên hầu hết các giống cà chua mới chọn tạo của ta hiện nay chưa
thích ứng tốt và ñem lại hiệu quả kinh tế khi trồng trái vụ.
Hiện nay nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ nhiều nước trên thế
giới như Mỹ, Pháp và Nhật ñã tạo ñược nhiều giống cà chua có tính chín
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

2

chậm hoặc không chín. Những giống cà chua có ñặc tính này quả dù ñạt kích
thước và tích luỹ ñủ chất khô nhưng không chín trên cây do mất khả năng
sinh tổng hợp ethylene - là hoocmon tín hiệu giúp hoạt hoá nhiều enzyme xúc
tiến cho quá trình làm quả chín. Tính chín chậm hoặc không chín ñược xác
ñịnh là do một số gen quy ñịnh như: gen ức chế quá trình chín của quả, ký
hiệu là rin (ripening inhibitor) nằm trên nhiễm sắc thể 5 (Vrebalov và cộng
sự, 2002), gen nor (non-ripening) và gen Nr (Never-ripening) quy ñịnh tính
không chín… Hiện nay người ta ñã tìm thấy một số chỉ thị phân tử DNA ñể
phát hiện và chọn lọc các gen gây nên tính chín chậm này. Quả cà chua chín
chậm có thời gian sử dụng lâu hơn, ñộ cứng cao hơn cà chua thông thường do
ñó ít bị thối dập trong khi vận chuyển, kéo dài ñược thời gian bảo quản cũng
như thời gian sử dụng mà vẫn ñảm bảo chất lượng. Chính vì thế, chọn tạo
giống cà chua có ñặc tính chín chậm là một giải pháp ưu việt nhằm rải vụ
trong nhà mà không cần trồng trái vụ trên ñồng ruộng.
Mặt khác một trở ngại gây ảnh hưởng lớn ñến nền sản xuất cà ở miền
bắc cũng như nhiều nơi trên thế giới gặp phải là sự phá hại nặng của virus,
ñặc biệt ở vụ sớm, muộn và trái vụ. Cho ñến nay, biện pháp sử dụng giống
cà chua kháng virus ñược coi là hướng hiệu quả nhất ñể phòng chống bệnh.

- Khảo sát các ñặc ñiểm sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng
quả của các giống cà chua nhập nội.
- Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA ñể phát hiện gen chín chậm, gen
kháng virus xoăn vàng lá trong tập ñoàn giống cà chua nhập nội.
- Tìm ra một số giống cà chua có triển vọng thích ứng với ñiều kiện thời
tiết khí hậu Việt Nam làm nguồn vật liệu tạo giống mới. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

4

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. ðặc ñiểm giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cà chua
Cà chua là nguồn cung cấp vitamin A và C rất quan trọng, là loại rau ăn
quả ñược sử dụng ở nhiều phương thức khác nhau. Trong quả cà chua chín có
nhiều dinh dưỡng như: ñường, vitamin A, vitamin C và các chất khoáng quan
trọng như Ca, Fe, P, K, Mg… (Tạ Thu Cúc, 2006) [4]. Edward C. Tigchelaar
(1989) ñã phân tích quả cà chua chín và xác ñịnh thành phần hóa học gồm: 94 -
95% nước, 5 - 6% chất khô.
Theo Võ Văn Chi (1997), về mặt y học cà chua có vị ngọt
tính
mát, giải
nhiệt chống hại huyết, kháng khuẩn, lọc máu, nhuận tràng, giúp
tiêu
hoá tốt
tinh bột Nước ép cà chua kích thích gan, tốt cho dạ dày (Nguyễn Thị
Hồng Thuý, 2009) [10]. Một nghiên cứu của Mỹ cho thấy, lycopen trong quả
cà chua giúp giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch. Ngoài ra lycopen ñược ñược

Quả cà chua thuộc loại quả mọng, có 2, 3 ñến nhiều ngăn hạt. Hình dạng
và màu sắc quả phụ thuộc vào từng giống. Khối lượng quả dao ñộng rất lớn
tuỳ theo ñặc ñiểm của giống, từ 3 ñến 200g thậm chí 500g.
2.3. Yêu cầu ñiều kiện ngoại cảnh của cây cà chua
2.3.1. Nhiệt ñộ
Cây cà chua ưa thích khí hậu ấm áp, khả năng thích nghi cao nên nó
ñược trồng ở khắp mọi nơi trên thế giới. Cà chua chịu ñược nhiệt ñộ cao
nhưng rất mẫn cảm với rét. Cây có thể sinh trưởng ñược trong phạm vi nhiệt
ñộ từ 15
o
C – 35
o
C, thích hợp là 22
o
C - 24
o
C [10].
Tỷ lệ ñậu quả ñạt tối ưu ở nhiệt 18 - 20
o
C, nhiệt ñộ cao vào 2 ñến 3
ngày sau khi nở hoa gây cản trở quá trình thụ tinh, auxin không ñược hình
thành làm cho hoa rụng. Quả cà chua phát triển thuận lợi ở nhiệt ñộ thấp,
nhiệt ñộ trên 35
o
C ngăn cản sự phát triển của quả và làm giảm kích thước quả
rõ rệt [10].
Quá trình sinh tổng hợp caroten rất mẫn cảm với nhiệt ñộ, do ñó ảnh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

6

khả năng bảo quản và vận chuyển kém [15].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

7

2.3.4. ðất và dinh dưỡng
Cà chua là cây trồng thích nghi rộng, không kén ñất nên có thể trồng ở
nhiều loại ñất khác nhau (Bộ Nông Nghiệp và PTNT, 2001) [2]. ðất phù hợp
với cây cà chua là ñất thịt nhẹ, ñất cát pha, tơi xốp, tưới tiêu dễ dàng.
Theo Figueira (1972) cho rằng, cây cà chua ñược trồng trong các ñiều
kiện sinh thái khác nhau, nền ñất khác nhau nhưng lượng các chất N, P, K mà
cây lấy ñi theo xu hướng chung là K >N>P [3]. Theo Becseev, ñể tạo 1 tấn
quả cà chua cần 3,8 kg N, 0,6 kg P
2
O
5
và K
2
O (Kiều Thị Thư, 1998) [11].
Ngoài những nguyên tố khoáng cần thiết là ñạm, lân và kali thì với cây cà
chua các nguyên tố vi lượng có vai trò quan trọng ñối với sự phát triển của cây,
ñặc biệt góp phần cải tiến chất lượng quả. Cà chua phản ứng tốt ñối với các
nguyên tố vi lượng B, Mn, Zn, Mo [15]. Khi thiếu các yếu tố vi lượng cây sinh
trưởng chậm, dễ nhiễm bệnh, rụng hoa, quả non làm giảm năng suất [10].
2.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu cà chua chín chậm
2.4.1. Ethylene và cơ chế chín của quả
Ethylene là một phytohormon quan trọng trong cây, nó ñiều chỉnh
nhiều quá trình sinh trưởng và phát triển của cây. Ethylene ñược tổng hợp
trong tất cả các tế bào và các mô nhưng nhiều nhất là các mô già và ñặc biệt
là trong quả ñang chín.

một vi khuẩn ñất (Pseudomonas chlororaphis) không gây bệnh. Vi khuẩn này có
khả năng chuyển hóa ACC thành một phân tử khác, nhờ vậy làm giảm lượng
ACC có thể nhận ñược ñể tạo ethylen ( Klee et al, 2002) [30].
3. Chuyển gen SAM hydrolase. Phương pháp này làm giảm tiền chất của
ethylen. Ở ñây SAM ñược chuyển hóa thành homoserine. Gene mã hóa cho
enzym này ñược phân lập từ thể thực khuẩn E. coli T3 [30].
4. Ức chế biểu hiện của gen ACC oxidase - enzyme xúc tác cho sự oxi
hóa ACC thành ethylene.Thông qua công nghệ antisense, giảm sự ñiều khiển
gene ACC oxidase dẫn ñến ức chế sự hình thành ethylen, do ñó làm làm chậm
sự chín của quả [30].
5. ðiều khiển việc nhận ethylen: Khi ethylen có tín hiệu bắt ñầu cho việc
chín quả, việc làm chậm quá trình chín có thể ñạt ñược bằng cách biến ñổi
thụ thể của ethylen. Gen ETR1 là một ví dụ, nó mã hóa cho protein liên kết
ethylen. Gen này ñược biến ñổi thì mất khả năng phản ứng với ethylen
(Wilkinson et al., 1995) [38].
6. Ức chế hoạt tính của polygalacturonase: enzym polygalacturonase
(PG) chịu trách nhiệm cho việc phân giải pectin, chất duy trì ñộ cứng thành tế
bào thực vật. ðể tạo ra quả chín chậm bằng phương pháp này, người ta ñã
chuyển gene antisense hoặc một ñoạn bản sao của gene PG vào trong genome
của thực vật dẫn ñến sự ức chế tạo ra enzym PG (Redenbaugh & Kramer
1994) [37]. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

10


Hình 2.3. Sơ ñồ thể hiện cơ chế ñiều hòa, tác ñộng của ethylen
(Bleecker và Kende, 2000) [17]
Các nghiên cứu trên cà chua cho thấy có ít nhất 6 loại receptor:
LeETR1, LeETR2 (Zhou et al., 1996; Lashbrook et al., 1998), NR (LeETR3)
(Wilkinson et al., 1995; Payton et al., 1996), LeERT4, LeETR5 (Tieman and
Klee, 1999) [38], và LeETR6 (Ciardi and Klee, 2000) [19]. Sự biểu hiện của
các receptor này phụ thuộc vào từng giai ñoạn sinh trưởng, phát triển, phụ
thuộc vào sự tác ñộng từ môi trường [36].
+ LeETR1 và leETR2: Biểu hiện ở tất cả các loại mô ñã bước sang giai
ñoạn phát triển.
+ NR: Có liên quan ñến giai ñoạn trước hạt phấn.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

12
+ NR và LeETR4: Liên quan ñến giai ñoạn trước chín, già hóa,sự rụng
(Payton et al,1996), sự xâm nhiễm của nguồn bệnh [19].
+ LeETR5: Biểu hiện trong quả, hoa khi có sự xâm nhiễm của nguồn
bệnh [38].

Hình 2.4. Sự khác biệt về cấu trúc của 5 loại receptor ethylen ở cà chua
(Tieman và Klee, 1999) [38]

2.4.2. Các dạng ñột biến liên quan ñến sự chín ở cà chua
Khi quả cà chua chín có sự biến ñổi hóa sinh rất mạnh mẽ và nhanh
chóng gắn liền với những thay ñổi về màu sắc, ñộ mềm và hương vị. Theo
nghiên cứu của nhiều tác giả thì các dạng ñột biến liên quan ñến sự chín ở cà
chua có thể chia thành 2 dạng chính: các ñột biến liên quan ñến sự tổng hợp
tăng cường của ethylene trong quá trình chín và các ñột biến liên quan ñến
khả năng phục hồi biểu hiện của các gen liên quan ñến sự chín của ethylene
(sự cảm ứng của ethylene tới các gen biểu hiện khi chín) (Adams-Phillips et

chín và ñiều khiển sự phát triển của ñài hoa. Từ ñó thiết kế ñược các cặp mồi
phát hiện các gene này dựa vào phương pháp PCR.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

14Hình 2.5. Bản ñồ gen rin trên nhiễm sắc thể số 5 của cà chua [20]
* Dạng ñột biến Never ripe (Nr):
Dạng ñột biến này ñược phát hiện từ rất sớm bởi Rick & Butler,1956.
ðây là một dạng ñột biến bán trội xảy ra tại 1trong các receptor cảm ứng với
ethylene [38]. Dạng ñột biến Nr này ñã ñược sử dụng trong nhiều nghiên cứu
về vai trò của ethylene trong các giai ñoạn phát triển khác nhau như: (Aloni
et al., 1998) [13] nghiên cứu biểu hiện của gene; khả năng kháng stress [19].
Quả cà chua ñột biến không chín hoàn toàn ngay cả khi xử lí bởi ethylene
ngoại sinh.
* Dạng ñột biến: Never-ripe-2 (Nr-2) và Green ripe (Gr)
Các nghiên cứu ñã chỉ ra rằng dạng ñột biến Nr-2 có trình tự gen mã hóa
không tương ñồng với ñột biến Nr. ðột biến Nr-2 ñược chỉ ra là do gen Nr-2,
nằm trên vùng cánh dài của NST số 1 (Giovannoni và cộng sự năm 2005) [21].
Nghiên cứu sự di truyền của 2 dạng ñột biến Gr và Nr-2 cho thấy ñây là 2
dạng ñột biến trội. Khi lập bản ñồ di truyền của 2 dạng ñột biến cho thấy gen
qui ñịnh dạng ñột biến này nằm trên 1 vùng 2cM giữa 2 chỉ thị TG260 và
TG245 trên cánh dài của NST số 1 [16].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

15Hình 2.6. Bản ñồ gene của Gr và Nr-2 trên nhiễm sắc thể

vàng ngọn cà chua là Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV); Tomato
yellow leaf curlKanchanaburi (TYLCKaV) vàTomato yellow leaf curl
Vietnam virus (TYLCVNV) [23].
2.5.2. Nghiên cứu về các nguồn gen kháng virus xoăn vàng lá
Loài cà chua trồng (Solanum lycopersicum) cực kỳ mẫn cảm với virus
xoăn vàng lá (Tomato yellow leaf curl virus – TYLCV). Tuy nhiên, mức ñộ
kháng cao với TYLCV ñã ñược tìm thấy trong các loài cà chua dại S.
pimpinellifolium, S. peruvianum, S. chilense, S. habrochaites, và S.
cheesmaniae. Một vài accession của và S. pimpinellifolium cũng biểu hiện
mức ñộ chống chịu tốt với TYLCV (Ji và cộng sự, 2007a) [24]. Trong các
loài cà chua dại biểu hiện tính kháng với TYLCV, S. chilense, S.
habrochaites, và S. peruvianum cung cấp khả năng kháng tốt và ñã ñược sử
dụng rộng rãi trong chương trình tạo giống ñể phát triển các giống cà chua
thương mại kháng TYLCV [24], [34].
Tiếp ñó, các dòng giống với khả năng kháng cao như TY172, TY197…
ñã ñược phát triển tại Trung tâm Volcani ở Israel từ loài S. Peruvianum [24].
Tính kháng trong TY172 ñược ñiều khiển bởi một QLT (Quantitative Trait
Locus)lớn và bốn QLT nhỏ, QLT lớn ñược ñặt tên là Ty-5, nằm trên nhiễm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………

17
sắc thể số 4 (Anbinder và cộng sự, 2009) [14]. Các accession LA372, LA452,
LA462, LA1274, LA1333, LA1373, và CMV sel INRA (PI126926 ×
PI128648-6), cũng như S. peruvianumvar. humifusum LA385 ñã ñược phát
hiện là có khả năng kháng cao với TYLCV. Các gen từ S. peruvianum ñã
nhanh chóng ñược ñưa vào các giống lai thương mại tên tuổi và cung cấp khả
năng kháng tốt với TYLCV [24].
S. chilense là nguồn gen kháng rất quan trọng trong nhiều chương trình
tạo giống trên thế giới. Năm 1991, Zakay và cộng sự ñã báo cáo khả năng
kháng cao với TYLCV trong các cá thể LA1969 [25]. Năm 1994, Zamir và